導(dǎo)語：聚合物合金法制及性能一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

本文作者：劉華蔚溫偉生孫華燕鄭愛萍胡敏陳麗潔工作單位：解放軍總醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)研究所

傳統(tǒng)復(fù)乳法及聚合物合金法制備NGF緩釋微球:(1)傳統(tǒng)復(fù)乳法:采用復(fù)乳-溶劑揮發(fā)法(W/O/W)制備緩釋微球，300μg的NGF和10mg牛血清白蛋白(BSA)溶于100μl的去離子水中得內(nèi)水相(W1);PL-GA300mg溶于2ml的二氯甲烷(CH2Cl2)溶液中形成油相(O)，外水相為2%聚乙烯醇溶液10ml(W2)。將W1倒入O中，冰浴超聲處理30s得到初乳(W1/O)，將初乳倒入W2中，冰浴下高速勻漿30s，得到(W1/O/W2)復(fù)乳。將復(fù)乳倒入400ml10%的去離子水氯化鈉溶液中，室溫下磁力攪拌機(jī)(上海雷磁)，1700r/min攪拌2h，前30min冰浴，后1.5h常溫下攪拌，再800r/min攪拌2h揮發(fā)殘余有機(jī)溶劑，收集微球，去離子水洗滌3次，真空凍干，得微球205.8mg，置于4℃保存。(2)聚合物合金法:采用乳化-溶劑揮發(fā)法(S/O/W)與聚合物合金法結(jié)合制備微球，分為兩步。①NGF微粉化。經(jīng)純化的NGF溶液300μg，與牛血清白蛋白溶液0.5ml(含BSA10mg)混合后進(jìn)行凍干處理，預(yù)凍溫度－50℃，降溫速度20℃/min，凍干條件(－20℃，3h;20℃，12h)?；旌衔飪龈珊蟮玫骄鶆蚍稚⒃贐SA基質(zhì)中的NGF藥粉(S)。②NGF微囊化。PLA/PLGA(PLA∶PLGA=1∶3)300mg置于試管內(nèi)，加入所制NGF凍干粉，加入2ml的CH2Cl2使聚合物溶解形成油相(O)。水相為2%聚乙烯醇溶液10ml(W)。將W加入O中，高速勻漿30s，形成S/O/W乳液，復(fù)乳倒入400ml10%的去離子水氯化鈉溶液中，室溫下磁力攪拌，方法同上，得微球256.7mg，置于4℃保存。2．微球形態(tài)及粒徑的檢測(cè):取少量NGF-PLGA緩釋微球放置于貼有雙面膠的金屬板上，噴金制成掃描電鏡標(biāo)本，掃描電鏡下觀察其外形。取少量NGF緩釋微球溶解于去離子水，在光學(xué)顯微鏡下用測(cè)微尺測(cè)定200個(gè)微球的粒徑，每隔5μm粒徑為一單元，分別計(jì)數(shù)每一單元的微球數(shù)。以微球個(gè)數(shù)的百分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)(%)、粒徑大小為橫坐標(biāo)(μm)，繪制微球粒徑分布的直方圖，測(cè)定微球的平均直徑及粒徑分布。3．微球包封率的測(cè)定:(1)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線將NGF-ELISA檢測(cè)試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為10、20、40、80、160、320pg/ml的NGF溶液，以不含NGF的空白微球降解液作為空白對(duì)照，將酶標(biāo)儀吸光度調(diào)零，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(2)萃取法提取微球中的NGF:分別取10mgNGF緩釋微球溶于0.5ml的乙酸乙酯中，然后加入2ml的去離子水，在振蕩器上充分混勻，萃取乙酸乙酯中的NGF，靜置，分取水層，重復(fù)3次。合并三次提取液，混勻。(3)微球萃取率的測(cè)定:取10mg不含NGF的微球和標(biāo)準(zhǔn)品NGF1μg溶于0.5ml的乙酸乙酯中，然后加入2ml的去離子水，在振蕩器上充分混勻，萃取乙酸乙酯中的NGF，靜置，分取水層，重復(fù)3次，合并三次提取液，混勻。用ELISA法在450nm波長下測(cè)定所得溶液的吸光度值，計(jì)算NGF含量，算得萃取率。(4)微球包封率的測(cè)定:將步驟(2)中萃取液稀釋，用ELISA法(檢測(cè)范圍10～400ng/L)在450nm波長下測(cè)定所得NGF溶液的吸光度，以空白微球降解液作為空白對(duì)照。計(jì)算微球中NGF的含量，嚴(yán)格按照說明書操作。微球包封率按以下公式計(jì)算:微球中測(cè)定的NGF量=微球質(zhì)量×(4)中測(cè)得微球中NGF濃度;微球中理論NGF量=投入的NGF的質(zhì)量;微球包封率(%)=微球中測(cè)定的NGF量/微球中理論NGF量×100%。4．微球的體外釋放:準(zhǔn)確稱取兩種微球各3份，50mg微球分別溶于5ml磷酸鹽緩沖液(PBS)中(pH7.4)，37℃震蕩溫浴，分別在6h、12h、1d、4d、7d、14d、21d、30d、40d、50d、60d、70d、80d、90d取出全部稀釋液(2000r/min，2min)，并補(bǔ)充相應(yīng)的緩沖液，取出液－20℃保存，每個(gè)樣品按1∶100和1∶1000稀釋，每個(gè)濃度的稀釋樣品做雙復(fù)孔，ELISA測(cè)定NGF濃度，計(jì)算每次釋藥量及累積釋藥率，并繪制釋放曲線。5．微球中NGF活性的檢測(cè)［6-7］:分別于1d、7d、30d、60d、90d時(shí)取微球釋放液，通過對(duì)PC12細(xì)胞突起的計(jì)數(shù)來檢測(cè)NGF的活性。將生長良好的PC12細(xì)胞接種于預(yù)先經(jīng)鼠尾膠原包被的6孔培養(yǎng)板中，接種密度為2×104/cm2，每孔加入2ml含體積分?jǐn)?shù)為10%馬血清和體積分?jǐn)?shù)為5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)3h后隨機(jī)分組，分為NGF組(陽性對(duì)照組)、不含NGF的牛血清白蛋白微球組(陰性對(duì)照組)、傳統(tǒng)復(fù)乳法制備的NGF微球組(復(fù)乳法組)、合金法制備的NGF微球組(合金法組)。分別以50ng/ml的NGF、牛血清白蛋白微球的緩釋液、傳統(tǒng)復(fù)乳法所制備NGF微球的緩釋液、合金法制備的NGF微球緩釋液各2ml替換原細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，在倒置顯微鏡上用隨機(jī)選取視野，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，并計(jì)算每組中長出軸突的細(xì)胞(陽性細(xì)胞)比例，陽性細(xì)胞比例(%)=陽性細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x珋±s)表示，采用CHISS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行均數(shù)t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果一、NGF緩釋微球表觀形態(tài)觀察結(jié)果光鏡、掃描電鏡結(jié)果顯示兩種方法制備的NGF微球均具有光滑的表面且形態(tài)規(guī)整均勻，近似圓形，大小相近，體外PBS中釋放90d后其表面存在大量孔隙，部分降解，見圖1，2。二、微球粒徑測(cè)定結(jié)果兩種方法制備的微球粒徑分布經(jīng)CHISS軟件正態(tài)性檢驗(yàn)均符合正態(tài)分布，傳統(tǒng)復(fù)乳法組平均粒徑(24.68μm)，合金法組平均粒徑(22.47μm)，傳統(tǒng)復(fù)乳法組制備微球粒徑較合金法略小，見圖3。三、微球產(chǎn)率、包封率測(cè)定結(jié)果實(shí)驗(yàn)測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0063x+0.0015，萃取法回收率為(67.6±4.6)%。微球產(chǎn)率=制得微球質(zhì)量/(BSA質(zhì)量+NGF+共聚物質(zhì)量)，傳統(tǒng)復(fù)乳法制備的微球產(chǎn)率為66.3%，包封率為(23.7±2.1)%;合金法組制備微球產(chǎn)率為82.7%。包封率為(49.5±3.4)%，可見合金法組制備微球產(chǎn)率、包封率均明顯高于傳統(tǒng)復(fù)乳法。四、微球的體外釋放結(jié)果傳統(tǒng)復(fù)乳法與合金法在第90天時(shí)，累積釋放率分別為達(dá)到(78.6±2.0)%、(91.2±2.2)%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。傳統(tǒng)復(fù)乳法存在著顯著突釋效應(yīng)，24h時(shí)釋放率為(22.3±1.6)%，合金法突釋效應(yīng)較小，24h時(shí)釋放率為(8.8±0.7)%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。微球體外釋放曲線見圖4。五、微球中NGF活性的檢測(cè)結(jié)果第1、7、30、60、90天的微球緩釋液被用來作為體外NGF活性的檢測(cè)。PC12細(xì)胞能在NGF的刺激下發(fā)出突起分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，見圖5。因此可通過計(jì)算陽性PC12細(xì)胞的比例來考察NGF的活性［8］。見表2。由表2可知，陽性對(duì)照、復(fù)乳法、合金法組在1d、7d、30d、60d時(shí)組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;90d時(shí)復(fù)乳法與合金法組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，陰性對(duì)照組與復(fù)乳法組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明60d時(shí)復(fù)乳法組、合金法組均可分泌活性的NGF，90d時(shí)合金法組仍可分泌活性的NGF，復(fù)乳法組無活性NGF分泌。討論隨著生物學(xué)等相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，蛋白質(zhì)類藥物的臨床應(yīng)用日益廣泛，目前的主要應(yīng)用劑型是凍干粉針劑，由于蛋白質(zhì)的半衰期較短，注射頻繁，令很多患者難以接受。緩控釋劑型的發(fā)展為蛋白質(zhì)類藥物提供了劑型改進(jìn)方向，緩釋微球制劑可較長時(shí)間持續(xù)釋放藥物，克服了蛋白質(zhì)類藥物半衰期短，頻繁給藥的缺點(diǎn)。近年來，微球制劑的研究發(fā)展迅速，它是利用高分子材料包封藥物形成球狀實(shí)體，通過高分子材料的緩慢降解而逐步釋放藥物，從而達(dá)到緩釋的目的。溶劑揮發(fā)法是最常用的蛋白質(zhì)類微球制備方法，對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求較低，成球性較好，尤其適合少量微球的制備，成為我們微球制備的首選方法。但其制備過程中有諸多因素對(duì)微球的相關(guān)性狀有著顯著的影響，特別是超聲及機(jī)械攪拌過程中產(chǎn)生的剪切力會(huì)嚴(yán)重影響生物大分子藥物的生物活性，從而使得多肽蛋白質(zhì)類藥物極易在微球內(nèi)部聚集形成不溶性沉淀而影響藥物的釋放［9］。本實(shí)驗(yàn)采用傳統(tǒng)復(fù)乳法及聚合物合金法制備微球。從聚合物專業(yè)角度進(jìn)行定義，“聚合物合金技術(shù)”(polymer-alloystechnique)系指一種聚合物相分散在另一種聚合物相中形成固態(tài)混合物的技術(shù)。研究發(fā)現(xiàn)，在特定條件下，兩種聚合物在有機(jī)溶劑中能自動(dòng)分離成兩種溶液。以PLA和PLGA為例，它們?cè)贑H2Cl2中可生成富含PLA相和富含PLGA相。如PLGA與PLA重量比介于1∶2～1∶4時(shí)，會(huì)產(chǎn)生分散相中富含PLGA，連續(xù)相中富含PLA的現(xiàn)象。如將藥物與PLGA混合，則乳劑中的分散相往往由藥物和PLGA組成，連續(xù)相仍富含PLA。上述兩種聚合物經(jīng)溶劑揮發(fā)法制得的微球，藥物基本都在微球的中心部位，外周囊壁主要成分為PLA。Morita等［10］利用聚合物合金法制備牛重組超氧化物歧化酶(bSOD)微球，采用聚乙二醇作為蛋白質(zhì)保護(hù)劑，結(jié)果當(dāng)PLGA和PLA(重量比1∶4)時(shí)，制成微球包封率為87.6%，以接近0級(jí)的速率控釋藥物達(dá)4周之久，突釋作用僅1.4%，生物活性保存率高達(dá)113.1%。藥物的體外釋放一般符合三段模式:爆發(fā)釋放，低速率的釋放，最后是較高速率的釋放。藥物從微囊中釋放出來是藥物擴(kuò)散與微囊降解的結(jié)合，在聚合物降解過程的不同階段，上述兩種機(jī)制分別占主導(dǎo)作用。微囊表面的藥物和尚未包于囊內(nèi)的藥物晶體釋放形成突釋效應(yīng)，眾多學(xué)者嘗試改進(jìn)制作工藝以降低藥物突釋率［11］。

本實(shí)驗(yàn)采用傳統(tǒng)復(fù)乳法及聚合物合金法制備的微球均未出現(xiàn)上述的三段模式，所以無雙峰現(xiàn)象出現(xiàn)，只表現(xiàn)為最初的突釋和繼之而來的相對(duì)穩(wěn)定的釋放。在體外釋放的實(shí)驗(yàn)中，傳統(tǒng)復(fù)乳法及聚合物合金法24h藥物的釋放率分別為22.3%和8.8%，均存在藥物突釋現(xiàn)象，但聚合物合金法藥物突釋效應(yīng)明顯較傳統(tǒng)復(fù)乳法低。90d時(shí)傳統(tǒng)復(fù)乳法和聚合物合金法累計(jì)釋放率分別為78.6%、91.2%，聚合物合金法釋藥更完全。對(duì)于蛋白質(zhì)藥物而言，藥物的載藥量、包封率并不等于具有活性的藥物的量，主要由于微囊制備過程中蛋白質(zhì)分子會(huì)遭到不同程度的破壞，破壞程度與制備條件及制備工藝有關(guān)，我們制備蛋白質(zhì)藥物微囊的目的就是最大限度地保護(hù)藥物的活性，所以了解微囊內(nèi)藥物的生物學(xué)活性也是必要的。根據(jù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定需要，我們采用了PC12細(xì)胞方法進(jìn)行活性測(cè)定，NGF可使PC12細(xì)胞停止分裂，長出突起，轉(zhuǎn)化成神經(jīng)元樣細(xì)胞。本組實(shí)驗(yàn)通過測(cè)量陽性PC12細(xì)胞比例，傳統(tǒng)法組在90d時(shí)與陰性對(duì)照組接近，證明已無活性NGF釋出，而合金法組可一直釋放活性NGF達(dá)90d。本實(shí)驗(yàn)采用聚合物合金法制備NGF緩釋微球，結(jié)果微球大小符合實(shí)驗(yàn)要求，較傳統(tǒng)復(fù)乳法所制備的NGF緩釋微球突釋效應(yīng)較少，包封率更高，可一直釋放活性NGF達(dá)90d。聚合物合金法制備NGF緩釋微球?qū)p少突釋、提高包封率、保留NGF活性均有重要意義，值得深入研究，具有廣泛的應(yīng)用前景。