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篇1

關(guān)鍵詞: 吸煙;免疫系統(tǒng);T細(xì)胞

摘 要:目的 探討長(zhǎng)期吸煙對(duì)免疫系統(tǒng)影響的機(jī)制. 方法 分別于3mo和9mo對(duì)吸煙組及對(duì)照組大鼠行抗體形成細(xì)胞（AFC）試驗(yàn)和抗CD3 抗體誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖試驗(yàn)以測(cè)定其體液和細(xì)胞免疫. 結(jié)果 9mo后，吸煙組大鼠對(duì)綿羊紅細(xì)胞的抗體形成細(xì)胞反應(yīng)及抗CD3 抗體誘導(dǎo)的增殖反應(yīng)均較對(duì)照組顯著降低，而3mo時(shí)無顯著差異. 結(jié)論 長(zhǎng)期吸煙所引起的免疫抑制是與抗原刺激T細(xì)胞后，T細(xì)胞不能有效地活化、增殖和分化有關(guān)，T細(xì)胞自身的細(xì)胞免疫受到損傷，也使得它不能有效地輔助B細(xì)胞進(jìn)行增殖及產(chǎn)生抗體，從而使體液免疫也變得無能.

Keywords:smoking;immunization system;T cells

Abstract:AIM To investigate the mechanism of how cigarette smoke affects the immunization system.METHODS Antibody-forming cell response and assay for anti-CD3 -in-duced proliferation were performed to determine the cellular and humoral immunity after3and9months’smoking.RESULTS Compared to those of the control group，the an-tibody-forming cell response and anti-CD3 -induced prolifera-tion of smoking group reduced significantly after9months，while there was no significant difference between the two groups after3months.CONCLUSION Immunosuppression caused by chronic exposure to cigarette smoke is related with the impairment of antigen mediated signaling in T cells.The impairment leads to the significant reduction of activation and　proliferation of T cells，which in turn causes the impairment of the cellular immunity and thereby the disability to help the B cells to produce antibodies.Therefore，the humoral immu-nity is anergy as a result.

0 引言

吸煙是影響身體健康的一個(gè)重要因素，可以顯著升高心臟病、腫瘤、急慢性呼吸道感染的發(fā)病率.有人認(rèn)為就是因?yàn)槲鼰熕鸬拿庖呦到y(tǒng)的損害才導(dǎo)致了人體對(duì)這些疾病的易感性［1］ .吸煙可影響廣泛的包括體液的和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)功能［2］ .盡管人們了解到長(zhǎng)期吸煙會(huì)影響兔子、猴和人類的T細(xì)胞反應(yīng)，但其確切的分子機(jī)制卻尚未闡明.大鼠若長(zhǎng)期暴露于煙草的主要毒性成分尼古丁，抗體形成細(xì)胞的反應(yīng)就會(huì)受到影響.其原因可能是T細(xì)胞的反應(yīng)性增殖降低，也可能是T細(xì)胞依賴的抗體反應(yīng)降低.然而，吸煙對(duì)T細(xì)胞功能影響的機(jī)制人們尚未清楚，這種免疫抑制有可能與T細(xì)胞內(nèi)抗原介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受損有關(guān)［3］ .除尼古丁之外，煙草中含有成千上萬種其他毒性物質(zhì).為研究吸煙引起的免疫抑制的分子機(jī)制，我們給SD大鼠每日持續(xù)吸煙數(shù)小時(shí)，持續(xù)9mo，然后觀察其免疫功能的改變.

1 材料和方法

1.1 材料 ①動(dòng)物:4～5wk齡的SD雄性大鼠共50只購自本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，到6wk齡時(shí)按質(zhì)量隨機(jī)分為對(duì)照組和吸煙組，3，9mo時(shí)分別處死10，15只.②抗CD3 抗體購自北京中山公司.

1.2 方法 ①煙卷點(diǎn)燃后通過與飼養(yǎng)籠相通的進(jìn)氣管吹入，吸煙組每日暴露6h，對(duì)照組暴露于正常飼養(yǎng)環(huán)境.②免疫:大鼠在處死之前4d給予iv5×108 綿羊紅細(xì)胞.③淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備:取大鼠脾臟后將之研碎，經(jīng)不銹鋼濾網(wǎng)過濾后用NH4 Cl溶液將紅細(xì)胞溶解，將脾細(xì)胞過nylon wool柱，不結(jié)合nylon wool柱的細(xì)胞為T淋巴細(xì)胞，從而將T淋巴細(xì)胞分離出來，然后再用流式細(xì)胞儀分析;經(jīng)不銹鋼濾網(wǎng)過濾的脾細(xì)胞用小鼠抗大鼠CD3 單克隆抗體，再在用抗小鼠IgG抗體包被的板上孵育，CD3+ 的細(xì)胞被除去，非結(jié)合細(xì)胞為B淋巴細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀分析.④抗體形成細(xì)胞（AFC）試驗(yàn)［4］ :不同濃度的脾細(xì)胞與20μmol?mL-1 的綿羊紅細(xì)胞、25μL豚鼠補(bǔ)體混合，再用含100μmol?mL-1 胎牛血清的RPMI1640將液體總量加到150μL，37℃培養(yǎng)45min，然后記數(shù)抗體形成細(xì)胞.⑤抗CD3 抗體誘導(dǎo)的T細(xì)胞的增殖試驗(yàn):在96孔板中加入含2×105 個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)液0.2mL，一組加入5μg?mL

-1 的抗CD3 抗體，另一組不加，37℃培養(yǎng)3d后摻入3 H（0.5μCi/孔），測(cè)定.

2 結(jié)果

2.1 長(zhǎng)期吸煙對(duì)抗體形成細(xì)胞反應(yīng)的影響 3，9mo后，與對(duì)照組相比，吸煙大鼠脾細(xì)胞的T，B淋巴細(xì)胞所占比例無明顯差異.經(jīng)綿羊紅細(xì)胞免疫4d后，對(duì)兩組大鼠的抗體形成細(xì)胞反應(yīng)進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明9mo時(shí)吸煙組大鼠對(duì)綿羊紅細(xì)胞的抗體形成細(xì)胞反應(yīng)較對(duì)照組顯著降低（P

圖1 略

2.2 吸煙對(duì)TCR介導(dǎo)的T細(xì)胞增殖的影響 有研究表明，長(zhǎng)期吸煙可以減低T細(xì)胞對(duì)其有絲分裂原的反應(yīng)［5］ .我們用抗CD3 抗體直接連接TCR，誘導(dǎo)T細(xì)胞的增殖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，吸煙9mo時(shí)的大鼠對(duì)抗CD3 抗體誘導(dǎo)的增殖反應(yīng)較對(duì)照組顯著性降低（P

圖2 略

3 討論

有報(bào)道表明，長(zhǎng)期吸煙可以降低機(jī)體的免疫力，而且很可能是同時(shí)抑制了體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)［6］ .作為煙草中的主要毒性成分，尼古丁可以導(dǎo)致T細(xì)胞的反應(yīng)無能，而且很可能是與抗原介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的損傷及細(xì)胞內(nèi)Ca2+ 反應(yīng)抑制相關(guān)［3］ .

從本研究結(jié)果看，吸煙早期（3mo）并不引起顯著的免疫力降低，而長(zhǎng)期吸煙不僅會(huì)導(dǎo)致體液的，而且會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞免疫的損傷，說明免疫力的降低是一個(gè)損傷逐漸積累的過程.吸煙若能在早期及時(shí)戒煙，對(duì)機(jī)體免疫力的損傷是不會(huì)很大的.長(zhǎng)期吸煙并不引起淋巴細(xì)胞數(shù)量和比例的改變，這說明吸煙引起的免疫抑制并不是由于淋巴細(xì)胞數(shù)量和比例的改變引起的，而是T、B淋巴細(xì)胞的功能障礙.長(zhǎng)期吸煙者的T細(xì)胞在接受了外源性抗原刺激后，并不能夠被有效激活、增殖和分化，細(xì)胞免疫受到損傷，也使得它不能有效地輔助B細(xì)胞進(jìn)行增殖和分化，這很可能是體液免疫降低的一個(gè)重要原因.作為煙草中的主要毒性成分，尼古丁可以導(dǎo)致T細(xì)胞的反應(yīng)無能，而且很可能是與抗原介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的損傷及細(xì)胞內(nèi)Ca2+ 反應(yīng)抑制相關(guān)［3］ .

蛋白磷酸化是細(xì)胞調(diào)節(jié)過程中一個(gè)主要的作用方式.抗原刺激T細(xì)胞后，蛋白酪氨酸激酶被活化，這就會(huì)通過酪氨酸依賴的機(jī)制激活磷脂酶C-γ1（PLC-γ1）及產(chǎn)生IP3［7］ .而IP3是人們所熟知的引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+ 迅速、持久上升的重要介質(zhì).IP3的產(chǎn)生和細(xì)胞內(nèi)Ca2+ 的蓄積是T細(xì)胞發(fā)揮其功能的基本條件，因而，長(zhǎng)期吸煙所引起的T細(xì)胞的功能障礙很可能是由IP3產(chǎn)生或Ca2+ 蓄積障礙所引起的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑受損引起的.

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篇2

【關(guān)鍵詞】T細(xì)胞；胸腺細(xì)胞；分化；選擇

T淋巴細(xì)胞(T lymphocyte)簡(jiǎn)稱T細(xì)胞，是數(shù)量最多、功能最復(fù)雜的淋巴細(xì)胞群，也是適應(yīng)性細(xì)胞免疫應(yīng)答的執(zhí)行者，并在TD-Ag誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要的輔助作用。T細(xì)胞及其亞群歷來是組織胚胎學(xué)、醫(yī)學(xué)免疫學(xué)等生物科學(xué)領(lǐng)域的研究重點(diǎn)，成果顯著，理論也較為豐富，但不能否認(rèn)的是，各學(xué)科在相關(guān)內(nèi)容的描述上往往不夠統(tǒng)一，或者缺乏足夠的知識(shí)關(guān)聯(lián)，難免會(huì)給讀者帶來一些理解上的困難。本文就T細(xì)胞的分化發(fā)育過程及其形態(tài)與表面標(biāo)志變化進(jìn)行歸納。

1T細(xì)胞的來源

T細(xì)胞和B細(xì)胞一樣，都是由多能造血干細(xì)胞(MHSC)發(fā)育分化而來。MHSC首先分化為髓樣祖細(xì)胞和淋巴樣祖細(xì)胞，胚胎第7周時(shí)，淋巴樣祖細(xì)胞定向發(fā)育成原T(pro-T)細(xì)胞(表型為CD410、CD3-、CD8+、CD25-、C-kit+、Lin-、TCRαβ-)，在胸腺血管形成之前，胸腺原基分泌的趨化因子即吸引循環(huán)血液中的原T細(xì)胞進(jìn)入其內(nèi)。原T細(xì)胞先后來自卵黃囊、胎肝和骨髓，但進(jìn)入胸腺的具體途徑和機(jī)制還不完全清楚。有人認(rèn)為是經(jīng)皮-髓質(zhì)交界處的毛細(xì)血管后微靜脈進(jìn)入胸腺實(shí)質(zhì)，有人則認(rèn)為是隨組織液從胸腺被膜進(jìn)入實(shí)質(zhì)的，從發(fā)生上來說，兩種觀點(diǎn)都具有階段性意義。原T細(xì)胞進(jìn)入胸腺被膜下而未到達(dá)胸腺皮質(zhì)之前，稱前T(pre-T)細(xì)胞，當(dāng)其進(jìn)入胸腺皮質(zhì)后即稱為胸腺細(xì)胞。在相關(guān)文獻(xiàn)資料中，多數(shù)對(duì)于淋巴干細(xì)胞的定位較為模糊，名詞使用也比較混亂，因此有必要進(jìn)行討論，統(tǒng)一認(rèn)識(shí)。筆者認(rèn)為，淋巴干細(xì)胞是淋巴系造血祖細(xì)胞的統(tǒng)稱，可分為兩級(jí)，淋巴樣祖細(xì)胞屬于一級(jí)(多向)淋巴干細(xì)胞，由其分化而來的pro-T細(xì)胞、pro-B細(xì)胞和pro-NK細(xì)胞(后者尚未證實(shí))則屬于二級(jí)(定向)淋巴干細(xì)胞；從這個(gè)意義上來講，髓系造血祖細(xì)胞也可分為二級(jí)或三級(jí)以上，髓樣祖細(xì)胞為一級(jí)，可向單系(如紅系)或二系(如粒單系)發(fā)展；就T細(xì)胞的發(fā)育而言，pro-T細(xì)胞以前為干細(xì)胞階段，pre-T細(xì)胞以后為胸腺細(xì)胞階段。

2 胸腺微環(huán)境

胸腺微環(huán)境是胸腺細(xì)胞賴以生存的場(chǎng)所，由誘導(dǎo)其增殖、分化與選擇性發(fā)育的各種因素構(gòu)成。淋巴干細(xì)胞早期即在胸腺內(nèi)開始分化，應(yīng)用小鼠胸腺細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ脱芯勘砻鳎谂咛?1～12天pro-T細(xì)胞已進(jìn)入胸腺，在胸腺微環(huán)境的影響下胸腺細(xì)胞迅速發(fā)生增殖和分化。

目前已知誘導(dǎo)T細(xì)胞在胸腺內(nèi)分化、成熟的主要因素包括：①胸腺基質(zhì)細(xì)胞(TSC)通過細(xì)胞表面的粘附分子直接與胸腺細(xì)胞相互作用，其中胸腺內(nèi)的哺育細(xì)胞(nurse cell)對(duì)于T細(xì)胞的成熟和分化起著重要的調(diào)節(jié)作用；②胸腺基質(zhì)細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子(SCF、IL-1、IL-6、IL-7、GM-CSF等)和胸腺激素(胸腺素、胸腺α肽、胸腺生成素等)誘導(dǎo)胸腺細(xì)胞分化；③胸腺細(xì)胞自身分泌多種細(xì)胞因子(IL-2、IL-4、IFNy、IFNα等)對(duì)胸腺細(xì)胞本身的分化和成熟起重要的調(diào)節(jié)作用；④胸腺上皮細(xì)胞(TEC)、巨噬細(xì)胞(M )和樹突狀細(xì)胞(DC)對(duì)于胸腺細(xì)胞分化過程中的自身耐受、MHC限制以及功能性T細(xì)胞亞群的形成起著決定性作用；⑤細(xì)胞外基質(zhì)也是胸腺微環(huán)境的重要組成部分，包括多種膠原蛋白、網(wǎng)狀纖維蛋白、葡萄糖胺聚糖等，它們可促進(jìn)上皮細(xì)胞與胸腺細(xì)胞接觸，并促進(jìn)胸腺細(xì)胞在胸腺內(nèi)移行和成熟。

3胸腺細(xì)胞的分化階段

胸腺細(xì)胞從皮質(zhì)淺層到皮質(zhì)深層，進(jìn)而經(jīng)過皮、髓質(zhì)交界處進(jìn)入髓質(zhì)，在胸腺微環(huán)境的作用下逐漸分化成熟，它們的分化程序受到嚴(yán)格的調(diào)控。根據(jù)對(duì)人胸腺不同部位胸腺細(xì)胞的表型分析，胸腺細(xì)胞的分化可分為4個(gè)階段。

3.1前T細(xì)胞:主要位于胸腺被膜下，細(xì)胞體積較大，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器少。pre-T細(xì)胞的表型為CD3-、CD4-、CD8-、CD25-、C-kit10、TCRαβ-，即尚未出現(xiàn)T細(xì)胞標(biāo)志，但表達(dá)末端脫氧核苷轉(zhuǎn)移酶(Tdt)，部分細(xì)胞表達(dá)CD7。

3.2早期胸腺細(xì)胞:主要分布于被膜下、小葉間隔附近及胸腺皮質(zhì)淺層。早期胸腺細(xì)胞體積大，核圓形，電子密度較低，染色質(zhì)呈細(xì)粒狀，核仁不明顯；胞質(zhì)少，呈環(huán)帶狀，細(xì)胞器少，僅見少量游離核糖體和球形線粒體。在胚胎10～14周時(shí)，這種細(xì)胞是構(gòu)成胸腺的主要細(xì)胞成分。15～20周時(shí)，該類細(xì)胞數(shù)量相對(duì)減少，30周至足月則更少。早期胸腺細(xì)胞的表型為CD2+、CD3+、CD5+、CD4-、CD8-、CD25-、TCRαβ-，由于缺乏CD4和CD8分子，因此又稱雙陰性(DN)細(xì)胞。DN細(xì)胞向皮質(zhì)深層遷移的同時(shí)，發(fā)生TCRβ基因重排及轉(zhuǎn)錄，可使自身免于凋亡(apoptosis)，更重要的是，其TCRβ-βCD3可逐漸表達(dá)于細(xì)胞表面，與基質(zhì)細(xì)胞配基結(jié)合后，經(jīng)p56lek傳導(dǎo)信號(hào)，誘導(dǎo)CD4/CD8分子表達(dá)及TCRβ基因發(fā)生等位排斥。

3.3普通胸腺細(xì)胞:由早期胸腺細(xì)胞經(jīng)數(shù)次分裂后移向皮質(zhì)深層發(fā)育而成，是胚胎20周以后胸腺皮質(zhì)的主要成分。細(xì)胞中等大小，核圓形或橢圓形，染色質(zhì)呈斑塊狀，功能活躍者多見核仁，趨向退化者核深染。

普通胸腺細(xì)胞表達(dá)CD3、CD1和T細(xì)胞抗原受體(TCR)，隨即出現(xiàn)CD4和CD8分子。這種具有完整TCR 及CD4+CD8+T細(xì)胞又稱雙陽性(DP)細(xì)胞，約占此類細(xì)胞總數(shù)的80﹪～85﹪。只有極少數(shù)普通胸腺細(xì)胞繼續(xù)分化為成熟胸腺細(xì)胞，而絕大部分將在陽性和陰性選擇中凋亡而被清除(后述)。

3.4成熟胸腺細(xì)胞:主要位于皮質(zhì)深層或髓質(zhì)。細(xì)胞體積相對(duì)較小，與外周血小淋巴細(xì)胞形態(tài)無異，光鏡和電鏡下也難與普通胸腺細(xì)胞區(qū)分。成熟胸腺細(xì)胞除高表達(dá)TCR外，主要表達(dá)CD4+或CD8+，所以又稱單陽性(SP)細(xì)胞。

4胸腺選擇過程

T細(xì)胞發(fā)育成熟的關(guān)鍵步驟是雙陽性(DP)細(xì)胞向單陽性(SP)細(xì)胞分化階段所發(fā)生的胸腺選擇，包括陽性選擇與陰性選擇，主要組織相容性復(fù)合體(MHC)抗原(分子)在這兩種選擇中起決定性作用。

4.1陽性選擇過程:主要發(fā)生在DP細(xì)胞與胸腺上皮細(xì)胞之間的相互作用。在TCRαβ的介導(dǎo)下，若DP細(xì)胞能與胸腺皮質(zhì)上皮細(xì)胞表面MHC-Ⅰ類或MHC-Ⅱ類分子以適當(dāng)親和力結(jié)合，則可能被選擇而繼續(xù)發(fā)育，分化為SP細(xì)胞；若DP細(xì)胞不能與MHC分子有效結(jié)合或發(fā)生高親和力結(jié)合，則在胸腺皮質(zhì)中發(fā)生程序性細(xì)胞死亡(PCD)即凋亡。在此過程中，MHC-Ⅰ類分子選擇CD8共受體，而使同一個(gè)DP細(xì)胞表面CD4共受體減少；MHC-Ⅱ類分子則選擇CD4共受體，使CD8共受體減少。這種選擇過程賦予成熟CD8+CD4-T細(xì)胞具有識(shí)別外來抗原與自身MHC-Ⅰ類分子復(fù)合物的能力，CD4+CD8-T細(xì)胞具有識(shí)別外來抗原與自身MHC-Ⅱ類分子復(fù)合物的能力，此即T細(xì)胞獲得MHC限制性的基礎(chǔ)。陽性選擇可消除所有非己MHC限制性T細(xì)胞克隆，而保存自身MHC限制性T細(xì)胞克隆，包括潛在而有害的自身反應(yīng)性T細(xì)胞克隆。

4.2陰性選擇過程:主要發(fā)生于DP細(xì)胞與胸腺內(nèi)巨噬細(xì)胞(M )、樹突狀細(xì)胞(DC)或髓質(zhì)上皮細(xì)胞間的相互作用。位于皮質(zhì)與髓質(zhì)交界處的DC和M 均表達(dá)高水平的MHC-Ⅰ類抗原和MHC-Ⅱ類抗原，后者與自身抗原結(jié)合成復(fù)合物，對(duì)已經(jīng)歷過陽性選擇的胸腺細(xì)胞進(jìn)行陰性選擇。能識(shí)別自身抗原-MHC分子復(fù)合物的胸腺細(xì)胞即被激活而發(fā)生程序性細(xì)胞死亡，而不能識(shí)別該復(fù)合物的胸腺細(xì)胞則繼續(xù)發(fā)育。經(jīng)陰性選擇后，排除了自身反應(yīng)性T細(xì)胞克隆，并獲得對(duì)自身抗原的耐受性。

經(jīng)歷上述與MHC有關(guān)的選擇過程，約有95%以上的胸腺細(xì)胞被滅活或淘汰，只有少量胸腺細(xì)胞分化成熟為具有MHC限制性、可識(shí)別非己抗原的CD4+CD8-或CD4-CD8+單陽性細(xì)胞，即具有免疫功能的成熟T細(xì)胞。

5成熟T細(xì)胞庫

成熟的胸腺細(xì)胞大部分通過皮質(zhì)與髓質(zhì)交界處的高內(nèi)皮微靜脈(HEV)進(jìn)入血液，少數(shù)經(jīng)淋巴管入血。成熟胸腺細(xì)胞為處女型T細(xì)胞，或稱初始T細(xì)胞(Tn細(xì)胞)，它們都是未經(jīng)抗原刺激的CD45RA+T細(xì)胞群，這和記憶T細(xì)胞(Tm細(xì)胞)表達(dá)CD45RO+有所不同。Tn細(xì)胞遷出胸腺后，依靠其表面的歸巢受體(HR，即CD44分子)定居于周圍淋巴器官并參加淋巴細(xì)胞再循環(huán)。遍布全身各處的T細(xì)胞共同構(gòu)成T細(xì)胞庫(T cell repertoire)。成熟T細(xì)胞庫具有兩個(gè)基本特性：①TCR識(shí)別抗原受MHC限制，即不僅特異性識(shí)別經(jīng)抗原提呈細(xì)胞(APC)加工處理的抗原肽，而且須同時(shí)識(shí)別與抗原肽結(jié)合成復(fù)合物的MHC分子；②對(duì)自身抗原具有耐受性，一般不對(duì)自身MHC分子或與之結(jié)合的自身抗原分子產(chǎn)生應(yīng)答，即所謂自身耐受現(xiàn)象。

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[7]Nehls M，Kyewski B，Messerle M，et al.Two genetically separable steps in the differentiation of thymic epithelium[J].Science，1996，272:886-889

篇3

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取2008年1月～2014年6月收治的肺癌患者80例。按照隨機(jī)數(shù)字表法分為觀察組和對(duì)照組， 各40例， 其中觀察組：男23例， 女17例；年齡30～76歲， 平均年齡（59.69±12.44）歲；平均KPS評(píng)分（64.39±21.25）分。對(duì)照組：男22例， 女18例；年齡32～76歲， 平均年齡（58.30±12.33）歲；平均KPS評(píng)分（65.06±22.21）分。兩組在性別、年齡及KPS評(píng)分等一般資料方面比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1. 2 治療方法 對(duì)照組患者給予常規(guī)方案化療， 連用4個(gè)周期。觀察組在化療間期給予六君子丸治療， 每袋重9 g， 9 g/次口服， 2次/d。

1. 3 觀察指標(biāo) 觀察兩組治療前后血清T淋巴細(xì)胞亞群水平變化， 檢測(cè)方法為：采患者晨空腹靜脈血， 置于抗凝管中， 以3000 r/min， 高速離心5 min， 采集上層血清， 置于-20℃保存， 采用流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司BD LSRFortessa型）測(cè)定血清T淋巴細(xì)胞亞群水平：包括NK細(xì)胞、CD3、CD4、CD8、CD4/CD8， 試劑盒為儀器配套。

1. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS15.0版軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn)， 計(jì)數(shù)資料用率（%）表示， 采用χ2檢驗(yàn)。P

2 結(jié)果

兩組血清T淋巴細(xì)胞亞群比較， 治療前兩組的血清T淋巴細(xì)胞亞群水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；治療后對(duì)照組患者血清NK細(xì)胞、CD3、CD4及CD4/CD8水平較治療前明顯降低， CD8水平明顯升高（P

3 討論

祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥在提高免疫功能方面有獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)， 認(rèn)為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)所謂的免疫功能低下與中醫(yī)的“虛證”密切相關(guān)[2]；其從整體出發(fā)， 通過調(diào)整人體陰陽平衡， 來提高患者的免疫功能。作者認(rèn)為肺癌患者的中醫(yī)辨證以“虛證”為主， 對(duì)應(yīng)了其免疫功能低下的說法， 認(rèn)為應(yīng)采用“補(bǔ)虛扶正”的方法治療， 并通過檢測(cè)患者血清T淋巴細(xì)胞亞群水平的變化觀察“六君子丸”對(duì)中晚期SCLC患者免疫功能的影響。六君子丸是由傳統(tǒng)的六君子湯化裁而成， 組方如下：黨參、白術(shù)、茯苓、半夏、陳皮、瓜蔞皮、杏仁、薏苡仁， 具有補(bǔ)脾益氣， 燥濕化痰之功效。

T淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)內(nèi)功能最重要的一大細(xì)胞群， 在正常機(jī)體內(nèi)各個(gè)T淋巴細(xì)胞亞群相互使用， 維持著機(jī)體正常的免疫功能。在T淋巴細(xì)胞亞群中NK細(xì)胞是抗腫瘤的重要效應(yīng)細(xì)胞， 不僅可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞， 還可以通過產(chǎn)生白介素-2（IL-2）、干擾素細(xì)胞因子而增強(qiáng)其他細(xì)胞的抗腫瘤作用；CD3代表總T細(xì)胞， CD4代表T輔助細(xì)胞（TH）即免疫輔助細(xì)胞， CD8代表T抑制細(xì)胞（TS）即免疫抑制細(xì)胞[3]。

本研究結(jié)果顯示經(jīng)過4個(gè)周期的化療后對(duì)照組患者血清NK細(xì)胞、CD3、CD4及CD4/CD8水平較治療前明顯降低， CD8水平明顯升高， 說明化學(xué)治療損害晚期SCLC患者的免疫功能， 而觀察組患者血清NK細(xì)胞、CD3、CD4及CD4/CD8水平較治療前明顯升高， CD8水平明顯降低， 說明中醫(yī)補(bǔ)虛扶正治療能夠提高患者的免疫功能。

綜上所述， 中藥六君子丸可以提高晚期SCLC患者T淋巴細(xì)胞所介導(dǎo)的免疫功能， 從而提高臨床療效， 值得臨床推廣應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)

[1] 張勇， 郭逸， 丁曉娟， 等. 參芪扶正注射液對(duì)肺癌小鼠化療后免疫功能調(diào)節(jié)的影響. 醫(yī)學(xué)綜述， 2013， 19（10）：1878-1879，1882.

[2] 馬晨光. 參芪扶正注射液對(duì)晚期非肺癌化療患者免疫功能的影響. 黑龍江醫(yī)學(xué)， 2013， 2（6）：124-126.

篇4

[關(guān)鍵詞] 肺癌；T淋巴細(xì)胞；NK細(xì)胞；流式細(xì)胞術(shù)

[中圖分類號(hào)] R734 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2013）04（b）-0093-03

肺癌是全世界最常見的惡性腫瘤。肺癌的5年生存率只有10%～20%[1]，預(yù)后極差。近50年來，我國(guó)肺癌發(fā)病率明顯增高，在大中城市肺癌已居男性腫瘤之首。T淋巴細(xì)胞在抗腫瘤中具有極其重要的作用；T細(xì)胞應(yīng)答是控制腫瘤生長(zhǎng)發(fā)育的最重要的宿主應(yīng)答；參與抗腫瘤免疫的兩類T細(xì)胞亞群為CD4+輔助/誘導(dǎo)T細(xì)胞、CD8+抑制/細(xì)胞毒T細(xì)胞；T淋巴細(xì)胞及亞群可作為臨床判斷患者狀態(tài)的一個(gè)敏感指標(biāo)，對(duì)臨床治療具有重要意義。NK細(xì)胞在抗腫瘤的天然免疫和特異性免疫中發(fā)揮效應(yīng)作用，能夠直接殺傷各種腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞，是機(jī)體抗腫瘤的第一道防線。本文旨在探討肺癌患者淋巴亞群變化和不同年齡組細(xì)胞免疫狀況。

1 資料與方法

1.1 一般資料

570例肺癌患者均為2009年1月～2012年10月淮南東方醫(yī)院集團(tuán)腫瘤醫(yī)院初次住院的臨床確診患者，其中，男性481例，女性89例，男女比例為5.4∶1；最大年齡92歲，最小27歲，中位年齡66歲。正常對(duì)照組20例，其中，男性13例，女性7例，年齡35～57歲，均為體檢未發(fā)現(xiàn)腫瘤及免疫性疾患的人員。

1.2 樣本采集

肝素真空采血管采集靜脈血2 mL，室溫放置，樣本24 h內(nèi)做染色處理。

1.3 試劑儀器

使用BD MultitestTM IMK kit 四色熒光抗體試劑盒（Cat No：340503），CaliBRITETM 3 COLOR KIT（Cat No：340 486）和CaliBRITETM APC（Cat No：340487）定標(biāo)熒光微球，F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司），調(diào)用四色免洗條件MultiSET軟件自動(dòng)分析淋巴細(xì)胞亞群；報(bào)告NK細(xì)胞（CD16+56+）、T淋巴細(xì)胞（CD3+）、輔助/誘導(dǎo)T細(xì)胞（CD3+ CD4+ CD8-）和抑制/細(xì)胞毒T細(xì)胞（CD3+ CD4- CD8+）占淋巴細(xì)胞的百分比和CD4+/CD8+細(xì)胞比值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以 x±s表示，組間比較用t檢驗(yàn)，淋巴亞群結(jié)果的年齡趨勢(shì)分析用線性回歸分析，應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺癌不同年齡組構(gòu)成比

本組結(jié)果在51～80歲年齡段內(nèi)發(fā)病人數(shù)占肺癌總?cè)藬?shù)的78.3%，是肺癌高發(fā)年齡段。肺癌在71～80歲組發(fā)病率最高（28.8%），可能是人的衰老，免疫系統(tǒng)功能衰弱，特別是細(xì)胞免疫功能下降，導(dǎo)致腫瘤發(fā)病率增加。由于80歲以上人群數(shù)量明顯減少，其發(fā)病率明顯減低并不能說明其發(fā)生肺癌的概率會(huì)降低。各組比例如圖1。

2.2 肺癌患者不同年齡組與對(duì)照組淋巴細(xì)胞亞群結(jié)果

肺癌患者CD4+ T細(xì)胞相對(duì)減低、CD8+ T細(xì)胞相對(duì)增高、CD4+/CD8+比值明顯降低，與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；NK和CD3+ T細(xì)胞與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。肺癌患者不同年齡組與對(duì)照組淋巴細(xì)胞亞群結(jié)果見表1。

2.3 肺癌患者淋巴亞群結(jié)果的年齡趨勢(shì)分析

以年齡組（1）～（5）組為自變量，以淋巴亞群結(jié)果為因變量作線性回歸分析，SPSS 17.0軟件統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。

隨著肺癌患者年齡降低NK細(xì)胞有明顯降低趨勢(shì)（P < 0.01），CD3+ T細(xì)胞有明顯增加趨勢(shì)（P < 0.01），如圖2。

3 討論

CD4+ T細(xì)胞可直接殺傷腫瘤細(xì)胞，可識(shí)別腫瘤細(xì)胞分泌的可溶性抗原，參與B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和細(xì)胞毒T細(xì)胞的激活，進(jìn)而發(fā)揮抗瘤作用；CD4+ T細(xì)胞的減少可以解釋腫瘤的免疫逃避機(jī)制。腫瘤細(xì)胞具有分泌多種免疫抑制因子功能，可抑制T細(xì)胞和NK細(xì)胞[2]，使CD4+ T細(xì)胞和NK細(xì)胞數(shù)量減少，CD4+ T細(xì)胞和NK細(xì)胞減少可削弱機(jī)體的免疫監(jiān)視作用。本組結(jié)果顯示CD4+ T細(xì)胞和NK細(xì)胞明顯降低，說明腫瘤患者存在免疫逃避；隨著年齡的增大CD4+ T細(xì)胞降低明顯，免疫功能隨年齡增加而不斷下降[3]，腫瘤的免疫逃避增加。

CD8+ T細(xì)胞按CD28有無可分為CD8+/CD28+和CD8+/CD28-兩類，前者有細(xì)胞毒細(xì)胞功能，而后者則有抑制功能，CD28分子在T細(xì)胞激活、增殖中具有重要作用；惡性腫瘤患者CD8+ T細(xì)胞CD28+分子表達(dá)率顯著下降，影響T細(xì)胞的活化增殖，而CD8+/CD28- T細(xì)胞逐漸增高，進(jìn)而造成機(jī)體對(duì)腫瘤免疫力的下降[3-4]。在抗腫瘤的免疫應(yīng)答中，細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）成為抗腫瘤免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞[5]。本組結(jié)果CD8+ T細(xì)胞明顯增加超過CD4+ T細(xì)胞減少的數(shù)量導(dǎo)致CD3+總T細(xì)胞增加，說明肺癌患者有抑制功能的T細(xì)胞增加，CD8+ T細(xì)胞不能被充分激活而無法產(chǎn)生有效抗腫瘤作用。在殺傷腫瘤中往往CD4+、CD8+兩類細(xì)胞相互配合，共同協(xié)作。腫瘤形成發(fā)展過程中，產(chǎn)生或分泌可溶性免疫因子，可誘導(dǎo)CD8的產(chǎn)生同時(shí)阻止CD4的形成和成熟而導(dǎo)致CD4+/CD8+比值下降，CD4+/CD8+比值可反映機(jī)體的免疫功能狀況。

NK細(xì)胞具有抗腫瘤，抗病毒感染，抗器官移植，參與T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞的調(diào)節(jié)及其免疫調(diào)節(jié)的功能。NK細(xì)胞通過受體作用維持平衡、發(fā)揮殺傷效應(yīng)[6-7]。Cooper MA等[8]研究證明人外周血NK細(xì)胞可分為二群，80%～90%的NK細(xì)胞低表達(dá)CD56高水平表達(dá)CD16（CD56dim CD16brigh），此類細(xì)胞可有效地發(fā)揮細(xì)胞毒作用；10%～20%的NK細(xì)胞表型為CD56brighCD16dim或CD56brighCD16-，其功能主要是分泌細(xì)胞因子，參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)。陳文寬等[9]研究78例喉咽鱗癌患者發(fā)現(xiàn)癌癥組較非腫瘤對(duì)照組NK細(xì)胞活性低；局部晚期患者及有區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的NK細(xì)胞活性同樣降低。康培良等[10]報(bào)道胰腺癌根治手術(shù)治療后可明顯提高T細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞的免疫功能。本研究肺癌患者NK 細(xì)胞降低與文獻(xiàn)一致[9-11]，患者越年輕NK細(xì)胞免疫活性越低。

在21～40歲組NK細(xì)胞明顯降低，CD3+細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞明顯增高，CD4+/CD8+比值顯著降低（P < 0.01），在71～80歲組NK細(xì)胞比前四組明顯增高（P < 0.01）、稍高于對(duì)照組，說明年輕患者細(xì)胞免疫功能活躍，老年患者機(jī)體代謝慢、腫瘤生長(zhǎng)也相對(duì)緩慢，老年機(jī)體本身免疫低下，細(xì)胞免疫反應(yīng)降低。不同年齡的肺癌患者細(xì)胞免疫功能不同，其治療策略、方法也應(yīng)不同。肺癌患者越年輕細(xì)胞免疫功能紊亂越明顯，提示年輕患者的治療更要注重細(xì)胞免疫的調(diào)節(jié)和平衡。而老年患者機(jī)體本身免疫功能低下，細(xì)胞免疫對(duì)腫瘤的抑制能力有限，應(yīng)注意機(jī)體的整體性治療，防止并發(fā)癥。

總之，肺癌患者的CD4+ T細(xì)胞降低、CD8+ T細(xì)胞升高、CD4+/CD8+比值顯著降低，NK細(xì)胞降低，說明患者免疫功能處于抑制狀態(tài)，T細(xì)胞亞群及NK 細(xì)胞活性檢測(cè)可作為肺癌免疫功能及預(yù)后的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。肺癌年輕患者細(xì)胞免疫功能紊亂明顯，提示年輕患者的治療更要注重細(xì)胞免疫的調(diào)節(jié)和平衡。

[參考文獻(xiàn)]

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篇5

【關(guān)鍵詞】丙型肝炎病毒；特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞；功能

【中圖分類號(hào)】R373.2+1 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1004-7484（2014）02-0763-01

慢性丙型肝炎是一種具有嚴(yán)重危害性的傳染性疾病[1]。一些報(bào)道表明丙型肝炎患者CTL的免疫功能低下，只能起到抗感染的作用，無法抵抗感染細(xì)胞中的病毒，導(dǎo)致病毒一直存在于細(xì)胞中，最后可能誘發(fā)肝癌。本文對(duì)18例慢性丙型肝炎患者外周血中丙型肝炎病毒CTL的活性進(jìn)行檢測(cè)，研究了丙型肝炎患者丙型肝炎病毒CTL的功能?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

慢性丙型肝炎患者18例，其中男11例，女7例，年齡25-56歲，平均年齡41.32歲。所有患者均符合丙型肝炎相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除乙肝和免疫缺陷病感染，且半年內(nèi)沒有接受抗病毒和免疫調(diào)節(jié)治療。使用特異性引物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法進(jìn)行丙型肝炎病毒基因型檢測(cè)。此外選擇10例正常人作為對(duì)照，其中男6例，女4例，年齡19-36歲，對(duì)照人員免疫缺陷病毒和肝炎標(biāo)志物檢測(cè)均為陰性，無飲酒和損肝藥物使用史。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

使用PCR-SSP法對(duì)患者進(jìn)行丙型肝炎病毒基因型檢測(cè)。將表達(dá)丙型肝炎病毒核心蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒通過基因轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，經(jīng)篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Hep-Core細(xì)胞，經(jīng)過蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)證實(shí)有HCV核心蛋白表達(dá)；分離患者外周血中的單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)體外誘導(dǎo)擴(kuò)增獲得HCV特異性CTL（HCV-CTL），以Hep-Core細(xì)胞和HepG2細(xì)胞作為靶細(xì)胞，運(yùn)用乳酸脫氫酶釋放法檢測(cè)HCV-CTL的活性，用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)培養(yǎng)上清液中干擾素-γ（IFN-γ）的含量，以正常人作為對(duì)照組。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用采用 SPSS15.0分析軟件包對(duì)所得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料采用方差分析和t檢驗(yàn)，P

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中丙型肝炎病毒核心蛋白的表達(dá)

運(yùn)用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)證實(shí)使用HCV-C轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞中有HCV核心蛋白表達(dá)，沒有轉(zhuǎn)染或空白的細(xì)胞中無HCV核心蛋白表達(dá)。

2.2 HCV-CTL活性檢測(cè)

運(yùn)用乳酸脫氫酶法分析18慢性丙型肝炎患者和10例正常人的HCV-CTL活性。丙型肝炎組患者的HCV-CTL活性為（24.1±4.6）%，正常對(duì)照組為（43.2±6.1）%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

2.3 靶細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN- γ濃度的測(cè)定

丙型肝炎組患者靶細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ的濃度為（961±239）pg/ml，正常對(duì)照組為（3125±676）pg/ml， 兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

2.4 HCV-CTL活性和獲得SVR的關(guān)系

本研究中另外選取完成常規(guī)抗病毒治療的慢性丙型肝炎患者16例，其中獲得SVR患者9例，無應(yīng)答患者7例，均經(jīng)過HCV-CTL活性檢測(cè)。其中獲得SVR患者的HCV-CTL活性為（41.5±2.6）%，無應(yīng)答患者為（25.1±3.5）%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

3 討論

慢性丙型肝炎（CHC）是一種具有嚴(yán)重危害性的傳染性疾病，主要通過血液傳播。CHC的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，丙型肝炎病毒（HCV）和人體免疫系統(tǒng)的相互作用決定了該病的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)化。HCV慢性感染可能引發(fā)肝臟慢性炎癥、纖維化等，嚴(yán)重者甚至?xí)?dǎo)致肝癌[2]。丙型肝炎患者CTL免疫功能和肝病的惡化程度有一定的關(guān)系[3]。CTL免疫功能低下包括細(xì)胞抗病毒能力下降、刺激后增殖能力下降、IFN-γ分泌減少等。丙型肝炎病毒感染細(xì)胞后機(jī)體會(huì)產(chǎn)生針對(duì)HCV的特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）免疫應(yīng)答，CTL的數(shù)量和質(zhì)量決定了機(jī)體阻止病毒感染惡化和清除病毒感染的效果。如果CTL的免疫應(yīng)答較強(qiáng)，能夠起到完全清除HCV的作用；如果CTL的免疫應(yīng)答功能低下，只能起到抗感染的作用，無法抵抗感染細(xì)胞中的病毒，導(dǎo)致病毒一直存在于細(xì)胞中，最后可能誘發(fā)肝癌。

本次研究發(fā)現(xiàn)，慢性丙型肝炎患者HCV-CTL的活性明顯低于正常人。研究顯示細(xì)胞誘導(dǎo)后CTL培養(yǎng)上清液中IFN-γ濃度的濃度較正常人明顯降低，這也說明慢性丙型肝炎患者CTL細(xì)胞的分泌能力明顯下降，進(jìn)一步導(dǎo)致其免疫功能低下。獲得SVR患者的HCV-CTL活性明顯高于無應(yīng)答組，可見隨著血液中HCV RNA水平的下降，細(xì)胞中HCV-CTL的活性顯著提高，提示HCV-CTL活性和HCV RNA復(fù)制水平有一定相關(guān)性，CTL細(xì)胞的免疫功能和控制丙型肝炎病毒復(fù)制和清除的基因組有一定關(guān)系。

綜上所述，本次研究表明慢性丙型肝炎患者HCV-CTL的活性降低，CTL的免疫功能會(huì)隨之下降。慢性丙型肝炎患者HCV-CTL活性降低，CTL的免疫功能低下與病毒水平和基因型有一定關(guān)系。

參考文獻(xiàn)：

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篇6

【關(guān)鍵詞】 ； 甲基化； 淋巴細(xì)胞； 細(xì)胞免疫

人體免疫系統(tǒng)是由多種免疫細(xì)胞、免疫分子共同參與，形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)而發(fā)揮作用。其中淋巴細(xì)胞對(duì)免疫應(yīng)答的啟動(dòng)起著至關(guān)重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，吸毒人群的免疫系統(tǒng)受到極大破壞，淋巴細(xì)胞的活性也受到破壞[1]。而在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等自身性免疫疾病中，均發(fā)現(xiàn)其淋巴細(xì)胞DNA甲基化水平發(fā)生異常[2]。吸毒所導(dǎo)致的免疫力低下，與淋巴細(xì)胞甲基化水平是否存在特定規(guī)律，這是本研究的主要著眼點(diǎn)。本研究通過檢測(cè)康復(fù)期強(qiáng)制戒毒人員外周血淋巴細(xì)胞基因組DNA甲基化水平和T淋巴細(xì)胞亞群變化，研究吸毒者免疫力受損與DNA甲基化的關(guān)聯(lián)，為探討對(duì)免疫病理損傷可能機(jī)制提供理論參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本試驗(yàn)于2002年9月-2002年12月間進(jìn)行。以80例康復(fù)期強(qiáng)制戒毒人員為研究對(duì)象，其來源于福建省司法廳所屬強(qiáng)制戒毒場(chǎng)所自愿參加戒毒的人員，男40例，女40例，平均年齡（32.16±0.98）歲；符合ICD-10阿片類藥物依賴診斷標(biāo)準(zhǔn)和苯丙胺類藥物依賴診斷標(biāo)準(zhǔn)的脫毒患者；經(jīng)告知同意，自愿參加，并簽署知情同意書；排除HIV、肺結(jié)核、肝炎等傳染性疾病患者，排除肝、腎、心功能不全者及精神病患者中不能配合者。以80例正常健康人群為對(duì)照，采集靜脈血樣，其來源于福建省二人民醫(yī)院健康體檢中心參加體檢且身體健康無重大疾病者，男40例，女40例，平均年齡（29.33±2.41）歲。兩組在性別、年齡方面比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 主要儀器和試劑 多功能酶標(biāo)儀Infinite M200 F200（奧地利TECAN）；流式細(xì)胞分析儀EPICS XL（美國(guó)Coulter）；超低溫冰箱Premium Range（美國(guó)NBS）；超微量紫外分光光度計(jì)NANODROP2000（美國(guó)THERMO）；生化培養(yǎng)箱SHP-250（上海精宏）；臺(tái)式離心機(jī)（美國(guó)EPPENDORF）；可調(diào)式移液器（美國(guó)EPPENDORF）。

淋巴細(xì)胞基因組DNA抽提試劑盒（美國(guó)Omega公司）；整體甲基化定量試劑盒（美國(guó)Epigentek公司）；單克隆抗體（美國(guó)BD公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 外周血T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè) 被試人員在清晨空腹靜脈采血5 ml于肝素抗凝管中。取肝素抗凝血100 μL于小試管底部，分別加20 μL熒光標(biāo)記的單克隆抗體，混勻，室溫（18～25 ℃）孵育15 min。加紅細(xì)胞溶解液1 ml，充分混勻。待紅細(xì)胞完全溶解后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。在波長(zhǎng)488 nm時(shí)，計(jì)數(shù)30 000個(gè)細(xì)胞。記錄分析直方圖，數(shù)據(jù)經(jīng)ELITE軟件處理，以百分率報(bào)告。

1.3.2 淋巴細(xì)胞基因組DNA的提取 被試人員在清晨空腹靜脈采血5 ml于EDTA抗凝管中。供試血樣淋巴細(xì)胞基因組DNA抽提采用SE Blood DNA Kit（美國(guó)Omega公司），按試劑盒說明進(jìn)行，抽提的DNA保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 DNA含量測(cè)定及純度鑒定 取抽提好的DNA溶于雙蒸水中，于超微量紫外分光光度計(jì)NANODROP2000（美國(guó)THERMO）上測(cè)量260/280 nm光密度值。保證供試樣本A260/280比值均在1.7～1.9之間，濃度在50～100 μg/ml，以用于整體DNA甲基化水平的測(cè)定。對(duì)不符合要求的DNA樣本重新進(jìn)行抽提和定量。

1.3.4 淋巴細(xì)胞整體基因組甲基化水平測(cè)定 DNA整體甲基化水平采用整體甲基化定量試劑盒（美國(guó)Epigentek公司）檢測(cè)。該試劑盒采用抗原抗體結(jié)合的方法，將DNA固定到一個(gè)對(duì)DNA具有高親和力的反應(yīng)孔中，甲基化的DNA能夠被5甲基胞嘧啶抗體識(shí)別，通過抗原抗體識(shí)別反應(yīng)進(jìn)行定量，甲基化的DNA與OD值的高低成正比。具體操作步驟按試劑盒說明書操作，DNA甲基化的程度采用如下公式計(jì)算：

甲基化%=OD（樣本-空白對(duì)照）/2×OD（陽性對(duì)照-空白對(duì)照）

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用多元回歸分析，以P

2 結(jié)果

2.1 整體DNA甲基化水平檢測(cè)結(jié)果 康復(fù)期強(qiáng)制戒毒人員淋巴細(xì)胞中基因組DNA甲基化百分率為（15.37±3.28）%，顯著低于正常健康人群的（23.18±7.98）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

2.2 T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果 康復(fù)期強(qiáng)制戒毒人員CD3+、CD3++CD4+ 和CD3++CD4+/CD3++CD8+值均明顯低于正常健康人群，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），見表1。

2.3 淋巴細(xì)胞基因組DNA甲基化水平與T淋巴細(xì)胞亞群的相關(guān)性 以基因組DNA甲基化水平為因變量進(jìn)行多元線性回歸分析發(fā)現(xiàn)，CD3+、CD3++CD4+與淋巴細(xì)胞基因組DNA甲基化水平呈正相關(guān)（r=0.21，0.36，P0.05）。

3 討論

本研究表明吸毒者總T細(xì)胞（CD3+）減少，CD3++CD4+細(xì)胞也顯著降低，CD3++CD8+無顯著變化，故CD3++CD4+/CD3++CD8+明顯下降，說明抑制吸毒者的正常免疫功能。對(duì)人體細(xì)胞免疫的影響早有報(bào)道。早在1974年Brown等[3]就報(bào)道，海洛因成癮者免疫功能缺陷，表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率顯著降低。海洛因廣泛抑制機(jī)體細(xì)胞免疫功能，使淋巴細(xì)胞增殖和活性受抑制[4-5]。同時(shí)還能引起T淋巴細(xì)胞對(duì)PHA刺激導(dǎo)致的分化能力下降，分泌IL-2、INF-γ、IL-4能力下降[6]。研究表明，吸毒者整體細(xì)胞免疫功能處于抑制狀態(tài)，其機(jī)制可能是海洛因等藥物毒性代謝產(chǎn)物抑制了T細(xì)胞的活性和增殖能力，也可能是長(zhǎng)期濫用外源性阿片樣物質(zhì)引起機(jī)體下丘腦神經(jīng)內(nèi)分泌激素系統(tǒng)（阿片肽系統(tǒng)）退行性改變，使其對(duì)T細(xì)胞及其亞群的正常調(diào)節(jié)作用減退和消失導(dǎo)致細(xì)胞免疫功能受損[7]。

DNA甲基化是目前研究較為深入的一種表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制。在近幾年研究中發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化在自身免疫性疾病中起著重要作用。DNA甲基化水平改變可以影響許多基因的表達(dá)，包括一些與黏附因子和細(xì)胞因子表達(dá)相關(guān)的基因，導(dǎo)致T細(xì)胞的自身反應(yīng)性發(fā)生改變，從而與疾病發(fā)病密切相關(guān)。如在系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）和系統(tǒng)性硬化癥（systemic sclerosis，SSc）患者中，基因組普遍DNA甲基化水平都降低[8-9]。DNA的低甲基化可能通過引起患者的某些基因的異常表達(dá)，參與疾病的發(fā)生發(fā)展[10]。

本文研究結(jié)果表明，康復(fù)期強(qiáng)制戒毒人員淋巴細(xì)胞基因組DNA甲基化水平顯著低于正常人水平，說明對(duì)人體淋巴細(xì)胞DNA有一定影響，其表觀遺傳修飾發(fā)生改變。同時(shí)發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞基因組DNA甲基化水平與CD3+和CD3++CD4+呈正相關(guān)，說明吸毒所導(dǎo)致的細(xì)胞免疫功能下降與淋巴細(xì)胞基因組DNA甲基化水平存在關(guān)聯(lián)。本研究揭示了康復(fù)期戒毒人員的甲基化水平狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞免疫功能與淋巴細(xì)胞甲基化水平相關(guān)性，為今后從分子水平探索對(duì)人體免疫病理損傷機(jī)制具有重要意義。

參考文獻(xiàn)

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篇7

【關(guān)鍵詞】

宮頸癌；外周血T淋巴細(xì)胞；NK細(xì)胞檢測(cè)；臨床意義

The Clinical significane of peripheral blood T lymphocytes and NK cells in cervical cancer patients

WANG Hongning.

Zongnan Womens Hospital, Chengdu 610041, China

【Abstract】 Objective To investigate peripheral blood T lymphocytes in patients with cervical cancer and NK cells and its clinical significance Methods From Jan.2009 to Jan.2011,214 cases of cervical cancer patients were admitted, selected over the same period 200 cases of physical examination (medical group), peripheral blood T lymphocytes and NK cells were detected and compared Results The cervical cancer group and medical group significant difference(P

【Key words】

Cervical cancer；Peripheral blood T lymphocytes；NK cell detection；Clinical significance

T細(xì)胞亞群是反映細(xì)胞免疫功能的重要指標(biāo)之一，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后與機(jī)體的免疫功能，特別是與T淋巴細(xì)胞功能有密切的關(guān)系，在腫瘤免疫監(jiān)測(cè)中起著重要的作用［1］。而腫瘤患者以T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫存在不同程度的紊亂與缺陷。宮頸癌是女性最常見的生殖道惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅婦女的健康，近年來其發(fā)病率有明顯上升趨勢(shì)，我們對(duì)宮頸癌患者外周血T淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，了解其臨床意義，具體匯報(bào)如下。

1 資料與方法

11 一般資料 選取2009年1月至2011年1月收治的宮頸癌患者214例，年齡38~71歲，平均658歲。所有病例檢測(cè)前均未經(jīng)放療或化療。依據(jù)《新編常見惡性腫瘤診治規(guī)范》

對(duì)214例宮頸癌患者(宮頸癌組)進(jìn)行腫瘤分期，Ⅰ期102例，Ⅲ期68例，Ⅲ期30例，IV期14例。選取同期進(jìn)行健康體檢200例(體檢組)，進(jìn)行外周血T淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞檢測(cè)兩組在年齡上比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。

12 檢測(cè)方法 儀器和試劑熒光標(biāo)記單克隆抗體：鼠抗人CD3PC5/CD4FITC/CD8PE三色標(biāo)記和同型對(duì)照鼠抗人IgG1PC5/IgGlFITC/IgGPE均購自法國(guó)Immunotech公司。BeckmanCouIter EPICS XL型流式細(xì)胞儀購自美國(guó)BeckmCruIter公司。采集晨起空腹新鮮抗凝靜脈血2 ml，肝素抗凝；取外周血100 μl，加入上述單抗20 μl，混勻，室溫避光20 rain染色；加入15 ml紅細(xì)胞裂解液，混勻后室溫避光放置10 min，破壞紅細(xì)胞；1 500 r/min離心5 min，棄上清；每管加入2 ml 01％疊氮鈉的磷酸鹽緩沖液混勻，1 000 r/rain離心5 min，棄上清；加PBS 1 ml，混勻，2 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。FCM激光為冷亞激光，波長(zhǎng)488 nm，采用flowcheck調(diào)整光路，用同型對(duì)照

調(diào)電壓，以SSC為橫座標(biāo)，F(xiàn)SC為縱座標(biāo)，構(gòu)建散點(diǎn)圖，在散點(diǎn)圖上采用設(shè)門技術(shù)分析淋巴細(xì)胞群中CD+3，CD+3CD+4和CD+3CD+8抗原表達(dá)情況，每份標(biāo)本計(jì)數(shù)1×105細(xì)胞。

13 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 130統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分

析，因數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，故采用秩和檢驗(yàn)，P

2 結(jié)果

對(duì)兩組病例進(jìn)行外周血T淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞的檢測(cè)，觀察體檢組、宮頸癌組(Ⅰ期 、Ⅲ期、 Ⅲ期、IV期)變化并比較，具體見表1.

表1

3 討論

機(jī)體的免疫系統(tǒng)是在生物進(jìn)化中逐步建立起來的，其存在與功能的正常建立在機(jī)體穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上。在正常情況下，機(jī)體的自身免疫功能可以防御病原微生物的侵襲，消除體內(nèi)損傷或變老的自身細(xì)胞，處理體內(nèi)出現(xiàn)的少量異常細(xì)胞。在抗腫瘤免疫中，細(xì)胞免疫占據(jù)著重要的地位。細(xì)胞免疫應(yīng)答主要是T細(xì)胞介導(dǎo)的特異性細(xì)胞免疫，已證明T細(xì)胞具有有效的抗腫瘤作用［2］。對(duì)于T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞等細(xì)胞免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞的研究已經(jīng)成為現(xiàn)代腫瘤免疫學(xué)研究的重點(diǎn)。

胸腺依賴性淋巴細(xì)胞即T淋巴細(xì)胞又是細(xì)胞免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分。機(jī)體內(nèi)的T淋巴細(xì)胞能識(shí)別腫瘤細(xì)胞，在接受腫瘤細(xì)胞刺激后，轉(zhuǎn)化為能攻擊和殺傷腫瘤細(xì)胞的致敏淋巴細(xì)胞，有著免疫監(jiān)視機(jī)能。一旦這種監(jiān)視機(jī)能遭到破壞，患腫瘤的危險(xiǎn)就將增加。

CD+3抗原分子通常分布在成熟T細(xì)胞表面，故CD+3T細(xì)胞數(shù)量可代表機(jī)體總T細(xì)胞數(shù)量，而CD+4T細(xì)胞通常代表T輔助細(xì)胞，CD+8T細(xì)胞通常代表T抑制細(xì)胞，CD+4/CD+8比值反映了機(jī)體細(xì)胞免疫功能狀態(tài)是否穩(wěn)定，比值降低代表細(xì)胞免疫功能降低。NK細(xì)胞是在腫瘤早期發(fā)揮作用的效應(yīng)細(xì)胞，不需要預(yù)先接觸抗原，無組織相容性復(fù)合體(MHC)限制性，不依賴抗體或補(bǔ)體即可直接殺傷MHCl類基因表達(dá)低下或缺如的腫瘤細(xì)胞，被稱為抵抗腫瘤生長(zhǎng)的第一道防線，其表面標(biāo)志是CD+16CD+56［3］。

宮頸癌患者的T細(xì)胞亞群與正常人相比，當(dāng)具有免疫反應(yīng)活性的CD+4細(xì)胞減少，而具有免疫抑制功能的CD+8細(xì)胞升高時(shí)，可能引起機(jī)體的免疫平衡失調(diào)，造成惡性腫瘤患者的免疫功能減退或受到腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生大量的免疫抑制因子(TDSF)，可廣泛抑制殺傷細(xì)胞的活性，同時(shí)在腫瘤抗原的刺激下，脾細(xì)胞免疫抑制細(xì)胞前體被激活，分泌免疫抑制因子，造成宮頸癌患者免疫功能低下［4］。NK細(xì)胞在殺傷腫瘤細(xì)胞的過程中消耗了大量的NK細(xì)胞，以及TDSF使NK活性降低，NK細(xì)胞在血液循環(huán)中再分布等原因?qū)е聦m頸癌患者NK細(xì)胞降低［5］。

通過對(duì)兩組進(jìn)行觀察宮頸癌患者的T細(xì)胞亞群與正常人相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CD+4細(xì)胞減少、CD+8細(xì)胞升高。并且隨著宮頸癌患者病情的發(fā)展，Ⅰ期 、Ⅲ期與Ⅲ期、IV期外周血T淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞的檢測(cè)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

參考文獻(xiàn)

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［2］ 楊萍,程愛明,李程惡性腫瘤患者T細(xì)胞亞群和NK活性及slL2R檢測(cè)分析.腫瘤防治雜志，2004，11(1)：7981.

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篇8

【關(guān)鍵詞】 T輔助淋巴細(xì)胞； 功能變化； 急性肺損傷； 意義研究

【Abstract】 Objective：To investigate the significance of functional changes of T helper lymphocyte in acute lung injury.Method：100 mice were selected and randomly divided into the observation group and the control group，each group had 50 mice.Mice in the observation group were injected with proper amount of LPS and made models of acute lung injury.The contents of interferon and interleukin in the cell supernatants of mice were measured by enzyme linked immunosorbent assay.The expression situation of IFN-γ gene in the mice’s spleen cells was measured by reverse transcriptase-PCR determination method.The measurement results were compared between the two groups.Result：The content of IFN-γ in the observation group was lower than that in the control group，the content of IL-4 in the observation group was higher than that in the control group，the differences were all statistically significant（P

【Key words】 T helper lymphocyte； Functional change； Acute lung injury； Significance research

First-author’s address：The First People’s Hospital of Guangzhou City，Guangzhou 510180，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.25.005

目前認(rèn)為，促炎與抗炎反應(yīng)失衡為誘導(dǎo)急性肺損傷發(fā)生的根本原因，但目前對(duì)促炎與抗炎反應(yīng)失衡準(zhǔn)確評(píng)估有較大難度。大量研究表明，T輔助淋巴細(xì)胞可反映機(jī)體炎癥反應(yīng)的免疫功能狀態(tài)，其功能變化在急性肺損中的作用較大[1]。為了探討T輔助淋巴細(xì)胞的功能變化在急性肺損傷中的意義，本文選取100只小鼠作為研究對(duì)象進(jìn)行分析，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)小鼠均為野生鼷鼠的變種，來源于野生的小家鼠，選取100只小鼠作為研究對(duì)象。采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分成觀察組和對(duì)照組，每組50只，雌雄各半，體重20～24 g。兩組小鼠的一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 小鼠處理 首先為觀察組小鼠進(jìn)行適量脂多糖（LPS）的注射，其注射的部位主要在小鼠腹腔處，7.5 h之后再為小鼠注射適量的甲?；?苯丙氨酸，然后進(jìn)行急性肺損傷小鼠基本模型的制作，等到大約3.5 h之后將小鼠處死；對(duì)照組小鼠則進(jìn)行適量生理鹽水的簡(jiǎn)單注射，注射的量和觀察組小鼠藥物注射量相同。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 在對(duì)小鼠進(jìn)行有效處理之后，按照相關(guān)要求進(jìn)行小鼠脾細(xì)胞的正常分離，適量增添細(xì)胞培養(yǎng)液，利用顯微鏡觀察小鼠脾細(xì)胞的數(shù)量，然后對(duì)小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行稀釋處理，最終使其量控制在10×106個(gè)左右，加入適量的刀豆素，使其濃度控制在1.1 μg/mL左右，溫室溫度下及4.5%濃度的二氧化碳的環(huán)境下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)間在70 h左右，培養(yǎng)結(jié)束之后，留取細(xì)胞上清液，檢測(cè)上清液中的IFN-γ濃度及IL-4濃度，最后提取脾細(xì)胞中的RNA。

1.2.3 濃度測(cè)定 在檢測(cè)細(xì)胞當(dāng)中的相關(guān)因子濃度時(shí)，需要用到IFN-γ酶的專門吸附盒和IL-4酶的專門吸附盒，按照吸附盒上面的具體要求進(jìn)行細(xì)胞測(cè)定，利用酶標(biāo)儀對(duì)波長(zhǎng)500 nm的位置進(jìn)行密度檢測(cè)，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的變化規(guī)律，最終確定小鼠細(xì)胞當(dāng)中的具體因子濃度。

1.2.4 基因表達(dá)數(shù)量計(jì)算 利用PCR的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定試劑盒，進(jìn)行小鼠脾細(xì)胞當(dāng)中的基因轉(zhuǎn)錄，使其最終合成cDNA，然后進(jìn)行PCR的有效擴(kuò)增。對(duì)引物序列進(jìn)行正常排序，主要包括IFN-γ、IL-4以及β-actin的序列引物，它們分別有各自的上游引物和下游引物。經(jīng)過對(duì)引物圖像的觀察和分析進(jìn)行產(chǎn)物測(cè)量，對(duì)三大序列產(chǎn)物進(jìn)行正常掃描，確定出具體的光密度數(shù)值，最后進(jìn)行三大序列引物光密度數(shù)值的相互對(duì)比，從而測(cè)得基因表達(dá)。

1.2.5 損傷指標(biāo)檢測(cè) 首先進(jìn)行肺組織含水量的正常檢測(cè)，在處死小鼠以后，把小鼠的右肺進(jìn)行有效割除，進(jìn)行表面水清除之后進(jìn)行肺組織稱重，稱重之后放到專門烘箱當(dāng)中進(jìn)行有效烘干后稱重；然后進(jìn)行漏出量的具體檢測(cè)，在小鼠腹腔當(dāng)中進(jìn)行藥物注射，處死小鼠之后利用專用針進(jìn)行小鼠右心室的有效穿刺，利用適當(dāng)濃度的生理鹽水進(jìn)行小鼠肺部的清洗，使其完全干凈，切除小鼠的肺部相關(guān)組織，對(duì)肺門組織進(jìn)行正常稱重，進(jìn)行小鼠肺組織的孵育，孵育的時(shí)候要添加適量的甲酰胺，收集其浸出的液體，進(jìn)行液體吸光值的具體有效計(jì)算。對(duì)照組小鼠確定伊文思藍(lán)的具體濃度值；最后進(jìn)行小鼠肺組織的有效觀察，進(jìn)行肺下葉的正常染色，觀察其病理變化情況，利用相關(guān)分析軟件確定出細(xì)胞PMN的平均值。

1.3 觀察項(xiàng)目和指標(biāo) （1）小鼠上清液中IFN-γ的含量及IL-4含量；（2）脾細(xì)胞中IFN-γ的基因表達(dá)能力[2]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所得數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，以P

2 結(jié)果

觀察組小鼠上清液中IFN-γ的含量明顯低于對(duì)照組，IL-4含量明顯高于對(duì)照組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

3 討論

急性肺損傷是一種各種致病因素引發(fā)的廣泛肺泡毛細(xì)血管損傷，以致炎因子釋放、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、廣泛肺泡毛細(xì)血管損傷為特征，臨床以難以糾正的低氧血癥及進(jìn)行性呼吸困難為主要表現(xiàn)，急性嚴(yán)重肺損傷，在臨床被定義為急性呼吸窘迫綜合征[3]。如何對(duì)肺損傷過程中肺泡受損毛細(xì)血管保護(hù)并修復(fù)，是肺保護(hù)的重點(diǎn)。ALI的發(fā)生發(fā)展，由機(jī)體過度炎癥反應(yīng)參與介導(dǎo)[4]。危重病醫(yī)學(xué)會(huì)在2001年將機(jī)體過度炎癥反應(yīng)定義為全身炎癥反應(yīng)綜合征，其后果為破壞機(jī)體自身組織。機(jī)體內(nèi)源性抗炎癥反應(yīng)伴隨炎癥反應(yīng)的發(fā)生，呈增強(qiáng)趨勢(shì)[5]。Bone等[6]將此種抗炎癥反應(yīng)按抗炎癥反應(yīng)綜合征概括，其引發(fā)的后果是膿毒癥及免疫功能低下，故不管哪方占優(yōu)勢(shì)，ALI病發(fā)中，促炎及抗炎反應(yīng)失衡均為本質(zhì)原因。故針對(duì)檢測(cè)的促炎、抗炎反應(yīng)失衡的程度和方向，應(yīng)用不同的措施干預(yù)，使雙方動(dòng)態(tài)平衡恢復(fù)，是對(duì)ALI防治的關(guān)鍵。但對(duì)促炎、抗炎雙方平衡的相關(guān)性評(píng)價(jià)，目前臨床尚無有效評(píng)估指標(biāo)。有研究顯示，Th細(xì)胞，可反映雙方平衡關(guān)系，Th1細(xì)胞以對(duì)促炎細(xì)胞因子分泌為特征，與促炎反應(yīng)有密切相關(guān)性；Th2細(xì)胞以對(duì)抗炎細(xì)胞因子分泌為特征，與抗炎反應(yīng)有密切相關(guān)性[7-9]。IFN-γ、IL-4為特征性細(xì)胞因子，分別由Th1、Th2細(xì)胞分泌，二者平衡，可反映促炎和抗炎的平衡情況。

有研究示，取LPS、FNLP經(jīng)腹腔注射后，肺濕重與干重比、肺伊文斯藍(lán)浸出量、肺病理改變均提示成功建立ALI模型[10]。對(duì)脾細(xì)胞中IL-4、IFN-γ變化進(jìn)行觀察，結(jié)果相較對(duì)照組，BLAB/C小鼠在ALI時(shí)，脾細(xì)胞中IFN-γ呈近60%的下降，而檢測(cè)IL-4，呈4倍多的升高。此與蔣雄斌等[10]報(bào)道一致，但I(xiàn)L-4升高更為明顯。

IFN-γ、IL-4是反映Th1及Th2平衡變化的典型細(xì)胞因子，此種變化表明，在ALI發(fā)生時(shí)，Th1漂移至Th2。目前研究顯示，Th1飄移至Th2，與下列因素可能相關(guān)。（1）LPS結(jié)合單核巨噬細(xì)胞表面CD14受體，對(duì)TNFα、IL-1等炎癥細(xì)胞因子釋放，同時(shí)伴隨大量抑制介質(zhì)前列腺素E2的釋放，經(jīng)PGF2依賴性通道，促使Th細(xì)胞向Th2表型明確轉(zhuǎn)化。PGE2可對(duì)Th1合成IFN-γ、IL-2明顯抑制，卻對(duì)Th2生成IL-4不影響[11]。（2）與炎癥介質(zhì)IL-6、IL-1、TNF-α的釋放伴發(fā)，糖皮質(zhì)激素有增加表現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素可對(duì)Th1細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄抑制因子合成增加產(chǎn)生刺激，此因子與核因子結(jié)合，促使復(fù)合物形成，從而對(duì)炎癥細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄阻止[12]。此外，糖皮質(zhì)激素，可影響炎癥細(xì)胞因子相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄。

對(duì)脾細(xì)胞中的IFN-γmRNA表達(dá)進(jìn)一步觀察得出，ALI時(shí)IFN-γmRNA表達(dá)下降明顯，IL-4m RNA表達(dá)量顯著升高。提示ALI時(shí)，可在mRNA水平上使促炎細(xì)胞因子IFN-γ的表達(dá)抑制，抗炎細(xì)胞因子IL-4的表達(dá)增加，從而引發(fā)促炎、抗炎失衡。

Th1向Th2飄移，表明抗炎癥反應(yīng)在ALI發(fā)生時(shí)，呈增強(qiáng)趨勢(shì)，而抗炎癥反應(yīng)的增強(qiáng)，誘導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞免疫功能出現(xiàn)低下。故可通過對(duì)Th1、Th2平衡變化檢測(cè)，選擇適當(dāng)?shù)臅r(shí)機(jī)，針對(duì)免疫功能低下，采取有效的免疫調(diào)節(jié)措施，使促炎、抗炎平衡恢復(fù)，對(duì)ALI進(jìn)行防治。促炎與抗炎反應(yīng)失衡，為誘導(dǎo)急性肺損傷發(fā)生的本質(zhì)原因，對(duì)促炎與抗炎反應(yīng)失衡準(zhǔn)確評(píng)估有較大難度[13]。T輔助淋巴細(xì)胞可反映機(jī)體炎癥反應(yīng)的免疫功能狀態(tài)。

在受到嚴(yán)重的創(chuàng)傷之后，傷口是容易感染的，而在感染之后，傷口處容易出現(xiàn)各種病毒和細(xì)菌，會(huì)嚴(yán)重?fù)p害人們的身體健康。相關(guān)研究結(jié)果證明，急性肺損傷與體內(nèi)炎癥反應(yīng)不平衡相關(guān)，會(huì)導(dǎo)致機(jī)體促炎、抗炎反應(yīng)不平衡[14]。機(jī)體內(nèi)各類脾細(xì)胞當(dāng)中，存在很多促炎細(xì)胞和抗炎細(xì)胞，比如干擾素和白介素等，只有保證這兩種因子平衡，才能保證兩種細(xì)胞平衡[15]。當(dāng)發(fā)生急性肺損傷，機(jī)體炎癥反應(yīng)規(guī)律是不明確的，各種細(xì)胞的反應(yīng)情況也是不明確的，本文主要通過對(duì)急性肺損傷小鼠的功能試驗(yàn)研究，反應(yīng)急性肺損傷機(jī)體炎癥反應(yīng)情況。

相關(guān)研究結(jié)果表明，在急性肺損傷研究當(dāng)中，觀察機(jī)體炎癥反應(yīng)是比較重要的，因?yàn)樵诜螕p傷的過程中，會(huì)產(chǎn)生傷口感染從而引起傷口炎癥出現(xiàn)[16]。因此，通過肺損傷相關(guān)部位抗炎反應(yīng)及能力的檢測(cè)和觀察，就可以判斷急性肺損傷病情。本文主要通過小鼠淋巴細(xì)胞試驗(yàn)，對(duì)小鼠急性肺損傷的相關(guān)平衡因子和基因表達(dá)功能進(jìn)行檢測(cè)，最終發(fā)現(xiàn)，機(jī)體抗炎反應(yīng)在急性肺損傷中的作用非常大，而T輔助淋巴細(xì)胞對(duì)小鼠體內(nèi)這種抗炎反應(yīng)的調(diào)節(jié)和控制作用也比較大，在急性肺損傷疾病臨床研究中的意義比較大。急性肺損傷機(jī)體抗炎反應(yīng)主要表現(xiàn)為單核細(xì)胞的有效受體結(jié)合、抗炎因子的生成和細(xì)胞免疫因子的生成、IFN-γ和IL-4兩大因子的有效合成和轉(zhuǎn)化、IL-10因子的生成和增加、糖皮質(zhì)激素的不斷增加及脾細(xì)胞因子的異常轉(zhuǎn)錄等[17]。經(jīng)過對(duì)小鼠體內(nèi)T輔助淋巴細(xì)胞功能變化的有效觀察可以判斷急性肺損傷小鼠的病理學(xué)變化情況，急性肺損傷小鼠脾細(xì)胞mRNA表達(dá)能力比正常小鼠弱很多，證明抗炎反應(yīng)是導(dǎo)致急性肺損傷的主要原因。

本研究結(jié)果表明觀察組小鼠上清液當(dāng)中IFN-γ的含量明顯比對(duì)照組低，IL-4含量卻比對(duì)照組高，且經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄測(cè)定結(jié)果顯示，觀察組小鼠體內(nèi)脾細(xì)胞IFN-γ基因表達(dá)能力明顯比對(duì)照組低，以上比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

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篇9

【摘要】 目的 本研究檢測(cè)食管癌、賁門癌患者的免疫功能，尋找腫瘤患者的病情量化指標(biāo)，用來預(yù)測(cè)和判定臨床治療效果。方法 采集本院胸外科手術(shù)前的食管癌賁門癌患者115例及359例正常體檢者的血液標(biāo)本，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血T淋巴細(xì)胞表面CD3、CD4、CD8及NK細(xì)胞（CD56）的表達(dá)。結(jié)果 食管癌、賁門癌組與健康對(duì)照組相比較CD3、CD4有明顯下降（P＜0.05），而CD8、CD56有明顯的增高（P＜0.05）。將癌癥組分為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無淋巴轉(zhuǎn)移組，兩組間CD3、CD4、CD8、CD56的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 食管癌外周血T細(xì)胞免疫檢測(cè)有助于了解疾病的發(fā)展進(jìn)程。

【關(guān)鍵詞】 食管癌；賁門癌;T淋巴細(xì)胞亞群；NK細(xì)胞；CD3；CD4；CD8；CD56

現(xiàn)代腫瘤免疫學(xué)研究表明，腫瘤的發(fā)生和發(fā)展同機(jī)體免疫系統(tǒng)功能異常存在密切關(guān)系，而抗腫瘤免疫主要以細(xì)胞免疫為主，其中胸腺依賴性淋巴細(xì)胞即T淋巴細(xì)胞又是細(xì)胞免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分〔1〕。機(jī)體內(nèi)的T淋巴細(xì)胞能識(shí)別腫瘤細(xì)胞，在接受腫瘤細(xì)胞刺激后，轉(zhuǎn)化為能攻擊和殺傷腫瘤細(xì)胞的致敏淋巴細(xì)胞，有著免疫監(jiān)視機(jī)能。一旦這種監(jiān)視機(jī)能遭到破壞，患腫瘤的危險(xiǎn)就將增加。免疫功能正常與否，直接關(guān)系到腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后。因此對(duì)于T淋巴細(xì)胞的研究越來越受到免疫學(xué)界和醫(yī)學(xué)界的重視，成為近年來的研究重點(diǎn)。食管癌是目前我國(guó)發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，本研究就是通過對(duì)食管癌賁門癌患者外周血T淋巴細(xì)胞以及NK細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)，來探討食管癌賁門癌患者T淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞功能同食管癌賁門癌發(fā)生和發(fā)展的關(guān)系，以便臨床上監(jiān)測(cè)食管癌人群的免疫狀態(tài)，對(duì)其免疫治療具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

標(biāo)本來自河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院2006～2007年間搜集的115例食管癌患者，包含發(fā)生轉(zhuǎn)移56例，未發(fā)生轉(zhuǎn)移59例，患者平均年齡60歲，男87例，女28例。食管癌患者在采樣前均未經(jīng)手術(shù)、放療、化療等方法治療。正常體檢者血液標(biāo)本359例作為正常對(duì)照組，其中男151例，女208例，平均年齡53歲。采集靜脈血2 ml，EDTAK2抗凝。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞的免疫熒光標(biāo)記

取抗凝全血0.1 ml，加入鼠抗人單克隆CD3FITC/CD56PE，CD4FITC/CD8PE；雙標(biāo)記抗體20 μl，（美國(guó)，BECKMAN COULTER公司生產(chǎn)，克隆系CD4：13B8.2，CD8:B9.11），室溫孵育30 min。在免疫熒光制備儀上裂解紅細(xì)胞后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各亞群百分比。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)條件及參數(shù)

采用美國(guó)Beckman Coulter公司生產(chǎn)的EpicsXLⅡ型流式細(xì)胞儀，激發(fā)光源為15 mW氬離子激光器，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，應(yīng)用Expo 32 ADC進(jìn)行免疫熒光數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件包，進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié)果

免疫功能檢測(cè)結(jié)果：經(jīng)單因素方差分析發(fā)現(xiàn)4個(gè)指標(biāo)（CD3、CD4、CD8、CD56）在癌癥組與正常對(duì)照組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。將癌癥組分為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，經(jīng)單因素方差分析發(fā)現(xiàn)4個(gè)指標(biāo)（CD3、CD4、CD8、CD56）在兩組間均沒有差異(P＞0.05)，見表2。表1 癌癥組與正常對(duì)照組免疫指標(biāo)比較，表2 有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組間免疫指標(biāo)比較(略)

3 討論

惡性腫瘤作為一種免疫功能異常所導(dǎo)致的疾病得到了醫(yī)學(xué)界的廣泛共識(shí)，惡性腫瘤患者機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)作用及其效應(yīng)網(wǎng)絡(luò)大多處于一種相對(duì)紊亂的狀態(tài)，其中包括機(jī)體多種淋巴細(xì)胞、細(xì)胞因子、黏附因子及共同刺激因子等眾多因素中單個(gè)因素或多個(gè)因素的失衡，而細(xì)胞免疫的紊亂在腫瘤免疫中具有主導(dǎo)作用，因此近年來對(duì)于T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞等細(xì)胞免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞的研究已經(jīng)成為現(xiàn)代腫瘤免疫學(xué)研究的重點(diǎn)。CD3是成熟T淋巴細(xì)胞的共同分化抗原，表達(dá)于所有成熟T淋巴細(xì)胞的表面，代表組織和血液中總的成熟T淋巴細(xì)胞〔2〕。陳罡〔3〕等的研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌組織中，腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤特異性抗原刺激腫瘤特異性T細(xì)胞在腫瘤組織中聚集、成熟，使得肝癌組織中的CD3+T細(xì)胞數(shù)量明顯高于肝硬化組織及正常肝組織。馮偉華〔4〕等的研究顯示，在實(shí)體腫瘤和非實(shí)體腫瘤中患者外周血CD3+CD56T細(xì)胞測(cè)定值在實(shí)體腫瘤組顯著低于非實(shí)體腫瘤組和健康組，非實(shí)體腫瘤組和健康對(duì)照組間比較無顯著性差異。由于本次實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象為食管癌賁門癌，也是實(shí)體腫瘤的一種，加之又都是應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血，所以本文中CD3+的表達(dá)情況同馮偉華等的報(bào)道相一致。基于以上文獻(xiàn)的報(bào)道和本次試驗(yàn)的結(jié)果推測(cè)，食管癌賁門癌這類實(shí)體腫瘤患者的外周血CD3+T淋巴細(xì)胞數(shù)量較正常對(duì)照組顯著降低可能是由于惡性腫瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的腫瘤特異性抗原趨化CD3+T細(xì)胞向腫瘤組織中聚集并發(fā)育成為成熟的T淋巴細(xì)胞從而發(fā)揮其特有的抗腫瘤免疫的作用，因?yàn)檫@種聚集的作用，使得外周血中表達(dá)CD3的成熟T淋巴細(xì)胞的數(shù)量顯著減少。

CD56作為一種抗原標(biāo)志，是220 kD糖蛋白，存在于外周血淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞表面，而不存在于中性粒細(xì)胞上，在人體內(nèi)CD3-、CD16+、CD56+細(xì)胞的數(shù)量最多，約占外周血淋巴細(xì)胞總數(shù)的10%，表現(xiàn)出最強(qiáng)的NK細(xì)胞殺傷活性，CD3-、CD16-、CD56+細(xì)胞只占外周血淋巴細(xì)胞的5%以下，殺傷活性也較前一類細(xì)胞小〔5〕，本次試驗(yàn)的結(jié)果中顯示，食管癌賁門癌組患者外周血CD56+細(xì)胞的數(shù)量顯著多于正常對(duì)照組，將癌癥組分為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組后比較，雖然兩組間均值差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是轉(zhuǎn)移組較無轉(zhuǎn)移組高的結(jié)果同孫文輝〔6〕等的研究報(bào)道相一致，這一現(xiàn)象的產(chǎn)生可能是隨著腫瘤的進(jìn)一步發(fā)展，刺激人體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生更多的NK細(xì)胞參與抗腫瘤免疫，但是，NK細(xì)胞的成熟需要IL2的刺激，而惡性腫瘤病人尤其是轉(zhuǎn)移組mIL2R的結(jié)合表達(dá)率顯著降低，與腫瘤患者體內(nèi)存在封閉因子有關(guān)，隨著病情的進(jìn)展腫瘤本身產(chǎn)生的sIL2R可作為封閉因子與mIL2R競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合周圍的IL2，從而使與mIL2R結(jié)合的IL2減少，進(jìn)而降低了IL2的生物學(xué)作用〔7〕。因此，不能發(fā)育成熟的NK細(xì)胞無法到達(dá)腫瘤組織中，發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，而只能滯留在腫瘤患者的外周血中，造成食管癌賁門癌患者外周血表達(dá)CD56的細(xì)胞多于正常對(duì)照組。

CD4+Th細(xì)胞是人體抗腫瘤免疫的重要組成部分，它所產(chǎn)生的IL2、IL4、IL5、INFγ是諸如NK細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等重要的免疫細(xì)胞活化所必需的，另外CD4+Th細(xì)胞本身還可以通過INFγ介導(dǎo)的機(jī)制直接殺傷腫瘤細(xì)胞〔8〕，從以上的論述可以看出CD4+Th細(xì)胞在抗腫瘤免疫中的核心地位，所以CD4+Th細(xì)胞數(shù)量的減少和活性的降低有可能是機(jī)體抗腫瘤免疫功能下降的根基。

研究表明，T淋巴細(xì)胞活化需要2個(gè)信號(hào)，即T細(xì)胞活化不僅需要T細(xì)胞受體識(shí)別主要組織相容性復(fù)合物分子(第1信號(hào))，還需要抗原遞呈細(xì)胞(APC)表面的共刺激分子與其受體結(jié)合(第2信號(hào))的共同作用，而CD28這個(gè)廣泛表達(dá)于T淋巴細(xì)胞上的免疫蛋白超基因家族的成員正是扮演著這個(gè)第2信號(hào)的角色，CD8+T細(xì)胞根據(jù)CD28的表達(dá)與否分為細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CD8+ CD28+)和抑制性T細(xì)胞(CD8+CD28-)，前者是重要的殺傷效應(yīng)細(xì)胞而后者是不具有殺傷活性的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞。CD8+T細(xì)胞CD28表達(dá)受多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)，CD8+ CD28+T細(xì)胞的丟失和CD8+ CD28-T細(xì)胞積聚直接導(dǎo)致了CD8+T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞功能的下降，因而是T細(xì)胞功能下降的標(biāo)志〔9，10〕，這一觀點(diǎn)得到了臨床研究的證實(shí)〔11〕。

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篇10

【摘要】 目的： 觀察茶多酚對(duì)人γδt細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞活性的影響和誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞株（sw?480）凋亡和死亡的作用。方法： 在體外用不同濃度的茶多酚誘導(dǎo)人γδt細(xì)胞和sw?480細(xì)胞株，然后測(cè)定人γδt細(xì)胞殺瘤活性和對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用。用不同濃度的茶多酚分別誘導(dǎo)sw?480細(xì)胞4 h后，棄含有茶多酚的培養(yǎng)液再繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后測(cè)定其死亡和凋亡數(shù)，用γδt細(xì)胞作對(duì)照組。結(jié)果： 茶多酚濃度350 mg/l，作用γδt細(xì)胞4 h后能明顯增強(qiáng)γδt細(xì)胞的殺傷腫瘤細(xì)胞活性，與未誘導(dǎo)組和其他濃度組相比，p<0.01；γδt細(xì)胞對(duì)經(jīng)茶多酚處理后的sw?480細(xì)胞殺傷活性也明顯高于對(duì)照組（p<0.01）。各種濃度的茶多酚分別與γδt和sw?480細(xì)胞作用4 h，棄誘導(dǎo)液再繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，均能誘導(dǎo)其死亡和凋亡，在茶多酚濃度350 mg/l、誘導(dǎo)時(shí)間4 h時(shí)最明顯；同一濃度的茶多酚誘導(dǎo)sw?480細(xì)胞死亡和凋亡率明顯高于γδt細(xì)胞組。結(jié)論： 茶多酚在一定濃度時(shí)能明顯提高γδt細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷活性；經(jīng)茶多酚處理的sw?480細(xì)胞更易被γδt細(xì)胞殺傷。茶多酚濃度在350 mg/l時(shí)能誘導(dǎo)sw?480細(xì)胞凋亡而對(duì)人γδt細(xì)胞無影響。

【關(guān)鍵詞】 茶多酚； γδ淋巴細(xì)胞； sw?480細(xì)胞株； 抗腫瘤活性； 凋亡

［abstract］ objective: to observe cytotoxicity of γδt cell induced by tea polyphenols and the direct effects of tea polyphenols on human tumor cells sw?480 cell strain death and apoptosis.methods： γδt cells and sw?480 cell strain were induced by tea polyphenols in vitro to examine cytotoxic activity of γδt cell and its direct effects on tumor cells. sw?480 was induced by tea polyphenols continuously for 4 hours following being cultured without tea polyphenols for 24 hours, then the rate of death and apoptosis of sw?480 were measured. γδt cell was used as control group. results： cytotoxicity of γδt cell induced by tea polyphenols with concentration of 350 mg/l was significantly higher than that of control group and other groups(p<0.01). cytotoxicity of γδt cell on sw?480 induced by tea polyphenols was higher than the control group(p<0.01).after being induced by tea polyphenols continuously for 1～8 hours following cultured without tea polyphenols for 24 hours, sw?480 showed significant cell death and apoptosis in different concentration comparing with the control group. tea polyphenols did not display significant effects on γδt cell. conclusion： tea polyphenols can significantly enhance cytotoxicity of γδt cell and the sw?480 induced by tea polyphenols was easily killed by γδt cell. tea polyphnols in certain concentration can induce cell death and apoptosis of sw?480, while it appears no cytotoxicity to γδt cell.

［key words］ tea polyphenols； γδt cell； sw?480；antitumor activity；apoptosis

茶是備受人們喜愛的飲品之一，而在茶葉中最具有藥效作用的成分為茶多酚類物質(zhì)。眾多的體內(nèi)外研究及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，茶多酚有多種生物活性，其防癌抗癌、抗突變、抗氧化、抗衰老、抗菌等作用已有許多研究報(bào)道，在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡中也具有重要意義［1-3］。γδt細(xì)胞是體內(nèi)的固有免疫t細(xì)胞，它廣泛分布于消化系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)上皮組織內(nèi)；γδt細(xì)胞除了有與αβt細(xì)胞類似的一些功能特征外，識(shí)別抗原不需要mhc分子提呈，直接識(shí)別蛋白質(zhì)和肽類抗原以及非肽類抗原，有抗原提呈作用，能通過細(xì)胞接觸和分泌的細(xì)胞因子起免疫調(diào)節(jié)作用［4］。γδt細(xì)胞和茶多酚均具有抗消化道腫瘤作用，為了解兩者有無相關(guān)性，我們用茶多酚誘導(dǎo)人γδt細(xì)胞和人結(jié)腸癌細(xì)胞株，觀察在體外用不同濃度的茶多酚經(jīng)不同時(shí)間誘導(dǎo)的sw?480細(xì)胞死亡和凋亡情況，并觀察γδt細(xì)胞對(duì)sw?480殺傷活性的作用，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 材 料

茶多酚，從市售龍井茶中制備，茶多酚純度為77.0％； sw?480細(xì)胞株（上海細(xì)胞生物研究所）；胰蛋白酶、rpmi1640（gibco公司產(chǎn)品）；人ab血清（徐州市血站）；胎牛血清和淋巴細(xì)胞分離液（中國(guó)科學(xué)院血液病研究所）；異戊烯焦磷酸、四甲基偶唑藍(lán)(mtt)(isopentenylpgrophosphate，ipp)、二甲亞砜(dms0)（sigma公司）；il2（廈門特寶生物公司）；抗人tcrγδfitc購自杭州聯(lián)科生物（immunotech, france）；seac全自動(dòng)酶免系列分析儀(北京希亞克技術(shù)有限公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)bd公司的facscaliar)，分析軟件為cellquest，每個(gè)標(biāo)本分析細(xì)胞數(shù)≥1×104。

1.2 方 法

1.2.1 γδt細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定 按文獻(xiàn)［5］方法取健康獻(xiàn)血者末梢抗凝血10 ml,加入淋巴細(xì)胞分離液上，以2 000 r/min離心15 min，吸取單個(gè)核細(xì)胞層，用生理鹽水洗滌3遍（1 500 r/min離心，10 min/次），加入含10%小牛血清、5%人ab血清和ipp 3 mg/l的rpmi1640培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×108/l，置75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于37℃,50 ml/l co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況及時(shí)添加培養(yǎng)液。收集培養(yǎng)10 d的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)志檢測(cè)和其他試驗(yàn)。

1.2.2 茶多酚對(duì)sw?480和γδt細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 取培養(yǎng)10 d的γδt細(xì)胞和對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期sw?480細(xì)胞以每孔5×104個(gè)細(xì)胞分別接種于96孔板，用茶多酚(終濃度分別為100,200,400,800,1 600和3 200 mg/l)誘導(dǎo)，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞經(jīng)茶多酚誘導(dǎo)4 h后棄誘導(dǎo)液加入含10%小牛血清的rpmi 1640，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后加入mtt（5 mg/ml）20 μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，加入dmso 150 μl/孔?；靹蚝笤谌詣?dòng)酶標(biāo)閱讀儀上測(cè)各孔d值，根據(jù)測(cè)定數(shù)換算成抑制率。

1.2.3 γδt細(xì)胞和sw?480細(xì)胞凋亡檢測(cè) 取培養(yǎng)10 d的γδt細(xì)胞和對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期sw?480細(xì)胞以每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，用茶多酚(終濃度分別為100,200,400,800,1 600和3 200 mg/l)誘導(dǎo)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞經(jīng)茶多酚誘導(dǎo)4 h后棄誘導(dǎo)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄上清，sw?480細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞，γδt細(xì)胞直接收集，用rpmi 1640培養(yǎng)液洗滌3遍，加入70%冷乙醇固定，4℃過夜。pbs洗滌3次，加入pi染液(生理鹽水 129.6 ml，pi 10 mg，rna酶2 mg，tritonx?100 1 ml，枸櫞酸鈉200 mg，加雙蒸水至200 ml)，4℃避光染色30 min，用fcm檢測(cè)，記錄激發(fā)波長(zhǎng)488 nm處的紅色熒光。

1.2.4 γδt細(xì)胞殺傷活性檢測(cè) 取培養(yǎng)10 d的γδt細(xì)胞和對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期sw?480細(xì)胞均配成2×108/l，加入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔3 ml，培養(yǎng)24 h后加入不同濃度的茶多酚，同時(shí)設(shè)未加藥的對(duì)照組，繼續(xù)孵育24 h后，sw?480細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞和直接收集γδt細(xì)胞，用rpmi?1640培養(yǎng)液洗滌3遍，將靶細(xì)胞sw?480細(xì)胞配成2×108/l，效應(yīng)細(xì)胞γδt細(xì)胞配成2×109/l的懸液，用本室建立的乳酸脫氫酶釋放法［6］測(cè)定γδt細(xì)胞殺傷活性，將效靶細(xì)胞數(shù)按10∶1比例混合，以500 r/ min離心5 min，置37℃,50 ml /l co2培養(yǎng)箱中孵育6 h后，輕輕混勻細(xì)胞，再以1 500 r/min離心10 min。收集上清液在全自動(dòng)生化分析儀（olympus au1000）340 nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度值d）。

殺傷活性=實(shí)驗(yàn)組d值-效應(yīng)細(xì)胞自然釋放組d值靶細(xì)胞最大釋放組d值-靶細(xì)胞自然釋放組d值×100%

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用stata8.0軟件，數(shù)據(jù)以±s表示，用χ2檢驗(yàn)比較γδt細(xì)胞和sw?480細(xì)胞凋亡率有無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 γδt細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和純度鑒定

pbmc在γδt細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h即可見貼壁生長(zhǎng)，48 h后集落開始變大，培養(yǎng)10 d可見大的集落和單個(gè)貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞，單個(gè)細(xì)胞可見細(xì)胞呈條梭狀，也有小量呈浮懸生長(zhǎng)細(xì)胞。收集培養(yǎng)前后細(xì)胞進(jìn)行mab熒光標(biāo)記后經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)并分析結(jié)果。見圖1，培養(yǎng)前γδt細(xì)胞數(shù)為4.21%；培養(yǎng)10 d時(shí)γδt細(xì)胞數(shù)為70.35%。

圖1 pbmc 培養(yǎng)前后γδt細(xì)胞百分率表達(dá)（略）

fig 1 percentage of γδt cell and expression　before and after cultured by pbmc

2.2 不同濃度茶多酚誘導(dǎo)后的γδt細(xì)胞和sw?480細(xì)胞凋亡率

結(jié)果顯示，經(jīng)茶多酚誘導(dǎo)4 h棄誘導(dǎo)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，茶多酚濃度在350 mg/l時(shí)引起γδt細(xì)胞凋亡率為7.88%，顯著低于sw?480細(xì)胞（24.76%），見圖2。其他濃度均有明顯差異（表1）。

圖2 茶多酚在350 mg/l時(shí)誘導(dǎo)的γδt細(xì)胞和sw?480細(xì)胞株凋亡率（略）

fig 2 figure of apoptosis of γδt cell and sw?480 cell lines　which were induced by tea polyphenols(350 mg/l)

表1 不同濃度的茶多酚對(duì)γδt細(xì)胞和sw?480細(xì)胞凋亡的影響（略）

tab 1 effect of various concentration tea polyphenols on　the apoptosis of γδt cell and sw?480

a：與同一藥物濃度作用的γδt細(xì)胞比較， p<0.05；b：與同一細(xì)胞的對(duì)照組比較， p<0.05

2.3 茶多酚對(duì)γδt細(xì)胞和sw?480細(xì)胞株殺傷活性的影響

在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)經(jīng)茶多酚作用4 h時(shí)γδt細(xì)胞殺傷活性最高，因此本實(shí)驗(yàn)選擇該時(shí)間為作用時(shí)間。γδt細(xì)胞經(jīng)茶多酚(350 mg/l)作用后，殺傷sw?480細(xì)胞活性顯著高于其他濃度組，與對(duì)照組和其他濃度組相比較，p<0.01。結(jié)果見圖3。

圖3 茶多酚對(duì)γδt細(xì)胞殺傷活性的影響（略）

fig 3 effect of cyctotoxic activity of γδt cell

2.4 茶多酚對(duì)γδt細(xì)胞和sw?480細(xì)胞的抑制率

見圖4。茶多酚濃度在400 mg/l之內(nèi)對(duì)兩者均沒有明顯的影響，隨著濃度升高γδt細(xì)胞組死亡率顯著高于sw?480組，p<0.01，而sw?480變化不明顯。

圖4 不同濃度茶多酚對(duì)γδt細(xì)胞和sw?480的抑制率（略）

fig 4 effect of various concentration tea polyphenols　on the inhibitory tatio of γδt cell and sw?480

3 討論

茶多酚是茶葉中的主要成分，約占茶葉干重30％，具有防癌和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用。但其誘導(dǎo)不同的腫瘤細(xì)胞凋亡結(jié)果卻不相同，可能與其調(diào)控某些腫瘤細(xì)胞的致癌基因／抑癌基因的表達(dá)以及其他機(jī)理有關(guān)，如對(duì)c?fos和c?myc基因的調(diào)控上的差異，致使其對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和誘導(dǎo)凋亡上有所不同。其防癌作用主要是通過抗氧化和消除自由基，抑制亞硝基形成反應(yīng)，調(diào)節(jié)致癌原代謝酶等［4］。直接抗癌作用的研究近年來也有重大進(jìn)展，許多體外試驗(yàn)表明，茶多酚能抑制多種腫瘤細(xì)胞包括肺癌、腎癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、上皮細(xì)胞癌和黑色素瘤等的生長(zhǎng)［7-9］，甚至直接殺傷這些腫瘤細(xì)胞。

自1990年從肺癌腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（tils）中分離出γδτ細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞對(duì)新鮮的自體腫瘤細(xì)胞和k562細(xì)胞有高效殺傷活性以來，許多研究證實(shí)了在直腸癌、腎癌、肝癌、胃癌和乳腺癌等實(shí)體瘤的til中存在有γδτs細(xì)胞，并具有抗腫瘤作用［10-13］。

γδτ細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的機(jī)制與ctl細(xì)胞和nk細(xì)胞相似，主要通過穿孔素、顆粒酶和fas/fasl途徑起作用。然而γδτ細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別方式還不完全清楚，通常γδτ細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別大多數(shù)是mhc非限制性的，主要是通過nkg2d識(shí)別腫瘤細(xì)胞表達(dá)的mica,micb,ulbpi?3,mhcⅰb類蛋白和f1?atp合酶等配體。corvaisier等［14］研究也證實(shí)，對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別還與腫瘤細(xì)胞上γδtcr刺激物（如甲羥戊酸途徑代謝物?ipp）產(chǎn)生和icam?1表達(dá)密切相關(guān)。我們的實(shí)驗(yàn)也表明，從人外周血分離培養(yǎng)出的γδτ細(xì)胞對(duì)消化道系統(tǒng)常見腫瘤細(xì)胞均有較強(qiáng)的殺傷作用。zheng等［15］給已建立的鼻咽癌裸鼠注射正常人γδτ細(xì)胞兩次，每次5×107，可見腫瘤明顯縮小和生存期延長(zhǎng)，且與注射次數(shù)相關(guān)，免疫組化結(jié)果證實(shí)腫瘤內(nèi)有局部壞死，注射的γδτ細(xì)胞在瘤內(nèi)聚積。戴夢(mèng)華等［16］用人胰腺癌外周血經(jīng)抗人tcrγδτ單抗包被擴(kuò)增的γδτ細(xì)胞注入已建立胰腺癌的裸鼠腹腔內(nèi)，發(fā)現(xiàn)γδτ細(xì)胞具有顯著的抑瘤作用。朱憶期等［17］用自身外周血培養(yǎng)的γδτ細(xì)胞治療4例胃癌術(shù)后患者，隨訪10～25個(gè)月未見復(fù)發(fā)。γδτ細(xì)胞體內(nèi)應(yīng)用除直接殺傷腫瘤細(xì)胞外，還可以通過與nk細(xì)胞和dc相互作用以及釋放出抗腫瘤免疫中的關(guān)鍵分子ifn?γ來啟動(dòng)抗腫瘤免疫細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)來實(shí)現(xiàn)持續(xù)的抗腫瘤免疫應(yīng)答［18,19］。為了解茶多酚與人γδt細(xì)胞的關(guān)系，我們應(yīng)用茶多酚誘導(dǎo)人γδt細(xì)胞和sw?480細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)經(jīng)誘導(dǎo)的γδt細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性明顯增高，含量在350 mg/l時(shí)增高最為顯著，與對(duì)照組和其他濃度組比較均有顯著性差異，當(dāng)茶多酚濃度＜50 mg/l和＞500 mg/l時(shí)作用明顯降低。這一結(jié)果說明茶多酚對(duì)人γδt細(xì)胞的用量有一個(gè)最適濃度或“濃度窗”(concentration window)現(xiàn)象，這一點(diǎn)在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用時(shí)要加以注意。

本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，茶多酚在一定濃度和條件下能誘導(dǎo)sw?480細(xì)胞死亡和凋亡。我們用各種濃度的茶多酚在持續(xù)作用sw?480細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，作用時(shí)間達(dá)48 h，茶多酚的濃度增加至3 200 mg/l時(shí)均不能明顯誘導(dǎo)出sw?480細(xì)胞死亡和凋亡，此時(shí)對(duì)照組（γδt細(xì)胞）死亡率明顯增加；而作用1～8 h后再繼續(xù)培養(yǎng)24 h即能明顯致sw?480細(xì)胞死亡和凋亡?？赡茉蚴?，茶多酚影響了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)周期，使腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)阻滯在g0／g1［20］，當(dāng)除去誘導(dǎo)劑后，細(xì)胞開始增殖，受損的細(xì)胞逐漸死亡。另外，由于茶多酚中混有多種成分，可能有的成分能誘導(dǎo)sw?480細(xì)胞死亡或有凋亡的信號(hào)，而有的成分能阻斷其作用，待將茶多酚成分洗棄后，這些死亡或凋亡信號(hào)繼續(xù)作用而致細(xì)胞死亡和凋亡。因此要搞清其機(jī)理，有必要篩選出茶多酚粗提物中的確切有效成分。

以上結(jié)果表明，茶多酚可以誘導(dǎo)sw?480細(xì)胞死亡和凋亡,茶多酚持續(xù)作用不如短時(shí)作用后棄誘導(dǎo)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h對(duì)sw?480細(xì)胞致死和凋亡作用明顯。γδt細(xì)胞經(jīng)茶多酚作用4 h后能明顯提高其對(duì)sw?480細(xì)胞的殺傷活性，提示茶多酚對(duì)消化系統(tǒng)大量存在的γδt細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞功能有增強(qiáng)作用。然而茶多酚誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡、凋亡和提高γδt細(xì)胞殺傷性機(jī)理仍不十分清楚。是否與其抑制sw?480細(xì)胞多聚酶作用［21］和誘導(dǎo)其凋亡有關(guān)還是其他因素致使γδt細(xì)胞對(duì)sw?480細(xì)胞殺傷易感性增加所致仍有待研究。因此，開展這方面研究對(duì)茶多酚藥用價(jià)值的開發(fā)和臨床應(yīng)用具有重要意義。

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