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【關(guān)鍵詞】人類乳頭狀瘤病毒,人；腺病毒科

ConstructionandidentificationofrecombinantadenovirusescarryingHPV16e6e7

【Abstract】AIM:Toconstructthereplicationdeficientrecombinantadenovirusescarryinghumanpapillomavirus16（HPV16）E6E7andidentifythevectorwithWesternBlot.METHODS:TheHPV16E6E7genefragmentwasobtainedfromtheplasmidpET32a（+）E6E7byamplificationanddigestion,andtheshuttleplasmidpAdTrackCMVE6E7inwhichtheE6E7wasinsertedintothedownstreamofCMVpromoterwasestablishedbyligation.ThenthelinearizedshuttleplasmidwascotransformedintoBJ5183bacteriawithbackbonevectorAdEasy1toobtaintherecombinantadenoviralplasmidpAdE6E7byhomologousrecombination.TherecombinedadenovirusDNAwastransfectedinto293cellsforpackingandtheamplificationproductofreplicationdeficientAdE6E7viruswaspurifiedbyCsCldensitygradientcentrifugation.TheexpressionofE6E7wasverifiedbyWesternBlotin293cellafterinfectedwithAdE6E7.RESULTS:TherecombinantplasmidpAdE6E7wasestablishedbyhomologousrecombinationandconfirmedbyrestrictionendonucleasedigestionandsequencing.GFPexpressioncouldbeobserved3dafterpackingofthelinearizedpAdE6E7in293cellsand6.9×1010pfu/LtiterofAdE6E7wasobtainedbyCsClgradientpurification.The293cellwasinfectedwiththistiterofAdE6E7viruses,andthentotalproteinin293cellswasextracted.WesternBlotshowedthatE6E7proteinwasexpressedobviously.CONCLUSION:AdE6E7expressingbothGFPandE6E7simultaneouslycanbesimplyandrapidlygeneratedbyusingtheAdEasysystem.

【Keywords】papillomavirus,human;adenoviridae

【摘要】目的：利用AdEasy系統(tǒng)構(gòu)建人乳頭瘤16(HPV16)E6E7基因重組腺病毒，并通過(guò)WesternBlot方法檢測(cè)E6E7蛋白的表達(dá).方法：將質(zhì)粒pET32a（+）E6E7擴(kuò)增、酶切獲得E6E7片段插入腺病毒穿梭載體質(zhì)粒pAdTrackCMV的巨細(xì)胞病毒（CMV）啟動(dòng)子下游，構(gòu)建重組穿梭載體pAdTrackCMVE6E7，線性化后與骨架載體AdEasy1在細(xì)菌BJ5183內(nèi)同源重組得到腺病毒質(zhì)粒pAdE6E7，經(jīng)人胚腎293細(xì)胞包裝后得到復(fù)制缺陷型重組腺病毒AdE6E7；用包裝后的病毒上清再次感染293細(xì)胞，提取細(xì)胞中的蛋白，通過(guò)WesternBlot方法檢測(cè)E6E7蛋白的表達(dá).結(jié)果：連接、重組后通過(guò)酶切和測(cè)序法篩選出pAdE6E7；經(jīng)人胚腎293細(xì)胞包裝，3d后觀察到綠色熒光蛋白（GFP）明顯表達(dá)，氯化銫梯度離心純化最終獲得6.9×1010pfu/L滴度的重組病毒；用該滴度的AdE6E7重新感染人胚腎293細(xì)胞3d后，提取細(xì)胞蛋白,WesternBlot檢測(cè),E6E7有明顯表達(dá).結(jié)論：利用新型腺病毒載體AdEasy系統(tǒng)可在短期內(nèi)制備同時(shí)表達(dá)GFP和E6E7的重組腺病毒AdE6E7.

【關(guān)鍵詞】人類乳頭狀瘤病毒，人；腺病毒科

0引言

高危型人類乳頭瘤狀病毒（HPV16,18）與宮頸癌的發(fā)病密切相關(guān)［1］.HPV編碼了多種癌蛋白（E1,E5,E6,E7等）其中以E6,E7為主，他們都能誘導(dǎo)細(xì)胞永生化，引起細(xì)胞的永生.復(fù)制缺陷型重組腺病毒(replicationdeficientrecombinantadenovirus)是目前基因治療最常用的載體之一［2］，我們利用AdEasy系統(tǒng)構(gòu)建了外源插入HPV16E6E7片段的復(fù)制缺陷性腺病毒AdE6E7，并觀察了AdE6E7感染293細(xì)胞，為研究HPV16E6E7在女性宮頸癌中的作用提供新的手段.

1材料和方法

1.1材料穿梭質(zhì)粒pAdTrackCMV，骨架質(zhì)粒pAdEasy1，僅插入GFP的對(duì)照重組腺病毒質(zhì)粒pAdGFP，大腸桿菌BJ5183由重慶醫(yī)科大學(xué)肝病研究所惠贈(zèng)；293細(xì)胞、E.coli,DH5a由本實(shí)驗(yàn)室保存.pET32a（+）E6E7載體已構(gòu)建成功.PmeⅠ,PacⅠ限制性內(nèi)切酶購(gòu)自基因公司；BglⅡ,HindⅢ限制性內(nèi)切酶、連接試劑盒、DNA小量膠回收純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品；LipofectaminTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自Roche公司，DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清購(gòu)自Hyclon公司；蛋白Marker購(gòu)自Tiangene公司；驢抗鼠的E6單克隆抗體購(gòu)自SantaCruz公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠的E6二抗及DAB顯色系統(tǒng)購(gòu)自北京中山公司.

1.2方法BglⅡ和HindⅢ分別雙酶切腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrackCMV和pET32a（+）E6E7，凝膠回收E6E7片段和線性化的pAdTrackCMV，連接（16℃,8h），轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)菌，在卡那酶素抗性的LB平板上培養(yǎng)過(guò)夜，挑選轉(zhuǎn)化的菌落，提取質(zhì)粒，BglⅡ和HindⅢ雙酶切鑒定陽(yáng)性克隆，同時(shí)送上海生物工程公司測(cè)序分析.提取pAdtrackCMVE6E7質(zhì)粒，取1μg用PmeⅠ線性化，膠回收線性化的pAdtrackCMVE6E7質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到含有腺病毒基因組質(zhì)粒AdEasy的BJ5183感受態(tài)細(xì)胞中［3］，在卡那酶素抗性的LB平板上培養(yǎng)16～24h，挑選較小的菌落培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳初篩重組體，再用PacⅠ酶切鑒定.PacⅠ線性化AdE6E7，乙醇、醋酸鈉沉淀，700mL/L乙醇漂洗后重新溶解在20μL滅菌的去離子水中.配制A液（質(zhì)粒DNA4μg+無(wú)血清DMEM至250μL）和B液（10μLLipofectaminTM2000以無(wú)血清DMEM稀釋至250μL），A，B混合，37℃反應(yīng)2h.PBS漂洗細(xì)胞后每孔加入2mL無(wú)血清培養(yǎng)液，將混合物輕傾于培養(yǎng)孔中輕輕混合，繼續(xù)培養(yǎng)8h后更新完全培養(yǎng)基，直至90%以上293細(xì)胞出現(xiàn)病變（cytopathiceffect,CPE）.收集上清繼續(xù)感染293細(xì)胞以擴(kuò)增病毒.用氯化銫密度梯度離心法純化重組重組腺病毒AdE6E7.收集后的病毒層，0.22μm無(wú)菌過(guò)濾后小份分裝，-80℃保存.Trizol試劑提取重組腺病毒感染293細(xì)胞和未感染293細(xì)胞的RNA取1μg細(xì)胞總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，總反應(yīng)體積為50μL,37℃反應(yīng)1h,95℃5min，滅活逆轉(zhuǎn)錄酶.PCR擴(kuò)增E6E7片段的上游引物PF:5＇cgggatccatggaaaccggttagtataaa3＇，下游引物PR:5＇cgggatcccatggtagattatggtt3＇.反應(yīng)條件：95℃變性5min,95℃30s,58℃30s,72℃1min，30個(gè)循環(huán)，72°C延伸10min.RIPA提取AdE6E7感染293細(xì)胞和未感染293細(xì)胞的總蛋白，變性后做SDSPAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，條件為6V恒壓，3.5h.驢抗羊的E6單抗、HRP標(biāo)記的二抗，雜交反應(yīng)后DAB顯色.根據(jù)文獻(xiàn)［3］用已獲得的重組腺病毒感染HEK293細(xì)胞，得到擴(kuò)增的病毒粗提液，將病毒粗提液進(jìn)行對(duì)數(shù)稀釋，通過(guò)終點(diǎn)稀釋試驗(yàn)計(jì)算病毒滴度.終點(diǎn)稀釋實(shí)驗(yàn)中滴度計(jì)算公式：病毒滴度（pfu/L）=104（x+0.8），x為各行陽(yáng)性率總和.

2結(jié)果

2.1腺病毒穿梭載體pAdtrackCMVE6E7的構(gòu)建和鑒定用BglⅡ和HindⅢ分別雙酶切腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrackCMV,pET32a（+）E6E7和pAdtrackCMVE6E7質(zhì)粒（圖1），可以獲得860bp的E6E7基因和8.9kb的pAdTrackCMV.

1:Marker:λHindⅢ;2:pAdTrackCMV/BglⅡ,HindⅢ;3:pET32E6E7/BglⅡ,HindⅢ;4:pAdTrackCMVE6E7/BglⅡ,HindⅢ;5:Marker:2000.

圖1腺病毒穿梭載體pAdtrackCMVE6E7鑒定（略）

2.2E6E7重組腺病毒基因組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定同時(shí)將pAdtrackCMVE6E7質(zhì)粒和pAdtrackCMV空質(zhì)粒用PmeⅠ線性化后，轉(zhuǎn)化到含有AdEasy1的BJ5183感受態(tài)細(xì)菌中，與其內(nèi)的AdEasy1進(jìn)行同源重組.PacⅠ酶切后，可見(jiàn)4.5kb和23kb處各有1個(gè)條帶（圖2）.

1.3AdEasyE6E7重組腺病毒感染293細(xì)胞的鑒定脂質(zhì)體包裹AdEasyE6E7同源重組腺病毒基因組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293包裝細(xì)胞1~2d后，光鏡下可觀察到空斑形成，細(xì)胞變圓、腫脹、脫壁、細(xì)胞核變大等病變.熒光顯微鏡下觀察，重組腺病毒感染的293細(xì)胞和pAdtrackCMV感染的293細(xì)胞，在培養(yǎng)1～2d后有EGFP表達(dá)，并逐漸增多.AdEasyE6E7重組腺病毒感染的293細(xì)胞，RTPCR檢測(cè)顯示有1條860bp條帶，而pAdtrackCMV空載體感染的293細(xì)胞的相應(yīng)位置無(wú)特異條帶（圖3）.AdEasyE6E7重組腺病毒感染的293細(xì)胞，用WesternBlot檢測(cè)顯示有1條能與E6單抗特異性結(jié)合的蛋白印跡條帶，而pAdtrackCMV空載體重組后的腺病毒AdEasyCMV感染的293細(xì)胞的相應(yīng)位置無(wú)特異條帶（圖4）.經(jīng)終點(diǎn)稀釋實(shí)驗(yàn)測(cè)定得到重組復(fù)制缺陷型病毒滴度為6.9×1010pfu/L.

1:Marker:λHindⅢ;2:pAdTrackk14E6E7/BamHⅠ;3:重組后的pAdTrackCMVE6E7/PacⅠ;4:重組后的pAdTrackCMV.

圖2PacⅠ酶切鑒定AdEasyE6E7（略）

1:Marker:100bpDNAMarker;2:RTPCR產(chǎn)物:E6E7基因（860bp）;3:RTPCR陰性對(duì)照.

圖3RTPCR鑒定AdEasyE6E7轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞中E6E7的表達(dá)（略）

1:E6E7;2:NOE6E7.

圖4WesternBlot鑒定AdEasyE6E7/AdEasyCMV（略）

3討論

目前基因治療中應(yīng)用最廣泛的生物病毒載體有反轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體和單純皰疹病毒載體，其中腺病毒的優(yōu)于其他載體的特點(diǎn)［4-5］.腺病毒載體可轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂細(xì)胞，并在細(xì)胞培養(yǎng)物中有高滴度的重組病毒產(chǎn)量，最后腺病毒載體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并不整合到宿主細(xì)胞基因組，僅瞬間表達(dá)，因而安全性較高.已被美國(guó)FDA批準(zhǔn)作為基因治療載體應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn).

我們先將AdEasy1骨架載體轉(zhuǎn)化到用CaCl2制備的BJ5183感受態(tài)中，然后再將線性化的pAdtrackCMVE6E7轉(zhuǎn)化進(jìn)含有AdEasy1的BJ5183制成感受態(tài)，同源重組［6-7］.已轉(zhuǎn)化了AdEasy1質(zhì)粒的BJ5183細(xì)胞更方便進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)同源重組，免去了在真核細(xì)胞內(nèi)重組篩選復(fù)雜、費(fèi)時(shí)的缺點(diǎn).為了驗(yàn)證重組腺病毒是否帶有目的基因E6E7，進(jìn)行了如下鑒定：對(duì)pAdtrackCMVE6E7質(zhì)粒酶切和測(cè)序，結(jié)果證明目的基因E6E7正確插入到穿梭載體；pAdtrackCMVE6E7經(jīng)PacⅠ酶切后，可見(jiàn)4.5kb和23kb兩條帶，說(shuō)明重組成功；構(gòu)建腺病毒載體的穿梭質(zhì)粒pAdtrackCMV中的構(gòu)建元件已插入EGFP表達(dá)盒，重組腺病毒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后，通過(guò)熒光顯微鏡觀察，可見(jiàn)293細(xì)胞有綠色熒光蛋白表達(dá)，并逐漸出現(xiàn)生長(zhǎng)停止和空斑形成，證明AdEasyE6E7已包裝入293細(xì)胞；通過(guò)RTPCR和Westernblot方法證明了AdEasyE6E7轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后有E6E7核酸和蛋白的表達(dá).這個(gè)載體的構(gòu)建對(duì)于進(jìn)一步研究HPV16E6E7體內(nèi)、體外基因治療實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ).

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