導語：如何才能寫好一篇流式細胞儀，這就需要搜集整理更多的資料和文獻，歡迎閱讀由公務員之家整理的十篇范文，供你借鑒。

篇1

關鍵詞：流式細胞儀；科研平臺；使用現(xiàn)狀

流式細胞術（FlowCytometry，F(xiàn)CM）是一門綜合了激光技術、計算機技術、半導體技術、流體力學、細胞化學等多種學科知識的自動分析技術[1]，即利用流式細胞儀結合定量熒光細胞化學方法、單克隆抗體和免疫熒光染色原理和技術，對處在快速直線流動狀態(tài)中的生物顆粒，比如各種細胞、微生物及人工合成微球等的多種參數(shù)（包括細胞大小、內部結構、DNA和RNA含量、細胞表面或胞內蛋白質分子的表達等）進行測量和分析，是當代最先進的細胞定性、定量分析以及細胞分選技術。近年來，隨著流式細胞術的不斷發(fā)展和完善，其應用領域已經(jīng)從最初的細胞生物學基礎研究擴大到現(xiàn)如今的腫瘤學、血液學、免疫學、藥物學、臨床檢驗等各個方面[1]。本研究以某醫(yī)學院?？蒲衅脚_流式細胞儀為分析對象，對其近3年來學生（包括本科生和研究生）使用人次和測試樣品數(shù)加以統(tǒng)計，分析其使用現(xiàn)狀，并對現(xiàn)存問題提出建議。

1流式細胞儀使用現(xiàn)狀

學?？蒲衅脚_于2013年購入一臺BD公司的FACSVerse型流式細胞儀，是一臺分析型流式細胞儀，藍、紅、紫三激光配置，配套BDFACSuite軟件系統(tǒng)。對2017—2019年該臺流式細胞儀的學生使用人次和測試樣品數(shù)進行統(tǒng)計，如表1—2所示。從表1中可以看出2017—2019年學生使用流式細胞儀的人次和測試樣品數(shù)逐年升高，從表2中可以看出使用人次增長率從2018年的67.74%提高到2019年的107.69%，測試樣品數(shù)增長率從2018年的81.48%提高到2019年的137.87%，增幅明顯。這些數(shù)據(jù)說明近年來流式細胞儀的利用率明顯提高，越來越多的學生（包括本科生和研究生）能夠學習、了解流式細胞術，并在日常科研活動中使用流式細胞儀，有效促進了學校的人才培養(yǎng)。

2使用現(xiàn)狀分析

近年來，高等學校越來越重視本科生的科研能力培養(yǎng)。除了研究生參與科研活動，隨著本科生課題申請量的增多，比如可以申請國家級、省級和校級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目等，越來越多的本科生也參與到科研活動中。此外，學校還會成立科研興趣小組，在老師的帶領下，本科生在完成基礎課程學習之余，加入到老師所在實驗室的科研工作中，參與科學研究的熱情高漲，大大提高了自身的基礎科研能力和科研實踐水平。一方面，可以使本科生增強對課題學習的理解，使其受到早期科研訓練，另一方面，可以增強其接受研究生教育的能力和信心，有助于本科生順利進入研究生階段的學習[2]。目前，流式細胞術作為細胞分析和分選的重要技術，在醫(yī)學基礎研究、臨床診斷及相關科學研究中廣泛應用[3]，已進入科研及臨床工作的各個方面，貫穿于基礎研究及臨床檢驗等多方面。在醫(yī)學院校，培養(yǎng)一名醫(yī)學生，不僅要使其掌握醫(yī)學基本知識與臨床技能，還要使其掌握醫(yī)學發(fā)展最新動態(tài)，了解醫(yī)學相關的最新技術手段，不斷增加知識儲備量。但在目前的醫(yī)學生培養(yǎng)過程中，還沒有系統(tǒng)地開設流式細胞術相關課程，學生在科研及臨床檢驗中對流式細胞術的檢測原理、應用范圍及數(shù)據(jù)分析等并不了解，限制了流式細胞術在科研及臨床工作中的應用及普及[4]。近年來，皖南醫(yī)學院每年開展大型儀器實驗技術培訓，培訓對象為本科生、研究生及教師，旨在進一步加強廣大師生對學校大型儀器設備的了解，提高校內科研人員的儀器設備使用水平，為更好地開展科學研究工作打下良好的基礎。培訓本著以教促學、示范促用的基本原則，以學校常用大型科研儀器的操作與應用為主要內容，通過理論講座對每臺儀器的原理、構成、應用范圍等方面進行詳細介紹，并結合現(xiàn)場講解、全流程操作演示等環(huán)節(jié)，加深對儀器的認識，了解操作規(guī)范。通過此類培訓，廣大師生能夠進一步了解學校大型儀器設備資源，有更多機會與實驗室技術人員進行直接、積極的溝通，共同促進了師生與實驗技術人員自身技術水平的提高，進一步提升了學?？蒲许椖康某休d能力和實驗室的服務水平，促進了學校的人才培養(yǎng)。在培訓中以BDFACSVerse型流式細胞儀為例，首先，以PPT理論形式向師生介紹流式細胞儀的基本結構、工作原理、儀器操作等內容，并結合皖南醫(yī)學院流式細胞儀應用實際舉例，介紹其在細胞凋亡、細胞周期、線粒體膜電位、細胞內活性氧、細胞表面分子標記等檢測中的應用，使師生對其有初步了解。其次，理論培訓結束后，進入實驗室進行上機操作，向師生演示如何進行開關機、儀器質控、方案建立、電壓調節(jié)、熒光補償調節(jié)、樣品收集、數(shù)據(jù)獲取與分析、儀器保養(yǎng)與維護等。將流式細胞術相關知識融入到大型儀器實驗技術系列的培訓中，使學生對流式細胞術的原理、操作步驟和應用范圍有了基本了解，激發(fā)了學生的學習興趣，啟發(fā)其帶著自己研究課題中或參加的科研活動中實際遇到的問題或可能會遇到的問題來學習和運用這門技術，為今后的相關課程學習和實際應用奠定良好的基礎[5]。由于皖南醫(yī)學院是一所醫(yī)學院校，在培訓中著重介紹流式細胞術在基礎醫(yī)學相關領域和臨床檢驗中的應用，使學生有了更直觀的了解，大大調動了其鉆研科研的熱情，使其能夠更好地理解和掌握先進科學技術的原理及應用，積極主動地參與到科研活動中，不僅最大限度地發(fā)揮了現(xiàn)有儀器設備的資源優(yōu)勢和師資特長，還使學生接受了最好的專業(yè)訓練[6]，使學生在畢業(yè)后走上工作崗位時能夠更快、更好地適應工作需要。

3結語

由于流式細胞儀單價較高，學校擁有流式細胞儀的教研室較少，并且無專人操作，導致儀器使用率偏低。學?？蒲衅脚_自購入流式細胞儀以來，專人專管該儀器，與其他教研室相比，流式細胞儀使用頻率相對較高；隨著后期儀器實現(xiàn)資源優(yōu)化，開放共享力度加大，會有更多的學生參與到科研中，可以進一步提高流式細胞儀的使用率，更大限度地發(fā)揮儀器自身的價值。目前，該科研平臺流式細胞儀主要應用于細胞凋亡、細胞周期、活性氧、線粒體膜電位、細胞表面標志等方面的檢測，今后隨著師生科研水平的提高以及承擔的科研項目數(shù)量的增多，儀器使用率會進一步提高，儀器應用范圍會得到進一步擴大，而不局限于以上檢測范圍。此外，目前學校流式細胞儀主要應用于科研方面，在教學方面使用得較少，今后如何有效地將流式細胞儀與教學聯(lián)系起來，在教學中涉及流式細胞術的知識，激發(fā)學生對相關課程的學習興趣，提高流式細胞儀在教學中的利用率，是下一步要探討的問題。

[參考文獻]

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篇2

【關鍵詞】兒童；B淋巴細胞性白血??；免疫分型；流式細胞儀

Immunophenotype of acute B-lineage lymphoblastic leukemia in children by flow cytometry

WANG Yi-lin,SUN Li-rong.The Medical Shchool Hospital of Qingdao University,Qingdao 266003,China

【Abstract】 Objective To investigate the value of detecting immunophenotypes by flow cytometry(FCM) in B-lineage acute lymphoblastic leukemia (B-ALL) and discuss the relationship between immunophenotype and outcome.Methods 39 children with B- ALL were enrolled at diagnosis and immunophenotypes were detected by FCM.Gating was performed using the CD45-SSC plot.Various combinations with two monoclonal antibodies among CD19,CD10,CD20 and CD22 were analyzed with three-color stainings.CD33 and CD13 were used as myeloid antibodies for B-ALL with myeloid markers.2 groups were divided by myeloid markers.Results ①The positive rates of CD19,CD22 and CD10 were 94．87%,92．31%,and 87．18% respectively.The positive rates of CD20 was only 15．38%.CD13 and CD33 were expressed in 33．33% children with B-ALL,in which 8 cases of CD13 positive and 5 cases of CD33 positive were included.②There are 6 patiens relapse.There were no significance between 2 groups by Fisher’s Exact Test( P>0．05).Conclusion ①Flow cytometry can be used to detect immunophenotypes in the majority of children with B-ALL.②Myeloid markers in acute B-ALL are not the risk factors of relapse.

【Key words】Children；B-lineage Leukemia；Immunophenotype；Flow cytometry

白血病免疫分型是對形態(tài)學分型的重要補充和進一步深化，隨著兒童急性白血病治療的進展，其免疫分型越來越受到重視，國際白血病MIC分型協(xié)作組認為免疫分型對每一例急性白血病都是必不可少的。為了發(fā)現(xiàn)兒童急性B淋巴細胞白血病（B-ALL）免疫表型的特點及與預后的關系，我們利用流式細胞儀對39例急性B淋巴細胞白血病患兒的免疫表型進行分析，并對其治療結果動態(tài)隨訪?，F(xiàn)報告如下。

1 材料和方法

1．1 病例 選擇我院2002年9月至2007年1月初診的B-ALL患兒共39例，年齡1歲4個月~12歲，中位年齡7歲，其中男27例，女12例，其中L1 10例，L2 28例，L3 1例，隨訪時間3~50個月，平均隨訪時間 16．87個月。

1．2 主要設備與試劑 流式細胞儀為美國BeckmanCoulter公司生產(chǎn)，儀器型號：EPICS-XL。所有單克隆抗體（McAb）均購自法國Immunotech公司。

1．3 檢測方法 采用直接免疫熒光標記法，每種單抗20 μl，各加入100 μl 肝素抗凝的骨髓，室溫避光，溶解紅細胞，PBS洗滌，離心，加入500 μl PBS，上機檢測。采用CD45-SSC設門，用Elite 4．5軟件進行分析，同時以異硫氰酸熒光素（FITC）、藻紅蛋白熒光素（PE）、多甲藻素葉綠蛋白（PerCP）熒光素標記的無關同型IgG1亞類作為陰性對照。不同的抗體組合及不同的患者標本都用同一設定的條件檢測，收集每管中的全部細胞。

1．4 資料分析 所有樣本均在EPICS- XL流式細胞儀上檢測，CD45-SSC設門將被檢測細胞群分為4個區(qū)域：R1(淋巴細胞門)、R2(原始細胞門)、R3(成熟粒細胞門)、R4(單核細胞、巨核細胞門)，使用Elite 4．5軟件對R2門內的細胞進行分析，同時在CD19、CD10、CD20和CD22中選擇兩個單克隆抗體（McAb）組合，進行三色組合分析，確定免疫表型，≥20％為陽性。

1．5 統(tǒng)計學處理方法 χ2檢驗精確概率法。

2 結果

2．1 各種單克隆抗體陽性發(fā)生率 39例急性B-ALL患兒中，CD19、CD22、CD10的陽性率都超過或接近90%，說明此3種McAb是B-ALL患兒最普遍的表達標志。同時有33．33%的患兒檢測到髓系抗原（My）標志，其中以CD+13 8例，CD+335例。見表1。

2．2 復發(fā)病例 共有6例患兒復發(fā)，其中有3例患兒伴有髓系表達，見表2。經(jīng)χ2精確概率法檢驗分析，P>0．05。說明B-ALL患兒是否伴有髓系表達與復發(fā)無關。見表2。

3 討論

近年來,隨著FCM技術的不斷發(fā)展以及大量細胞表面分化抗原和胞漿內抗原單克隆抗體(MaAb) 的研制成功,用FCM 進行免疫表型分析已成為鑒別正常細胞和白血病細胞的重要手段[1]。

CD45為白細胞共同抗原，在細胞表面的表達量與細胞分化程度有關。原始細胞表達量比成熟細胞低，幼紅細胞不表達。用兩個系列或分化階段特異性McAb加CD45進行三色免疫熒光染色后，根據(jù)細胞的顆粒性與CD45表達量的不同，用SSC/CD45雙參數(shù)設門，十分容易鑒別骨髓和血液中的原始或成熟細胞，可特異地分析原、幼白血病細胞的免疫表型而不受成熟細胞的干擾，大大增強了白血病免疫分型的準確度與靈敏度[2]。

研究表明,細胞表面所表達的抗原表明該細胞處在不同的分化過程中的特殊階段[3]。正常B 淋巴細胞分化過程中細胞表面分子出現(xiàn)的先后順序大致為CD19、CD10、CD22、CD20、Cμ、SmIg,依此可判斷B系ALL 的分化階段。B-ALL細胞發(fā)育與正常B細胞基本相似[4,5]。我們采用從原B細胞至成熟B細胞出現(xiàn)頻率高有一定代表性的CD10、CD19、CD20、CD22和HLA-DR等作為常規(guī)表型檢測，對其結果進行分析，可基本確定被測B細胞所處的發(fā)育階段。

本組B系ALL系列相關抗體CD19具有高敏感性（陽性率達94．87%）,CD22陽性率也達到92．31%，可以看出兩者不失為B系ALL的良好標志。CD10的陽性率亦高達87．18%，與國外文獻報道的CD10的陽性率 10%～50%[6，7]，Thalhmmer等[8]認為CD10 不是B細胞系列相關抗體。造成這種國內外B-ALL表型表達的差別，可能與地區(qū)和人種不同有關。本組CD20的陽性率只有15．38%，說明CD20的敏感性差，且文獻報道CD20在T-ALL時也有42．9%陽叉表達。所以利用 CD45及SSC設門，CD19/CD22/CD10中選擇兩個單克隆抗體組合，可有效分析國內兒童急性B淋巴細胞性白血病的免疫表型。

細胞免疫表型分析在白血病診斷中的突出優(yōu)點之一是能區(qū)分伴有髓系抗原的ALL。本組有33．33%的患兒同時伴有髓系的表達，以CD33和CD13常見。與國內報道的18%～34．9%[9，10]相符。而國外多報道在5%～16%[11，12]。My+ ALL 的文獻報道結果迥異其可能原因包括:抗體組合不同,抗體組合多則較易發(fā)現(xiàn)交叉系列抗原的表達；使用的染色方法或熒光素不同,如PE標記的抗體較FITC 標記的抗體有更高的敏感性等[13]。我們的結果顯示ALL患兒髓系抗原表達率為33．33%。雖然兒童ALL 免疫分型與其預后相關,但是ALL 伴髓系抗原表達與預后的關系迄今尚無定論。本組患兒通過四格表精確概率法分析，發(fā)現(xiàn)伴有髓系抗原表達的B-ALL，其復發(fā)率與無髓系抗原表達患兒的復發(fā)率差異無統(tǒng)計學意義。國內王菊香等[10]報道My+ ALL 與My- ALL 患兒相比,其對化療的早期反應以及復發(fā)率等均差異無統(tǒng)計學意義。國外BM F90 協(xié)作組大樣本研究認為My+ ALL 和My- ALL 的治療效果及預后相同[14]。因此,ALL患兒髓系抗原表達對于其不良預后無提示意義。

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篇3

【關鍵詞】流式細胞術；臨床；進展

流式細胞術(flowcytometry,FCM)是20世紀70年展起來的對單細胞定量分析的一種新技術。它借鑒了熒光標記技術、激光技術、單抗技術和計算機技術,具有極高的檢測速度與統(tǒng)計精確性,而且從單一細胞可以測得多個參數(shù),為生物醫(yī)學與臨床檢驗提供了全新視角和強有力手段[1]。目前,隨著單克隆抗體技術的發(fā)展,流式細胞儀檢測技術已經(jīng)廣泛使用在基礎研究和臨床實踐的各個方面,發(fā)揮著重要作用。本文就其在臨床上的應用綜述如下。

1 流式細胞術在免疫學中的應用

FCM可以進行淋巴細胞亞群分析,可同時檢測出一種或幾種淋巴細胞表面亞群分析,將不同的淋巴細胞亞群區(qū)分開來,并計算出它們相互間的比例。通過對患者淋巴細胞各亞群數(shù)量的測定了解淋巴細胞的分化功能,鑒別新的淋巴細胞亞群。更重要的是通過研究大多數(shù)疾病的特異性淋巴細胞亞群或某些細胞表面標志的存在、缺乏、過度表達等,對一些疾病,如免疫性疾病、感染性疾病、腫瘤等診斷、治療、免疫功能重建和器官移植監(jiān)測等有重要的臨床意義。如HIV主要侵襲CD4+T細胞而導致CD4淋巴細胞減少,CD4/CD8淋巴細胞比值下降,為艾滋病的診斷和治療提供依據(jù)[2]。在其它免疫功能性疾病的診治方面如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者的淋巴細胞變化可反映該病的活動情況和器官侵犯程度,伴有嚴重腎臟損害的SLE患者可出現(xiàn)低CD4+、高CD8+的現(xiàn)象[3]。此外,FCM可以用來進行組織相容性抗原(HLA)群體分析;HLA-B27抗原陽性與強直性脊柱炎等一系列關節(jié)病有著不同程度的正相關。FCM應用HLA-B27特異性單抗檢測抗原，其敏感性較傳統(tǒng)的微量細胞毒性實驗大大提高,同時多參數(shù)的熒光測定使我們能夠在特定的細胞亞群中分析HLA-B27[4-5],還可以利用FCM進行移植配型移植后免疫狀態(tài)監(jiān)測。

2 流式細胞術在血液學中的應用

血液系統(tǒng)腫瘤的診斷和治療 FCM通過對外周血細胞或骨髓細胞表面抗原和DNA的檢測分析，對白血病、淋巴瘤等各種血液病的診斷、預后判斷和治療起著舉足輕重的作用。FCM采用各種抗血細胞表面分化抗原的單克隆抗體，借助于各種熒光染料測定一個細胞的多種參數(shù)，以正確地判斷出該細胞的屬性。各種血細胞系統(tǒng)都具有其獨特的抗原，當形態(tài)學檢查難以區(qū)別時，免疫表型參數(shù)對各種急性白血病、淋巴瘤的診斷和鑒別診斷有決定性作用，其診斷的準確性可達到90%左右[5]。微小殘留病變(MRD)是白血病復發(fā)的主要根源,FCM能在患者緩解期檢測是否有殘留病變細胞，及早發(fā)現(xiàn)后采取措施避免復發(fā)。而且測定 DNA倍體和進行細胞周期分析對指導白血病化療也有一定作用，不同的白血病患者或同一患者在不 同病期白血病細胞增殖狀況不同，定期了解細胞增殖情況采取相應藥物可以提高療效。急性白血病的多耐藥基因(MDR)也常用FCM檢測，F(xiàn)CM特有的敏感性和特異性，用于檢測二氨基苯茚酮 mRNA的表達產(chǎn)物 P糖蛋白(Pgp)及其活性(作為藥物的排出泵，降低細胞內藥物濃度)，可以更直接的反映耐藥程度。陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥(PNH)是一種造血干細胞克隆病,細胞 CD55、CD59抗原表達減低是該病的一個特點。FCM采用熒光標記的單克隆抗體對血細胞 CD59的表達做定量分析，可以協(xié)助臨床做出診斷并判斷疾病的嚴重程度。網(wǎng)織紅細胞計數(shù)是反映骨髓造血功能的重要指標。FCM通過某些熒光染料(吖啶橙等)與紅細胞中 RNA結合，定量測定網(wǎng)織紅細胞中 RNA，得到網(wǎng)織紅細胞占成熟紅細胞的百分比。有報道認為[6]FCM比目測法的精確度更高。此外，F(xiàn)CM還可以測量出網(wǎng)織紅細胞的成熟度，對紅細胞增殖能力的判斷很有意義，為干細胞移植術后恢復的判斷、貧血的治療監(jiān)測、腫瘤患者放、化療對骨髓的抑制狀況等提供了依據(jù)。造血干/祖細胞計數(shù)造血干/祖細胞具有自我復制和多向分化潛能，是各種血細胞和免疫細胞的始祖。造血干/祖細胞計數(shù)對造血干細胞移植意義重大。CD34抗原是早期造血干/祖細胞的表面標志，應用 FCM分析、計數(shù) CD34 細胞已成為造血干/祖細胞移植、造血重建的重要指標。由于血小板的活化程度可由血小板膜糖蛋白的表達水平的高低來判斷,FCM測定血小板膜糖蛋白的表達情況可以診斷血小板膜糖蛋白異常所致疾病,這類疾病很少見但病因明確,主要是GpⅡb/Ⅲa或GpⅠb/Ⅸ/Ⅴ缺陷所致?；颊哐“迥pⅡb/Ⅲa的缺乏,導致血小板聚集功能明顯低下,這就是常染色體隱性遺傳病-血小板無力癥。而巨血小板綜合征是由于GpⅠb/Ⅸ/Ⅴ復合物數(shù)量或質量的缺陷導致的遺傳性出血性疾病。FCM還可以通過單抗免疫熒光標記血小板膜糖蛋白監(jiān)測血小板功能及活化情況,評價活化血小板程度在血栓性疾病和血栓前狀態(tài)發(fā)生發(fā)展中的作用,有利于血栓栓塞性疾病的診斷和治療,此外血小板活化時細胞內的鈣離子濃度是活化血小板監(jiān)測的一項非免疫性指標,免疫性血小板減少性紫癜患者血漿中可產(chǎn)生血小板自身抗體,結合在血小板表面,稱為血小板相關抗體,檢測血小板表面或血清中的相關抗體,可用于該病的診斷及治療監(jiān)測[7]。

3 流式細胞術在腫瘤學中的應用

FCM在腫瘤學中的應用主要是利用DNA含量測定進行包括癌前病變及早期癌變的檢出、化療指導以及預后評估等工作,FCM可精確定量DNA含量,能對癌前病變的性質和發(fā)展趨勢做出判斷,有助于癌變的早期診斷[6]。首先需要把實體瘤組織解聚、分散制備成單細胞懸液,用熒光染料(碘化吡啶P1)染色后對細胞的DNA含量進行分析,將不易區(qū)分的群體細胞分成三個亞群(G期、S期、G2期),DNA含量直接代表細胞的倍體狀態(tài),非倍體細胞與腫瘤惡性程度有關。DNA非整倍體細胞峰存在可為腫瘤診斷提供有力依據(jù)[6]。腫瘤細胞DNA倍體分析對患者預后的判斷亦有重要作用。異倍體腫瘤惡性病變的復發(fā)率、轉移率及死亡率均較高,而二倍體及近二倍體腫瘤的預后則較好。FCM不僅可以對惡性腫瘤DNA含量進行分析,還可根據(jù)化療過程中腫瘤DNA分布直方圖的變化去評估療效,了解細胞動力學變化,對腫瘤化療具有重要的意義。臨床醫(yī)師可以根據(jù)細胞周期各時相的分布情況,依據(jù)化療藥物對細胞動力學的干擾理論,設計最佳治療方案。從DNA直方圖直接地看到腫瘤細胞的殺傷變化,及時選用有效的藥物對腫瘤細胞達到最大的殺傷效果。

4 流式細胞術在細胞凋亡和多藥耐藥基因中的應用

細胞凋亡是機體生長發(fā)育、細胞分化和病理狀態(tài)中細胞死亡的過程,凋亡典型的形態(tài)特征是核染色質固縮并分離,細胞質濃縮,細胞膜和核膜皺曲,核斷裂形成片斷,最后形成數(shù)量不等的凋亡小體。FCM可以進行DNA含量分析,通過二倍體細胞G0/G1期峰前的亞二倍體峰來確定。在凋亡早期,一些與膜通透性改變及凋亡有關的蛋白在細胞膜表面有特定表達。通過FCM結合單克隆抗體可以檢測表達這些蛋白的細胞,從而確定細胞的凋亡情況。多重耐藥性(multidrugresistance,MDR)是由多藥耐藥基因編碼的P糖蛋白(P-gp)親脂化合物,包括多種抗癌藥物和熒光染料的跨膜性排出泵。從人淋巴細胞排除熒光染料與細胞內P-gp的含量直接相關。當淋巴細胞出現(xiàn)MDR陽性細胞時,患者對化療藥物開始出現(xiàn)耐藥性,需要考慮其它治療方式。多藥耐藥是腫瘤患者化療失敗的主要原因,FCM對多藥耐藥基因(如P170)和凋亡抑制基因及凋亡活化基因表達的測定,可為臨床治療效果分析提供有力依據(jù)[8]。

5 流式細胞術在器官移植中的應用

FCM在器官移植中占有重要地位,可被用來判斷供者與受者之間是否合適,用來鑒別和定型同種異體反應抗體[6]。通過供者白細胞和受者的血清共同孵育,如果受者血清中存在針對供者的循環(huán)抗體,就會同供者的淋巴細胞結合,再加入熒光素標記的二抗來顯示這種結合,此方法能在移植手術前發(fā)現(xiàn)高風險的受體。移植后免疫表型的監(jiān)測也很重要。FCM可用于檢測移植后血液或移植內免疫成分的變化,以預防移植后免疫

排斥反應,細胞免疫抑制治療效果和移植存活情況,可敏感地預測排斥反應的發(fā)生,為臨床治療提供有效依據(jù)。

6 流式細胞術在臨床細菌學中的應用

流式細胞術在臨床細菌學中的應用具有快捷、靈敏,能同時進行多參數(shù)分析等優(yōu)點,可廣泛用于細菌、病原體、毒素和血清抗體及藥敏試驗。免疫熒光檢測方法中的流式微球分析(CBA)是FCM的一個新應用。這種方法也可用于真菌、寄生蟲、病毒以及這些病原體的混合感染的檢測。近年來,FCM與熒光染料的聯(lián)合運用可判斷細菌的活力和功能狀態(tài),由于速度快,該方法已被建議作為臨床實驗室的常規(guī)藥敏試驗。FCM藥敏檢測方法較多,通過測量加入藥物孵育后的散射光的DNA含量來判斷抗生素對細菌的敏感性。該法現(xiàn)被認為是FCM在該領域應用的經(jīng)典方法[6]。

7 FCM在細胞生物學中的應用

在細胞周期內,DNA含量隨時相發(fā)生周期性的變化,通過熒光探針對細胞進行相對DNA含量測定,可分析細胞周期各時相細胞的百分比,周期動力學參數(shù)以及DNA異倍體?？衫门c鈣離子特異結合的熒光染料和激發(fā)光譜或發(fā)射光譜是pH值依賴熒光染料進行細胞內鈣離子濃度測定和細胞內pH值測定[9]。

8 流式細胞術在優(yōu)生遺傳領域中的應用

流式細胞術可使含量極微的胎兒有核紅細胞得到富集,因為有核紅細胞含有胎兒的全部基因,并具有不影響多胎妊娠等優(yōu)點,結合FISH,PCR等技術,使之具有應用于無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷的廣闊前景[10]。

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篇4

[關鍵詞] 流式細胞術；細胞形態(tài)學；腦脊液；中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病

[中圖分類號] R725.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2016）10（b）-0042-03

[Abstract] Objective To evaluate the value of flow cytometric of cerebrospinal fluid cells in the diagnosis of central nervous system leukemia in children. Methods Used Double immunofluorescence staining with monoclonal antibodies，45 cerebrospinal fluid samples who had central nervous system involvement was analyzed with flow cytometric immunophenotyping and conventional cytology in January 2015 to March 2016，the results of flow cytometry were compared with conventional cytology. Results The results showed that 33.33% children had abnormal cells by flow cytometry and 20% children had abnormal cells by conventional cell morphology in 45 cases。The difference had statistical significance （P < 0.01）. Conclusion Flow cytometriy analysis of cerebrospinal fluid has important clinical significance in the diagnosis of CNSL in children。

[Key words] Flow cytometry；Conventional cytology；Cerebrospinal fluid；Immunophenotyping；Central nervous system leukemia

隨著化療方案的改進，我國兒童急性淋巴細胞白血?。╝cutelymphoblastic leukemia，ALL）的療效獲得了顯著改善，兒童ALL誘導緩解率高達91%～94%，5年無事件生存（EFS）率達70%～80%[1-3]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血?。–entral Nervous System Leukemia，CNSL）是導致白血病化療失敗的主要原因之一，如何早期診斷CNSL具有重要意義。該文將對2015年1月―2016年3月期間45例急性淋巴細胞白血?。ˋcute Lymphoblastic Leukemia，ALL）的腦脊液進行分析，以研究腦脊液FCM在CNSL診斷中的意義，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

根據(jù)2014年制定的兒童 ALL診療建議（第四次修訂）為診斷標準[4]，以明確診斷急性淋巴細胞性白血病的患兒為對象，方便選取該院收治的臨床疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤45例進行腦脊液CC及FCM檢測。符合以下任何一項，并除外其他原因導致的樞神經(jīng)系統(tǒng)病變時，列為可疑中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤病例：①有神經(jīng)系統(tǒng)癥狀；②腦脊液常規(guī)白細胞計數(shù)大于5×106 個/L時；③頭顱核磁或CT提示影像學病變。

1.2 腦脊液細胞常規(guī)計數(shù)

將留取無菌新鮮腦脊液標本2 mL充入細胞計數(shù)板，高倍鏡下計數(shù)有核細胞數(shù)。

1.3 腦脊液細胞學檢查

吸取 2～3 mL腦脊液，標本離心后涂片，干燥后進行瑞氏染色，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)原始幼稚細胞則判定結果陽性。

1.4 FCM分析

采用單克隆抗體雙重直接免疫熒光素（FITC/PE）標記法。留取2～3 mL新鮮腦脊液于無菌試管中，離心（1 400 r/min，5 min）后棄上清，留取100 μL，加入相應抗體，充分混勻，在室溫、避光條件下孵育15 min，加入1 mL溶血素1 mL，混勻后避光，室溫放置8 min，離心（1 400 r/min，5 min）棄上清，用PBS洗滌細胞，離心（1 400 r/min，5 min）后，棄上清，加入約3 mL PBS洗滌細胞，離心后棄上清，加入約100 μL PBS后，震蕩混勻，立即上機檢測。流式細胞儀及所有抗體來自美國BD公司。含六種熒光抗體標記：FICT、PE、APC、PerCP、APC-Cy7、PE-Cy7。

1.6 統(tǒng)計方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料以例數(shù)表示，采用χ2檢驗，P

2 結果

2.1 45例兒童ALL的臨床特點

可疑中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤者45例，所有病例均進行FCM及CC檢測，其中男性28例， 女性17例， 年齡1～18歲，平均年齡（9.09±5.41）歲，其中B系20例，T系25例。45例病例中3例患兒有頭痛、嘔吐表現(xiàn)，44例患兒腦脊液常規(guī)白細胞計數(shù)≥5×106個/L，未發(fā)現(xiàn)頭顱核磁及CT的影像學改變。兩組檢測方法在年齡、性別、免疫型、白細胞計數(shù)及神經(jīng)系統(tǒng)癥狀方面，差異無統(tǒng)計學意義。見表1。

2.2 FCM與CC兩種方法對45例ALL腦脊液異常細胞的檢測結果

45例懷疑中樞神經(jīng)系統(tǒng)侵潤者的腦脊液細胞，其中FCM有15例發(fā)現(xiàn)異常免疫表型，其中B系6例，T系9例，陽性率為33.33%，CC發(fā)現(xiàn)9例存在原始幼稚細胞，其中B系3例，T系6例，陽性率為20%，兩者檢測方法的差異具有統(tǒng)計學意義（P

3 討論

兒童CNSL發(fā)病率在2%～10%之間[5]，目前CNSL診斷金標準仍是腦脊液細胞形態(tài)學發(fā)現(xiàn)異常幼稚細胞，但腦脊液標本細胞數(shù)量少，離體環(huán)境下容易發(fā)生自溶，受主觀經(jīng)驗性判斷影響大，容易出現(xiàn)CNSL的誤診及漏診，假陰性率高達20%～60%[6]，單純依靠腦脊液細胞學檢查并不能完全排除CNSL的診斷。FCM的細胞免疫分型是檢測微量異常細胞非常敏感的方法，通過細胞表面標記片段確定各細胞群性質，受細胞形態(tài)變化影響小，亦不易受主觀影響，能夠準確的檢測惡性腫瘤細胞，已廣泛用于腦脊液檢查中。

早期CNSL可無臨床表現(xiàn)、影像學陽性發(fā)現(xiàn)，甚至腦脊液常規(guī)檢查也無細胞數(shù)增高。蔣能剛等[7]報道，多參數(shù)FCM 分析在細胞數(shù)量較少情況下，顯示出明顯優(yōu)越性。該次130例腦脊液中，發(fā)現(xiàn)1例細胞數(shù)為4×106 個/L的ALL（T系），CC-FCM+發(fā)現(xiàn)異常細胞群，異常細胞群占總細胞的54.14%，表達CD5。在45例懷疑CNSL的腦脊液中，15例診斷CNSL的病例中白細胞數(shù)在4～100×106個/L之間有6例，其中FCM+有4例，CC+有2例。腦脊液白細胞計數(shù)越高，形態(tài)學及FCM越容易發(fā)現(xiàn)異常細胞，其中細胞形態(tài)學更為明顯。而腦脊液白細胞數(shù)少時，F(xiàn)CM相較于CC更敏感。此外，有報道指出[8]，當行FCM及CC檢測時，CC容易受到FCM結果影響。該次研究也存在類似問題，有2例腦脊液發(fā)現(xiàn)FCM陽性結果后，CC更改了起初陰性結果的判讀，可見，細胞形態(tài)學分析對于良惡性細胞的判斷主觀性仍較強。

腦脊液FCM在CNSL診斷中，具有很高的靈敏度和特異性。Mitri Z等[8]報道，腦脊液流式細胞術和CC的特異性均為100%，但前者的敏感性明顯高于CC，接近100%。Ranta S等[9-11]研究顯示，在高度懷疑中樞神經(jīng)系統(tǒng)侵潤的淋巴瘤中，F(xiàn)CM的CNSL檢出率是細胞形態(tài)學的2～3倍。該研究對70例ALL患兒，共130例次腦脊液標本進行FCM及CC檢測，其中45例懷疑有CNSL可能，CC陽性檢出率為 20%（9/45），F(xiàn)CM的陽性檢出率為33.33%（15/45），是CC檢出率的1.67倍，與報道類似。建議對懷疑有中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變的患者，在進行腦脊液細胞形態(tài)學檢測的同時，進行FCM的評估，以提高早期診斷CNSL的陽性率。

綜上所述，腦脊液FCM 的陽性檢出率及準確性明顯高于傳統(tǒng)腦脊液CC方法，對CNSL的診斷具有極大的應用價值，是診斷CNSL方法的重要補充。由于CNSL發(fā)病率較低，對于FCM及CC診斷的一致性仍需要今后大樣本進一步研究論證。

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篇5

[關鍵詞] 臍血干細胞；類風濕關節(jié)炎；IL-1β；TNF-α；IL-4；IL-10

[中圖分類號] R684.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2013）09（b）-0022-03

類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以關節(jié)滑膜及周圍結締組織異常增生、關節(jié)進行性破壞為特征的慢性自身免疫性疾病[1]。傳統(tǒng)的治療藥物，如免疫抑制劑、糖皮質激素、生物制劑等，雖能使部分患者的病情活動得以控制，但長期應用副作用較大[2]。間充質干細胞因具有免疫調節(jié)作用[3]，為RA治療帶來新的希望。本研究嘗試采用hUCBSCs穴位移植方法治療類風濕關節(jié)炎大鼠模型（CIA），觀察對白介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-4（IL-4）、白介素-10（IL-10）的影響，探討hUCBSCs穴位移植治療RA的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

牛Ⅱ型膠原（C7809，5 mg，Sigma公司）；弗氏完全佐劑（098K8729-CAS9007-81-2，10 mL，Sigma公司）；流式細胞儀抗體PE-CD34。甲氨喋呤（MTX），上海醫(yī)藥集團有限公司信通制藥廠，產(chǎn)品批號002091。

1.1.2 實驗動物

近交系雌性Wistar大鼠120只，動物年齡45～50 d，體重（180±20）g，由遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。

1.1.3 臍血

選擇遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院（以下簡稱“我院”）婦產(chǎn)科排除了HIV、HBV、HCV、CMV、EBV、梅毒等急、慢性感染，無血液系統(tǒng)疾患及其他系統(tǒng)疾病的非高危妊娠健康足月產(chǎn)婦，新生兒為經(jīng)陰道順產(chǎn)且生后皮膚紅潤，四肢活動良好，無感染征象的臍血。本研究經(jīng)我院倫理委員會通過，所有產(chǎn)婦及家屬知情同意，并簽署知情同意書。

1.2 實驗方法

1.2.1 臍血干細胞分離

將采集到的新鮮臍血用HES沉淀法分離臍血單個核細胞，制成MNC懸液，用臺盼藍拒染色試驗測細胞存活率，若細胞存活率>95%，則進行下一步實驗。用MiniMACS磁性吸附性分離裝置，進行CD34+細胞的分離與純化，用臺盼藍拒染色試驗測細胞存活率，流式細胞儀測定CD34+細胞百分比[4]。將處理完畢的采集物低溫凍存以備回輸。

1.2.2 分組、造模與給藥

1.2.2.1 實驗分組 將近交系Wistar大鼠120只隨機分為六組：正常對照組（A組）、模型組（B組）、hUCBSCs腕關節(jié)注射治療組（C組）、hUCBSCs尾靜脈注射治療組（D組）、hUCBSCs外關穴注射治療組（E組）、MTX灌胃治療組（F組），每組20只。

1.2.2.2 建立CIA動物模型 實驗模型采用鄧安梅法[5]。除A組外，寒冷刺激10 d后，將10 mg牛Ⅱ型膠原（BⅡC）與5 mL完全氟氏佐劑研磨后，以每只100 μL于大鼠背部、踝部、尾根部皮內注射免疫，免疫注射20 d后，于第21天按上述方法20 μL再次腹腔內注射，作為激發(fā)注射免疫。A組在寒冷刺激10 d后，按上述方法及相同部位注射等量的注射用水。

1.2.2.3 hUCBSCs輸注途徑及劑量 CIA大鼠免疫接種后第31天（除A組及B組用蒸餾水），開始hUCBSCs移植治療。C、D、E組分別向腕關節(jié)腔、尾靜脈、外關穴注射0.5 mL 0.9%氯化鈉溶液和0.5 mL hUCBSCs懸液（含干細胞2×107/mL），F(xiàn)組MTX灌胃治療（MTX研成細末，加生理鹽水配成懸濁液灌胃0.0175 g/kg），每周1次。

1.2.2.4 指標檢測 在hUCBSCs輸注4周后ELISA法測定CIA大鼠外周血細胞因子IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10的含量。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用t檢驗或方差分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 A、B兩組大鼠血清中各指標比較

由于實驗操作等原因，在實驗過程中有3只死亡，其中B組死亡2只，F(xiàn)組死亡1只。B組大鼠血清細胞因子IL-1β、TNF-α明顯高于A組，而IL-4、IL-10明顯低于A組（P < 0.05）。見表1。

表1 A、B兩組大鼠血清中各指標比較（μg/L，x±s）

注：與A組比較，P < 0.05；IL-1β：白介素-1β；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL-4：白介素-4；IL-10：白介素-10

2.2 B組與各治療組各項指標的比較

與B組比較，各個治療組IL-1β、TNF-α明顯降低，IL-4、IL-10明顯升高（P < 0.05）。與F組比較，C、D組IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10無明顯變化（P > 0.05）。與F組比較，E組IL-1β、TNF-α明顯降低，IL-4、IL-10明顯升高（P < 0.05）。見表2。

表2 B組與各治療組各項指標的比較（μg/L，x±s）

注：與B組比較，*P < 0.05；與F組比較，#P < 0.05；IL-1β：白介素-1β；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL-4：白介素-4；IL-10：白介素-10

3 討論

造血干細胞移植是通過異體或自體的造血干細胞植入受者體內，使受者獲得造血和免疫功能重建的方法[6]。大量實驗及臨床資料已經(jīng)證明臍帶血是極有潛力的造血干細胞來源[7-9]。臍帶血干細胞具有多向分化能力、免疫調節(jié)性能以及組織修復能力和低風險特性，并且其療效肯定，不需要組織配型，移植后沒有排斥反應。王秦等[10]在臨床上已經(jīng)成功地應用異基因臍帶干細胞靜脈輸注的移植方法治療3例難治性RA，移植后能顯著改善病情，減少免疫抑制劑的用量。

穴位注射是在中醫(yī)理論的指導下，通過針刺與藥物注射相結合的一種注射方法[11-12]。針刺腧穴達到疏通經(jīng)氣、調節(jié)臟腑氣血功能，同時又與藥物相結合發(fā)揮藥物治療作用，從而達到腧穴、針刺、藥物三者相結合的治療效果。藥物注入穴位后激發(fā)了腧穴的良性調整作用，具有吸收快和放大藥物治療作用的效應。這樣就可以減少藥物的用量，提高療效。外關穴為手少陽三焦經(jīng)之絡穴，是八脈交會穴，通陽維脈[13]。外關穴注射異基因hUCBSCs治療RA，一方面具有針刺效應，調節(jié)陰陽，刺激神經(jīng)-內分泌-免疫網(wǎng)絡，調節(jié)紊亂的免疫功能，另一方面發(fā)揮異基因hUCBSCs的作用，調節(jié)RA患者機體免疫紊亂，阻止病情進展。

本實驗研究hUCBSCs穴位移植治療CIA大鼠，在實驗中采用外關穴注射、腕關節(jié)腔注射及尾靜脈注射三種方法，結果顯示，三種治療方法對RA大鼠均有明顯的治療作用，外關穴位移植對RA大鼠細胞因子的影響更大，作用明顯優(yōu)于MTX。這可能與穴位的作用不可分離[14-15]。異基因臍血干細胞外關穴位移植治療的特點就是調整機體的免疫功能，表現(xiàn)在能恢復和促進IL-4、IL-10含量使Th2升高，降低TNF-α、IL-1β的量使Th1降低，使失衡的Th1/Th2趨向平衡，可能是通過抑制炎癥細胞遷移、抑制內皮細胞黏附分子的表達、抑制滑膜細胞過度分泌細胞因子及炎癥介質[16-17]，從而減輕了臨床癥狀，延緩了病理進展，防止了關節(jié)畸變和功能破壞。

綜上所述，本項目是將傳統(tǒng)醫(yī)學的穴位療法與現(xiàn)代醫(yī)學的干細胞移植技術相結合，以期開辟一條新的移植途徑，可以使干細胞更為簡單、無創(chuàng)、準確地運送到目的地，探求對RA新的治療方法，并通過此進一步分析RA的發(fā)病機制。

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篇6

山東省濟南市濟陽縣人民醫(yī)院，山東濟南 251400

[摘要] 流式細胞儀被廣泛的應用于光學、生物學、流體學和免疫學等領域。其中流式細胞術是其檢測的關鍵性技術，具有靈敏、快速的特點，在細菌的快速檢測中得到較為廣闊的應用。本文就流式細胞術在環(huán)境樣品細菌檢測、臨床細菌檢測和趨磁細菌研究中的應用前景進行分析，以促進流式細胞技術的發(fā)展和完善。

[

關鍵詞 ] 流式細胞術;細菌;快速檢測;應用

[中圖分類號] R446.5　[文獻標識碼] A　[文章編號] 1672-5654（2014）04（b）-0194-02

流式細胞術于90年代末期被創(chuàng)建，最初僅用于臨床檢驗和科學研究，由于微生物的粒子或細胞較小，因此在微生物領域應用的較晚。但在近幾年來，隨著熒光染料的改良和豐富、光學科技的不斷完善，以及流式細胞檢測儀自身的不斷發(fā)展進步。在如今，流式細胞術在微生物領域得到較為廣泛的應用，尤其是對于細菌學問題的解決具有多參數(shù)測量精確，并且迅速的特點。

1流式細胞術在環(huán)境樣品細菌檢測中的應用

以往對環(huán)境樣品通常應用的方法為平板法，對微生物的多樣性和總菌數(shù)的深入研究具有嚴重的制約性，常會給檢測結果帶來較大的誤差，并且其他傳統(tǒng)的檢測方法，具有操作復雜繁瑣的特點。但流式細胞是在環(huán)境樣品中的推廣應用，具有測定精準、制備簡單、可快速的對多參數(shù)數(shù)據(jù)進行采集，以及可對多元數(shù)據(jù)進行分析。如今，流式細胞術已廣泛的應用于土壤、水和空氣等環(huán)境中的微生物研究的重要工具，圖1為流式細胞術的樣品制備技術。

曾有學者應用熒光原位雜交技術結合流式細胞檢測儀對豬谷倉空氣和實驗室空氣中的微生物進行測定。先用液化收集器獲取樣品，然后用熒光染料染色后，應用流式細胞術辨別樣品粉塵雜質中的菌體，并且可通過計數(shù)處理，獲取細菌總數(shù)。流式細胞術還可用以土壤樣品的檢測，Jean Christophe等學者應用流式細胞術對土壤樣品中的微生物進行定量和定性檢測。應用溴化乙錠和跟16SrRNA具有互補作用的熒光探針結合光散射參數(shù)對菌體的大小進行限定，然后從土壤微生物的粉塵碎片和群落中區(qū)分出絮凝劑產(chǎn)生菌檢測菌[1]。

另外，還有學者應用該術對水環(huán)境進行細胞的快速檢測,采用流式細胞術和FISH對新加坡壓艙水的腸道菌數(shù)、弧菌數(shù)、細菌總數(shù)和大腸桿菌屬進行檢測。經(jīng)檢測結果發(fā)現(xiàn)，應用不同取樣點的壓艙水，其檢測結果會存在較大的差異，該種現(xiàn)象說明航運業(yè)的壓艙水的水質情況較為復雜，并且受到多種因素的制約和影響。這些檢測實驗表明，應用流式細胞術能夠進行水質檢測和污染監(jiān)測，在工業(yè)不斷發(fā)展的今天，對于生態(tài)文明建設，該監(jiān)測方法的應用具有極為重大的意義。

2流式細胞術在臨床細菌檢測中的應用

流式細胞術在最初主要應用為哺乳類動物的檢測，在臨床上的應用極為少見。但目前在臨床中，已得到廣泛的應用，并且樣品的檢測范圍也從最初的的真核細胞檢測擴展到原核生物的細胞檢測中，甚至可對更小的病毒進行檢測。具有快速、靈敏的特點，對促進病癥的及時確診具有重要的作用。較為常用，并且效果最佳的是對于菌血癥的診斷。在臨床檢查中，異質性和藥敏性極為常見，并且兩者間具有緊密的聯(lián)系，流式細胞術在臨床細菌檢測中的應用，最初始于對藥敏性的檢測。

Suller曾應用流式細胞術檢測氨芐青霉素、萬古霉素和頭孢他啶，分別對其金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌的藥敏性反應進行檢測。其結果表明，應用流式細胞術能夠靈敏、快速的對抗生素的抗菌效應進行檢測，同時應用細胞氧化活性燃料CTC，可檢測出多個不同的細胞亞群，由于不同的細菌亞群對于抗生素敏感性并不相同，因此能夠較為直觀的反映細胞的異質性[2]。付亮等學者應用臨床分離出的肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌，結合流式細胞術和確證實驗兩種方法進行兩種藥物敏感性的檢測。其檢測結果表明，流式細胞術和傳統(tǒng)的檢測結果具有一致性的特征，但更富有客觀、自動化和快速的特性，能夠聯(lián)合應用于藥敏性的實驗研究。流式細胞技術還可獲取異質性和藥敏性的相關信息，屬于有效的檢測手段。該技術在臨床疾病診斷中的優(yōu)勢，在于其檢測結果能夠幫助對疾病進行及時的診斷，特別是對于急性病的診斷，具有較大的應用價值。

流式細胞術在臨床醫(yī)學中的應用，還可應用于其他病菌的檢測。有學者曾應用結合分支桿菌采用熒光素SYBR Green I和二氧化硅納米顆粒兩種燃料標記后，結合流式細胞術進行檢測。其檢測的菌濃度可低至3.5×103~3.0×104 個/mL，相對于單純使用FITC 染色的流式細胞術應用更為明顯[3]。此外，據(jù)有關實驗表明，流式細胞術的臨床細菌診斷，并不僅僅是局限于普通的細菌檢測，還可用于休眠體的檢測，能夠在其活化前，對疾病作出診斷，進行盡早的診斷，對于患者的康復具有重要作用。

3流式細胞術在趨磁細菌研究中的應用前景

趨磁細菌于1975年由美國科學家Blakemore首次發(fā)現(xiàn)，因為其體內據(jù)有較小的次磁小體，受到諸多科學家的關注。在目前，對于趨磁細菌磁小體的合成機理并沒有明確的文獻指出，在研究中，依然存在較多的問題。其中的關鍵性問題在于對磁小體合成量的檢測，也即磁性的表征，對于優(yōu)化磁小體的合成培養(yǎng)條件形成了限制，制約磁小體的大量合成[4]。在近幾年來，有學者曾應用流式細胞儀對趨磁細菌進行檢測應用，但文獻較少，并且缺乏深層次的研究。

結合流式細胞儀的應用原理，以及檢測微粒時可應用熒光染料標記定量測量的特點，初步推斷流式細胞術能夠應用于檢測趨磁細菌磁小體合成量。因為趨磁細菌結合體的體內合成磁體較小，并且數(shù)量不相等，致使胞內粒度的大小直接受到磁小體多寡的影響。根據(jù)流式細胞術側向散射光信息能夠表示細胞胞內粒度的具體情況,因此，流式細胞術在未來的發(fā)展研究中，應能夠用于趨磁細菌磁小體量的檢測，但在目前仍未找合適的磁小體熒光探針，所以還有待于進一步的深入研究。此外，流式細胞術還可以應用于趨磁細菌非趨磁標準珠和突變株的檢測研究，據(jù)有關研究觀察發(fā)現(xiàn)趨磁細菌的非區(qū)磁性的突變體能夠自發(fā)的形成[5]。但在目前的研究中，流式細胞儀應用于趨磁細菌還存在一定的局限性，需要對其儀器精度的提升深入研究，方能進一步的促進流式細胞術在趨磁細菌中的應用。

4結語

流式細胞術在微生物領域中的應用較廣，只要可進行熒光分子標記的微粒和細胞，均可應用流式細胞儀檢測。尤其是用以形體較為微小的粒子，具有靈敏度高、迅捷、逐個檢測、多參數(shù)分析等優(yōu)點。但由于其前期的應用成本較高，并且在樣品處理和熒光染料的選擇方面仍然存在一定的局限性，還需進一步的研究。但在現(xiàn)代科技不斷進步發(fā)展下，流式細胞術會有更為廣闊的應用前景。

[

參考文獻]

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篇7

作者：韓兆東 阮月芹 安新業(yè) 孔祥華 陳佳榮 周玉明

【關鍵詞】 細胞

【關鍵詞】 流式細胞儀；臨床應用；流式細胞術

流式細胞術（flow cytometry，F(xiàn)CM）是利用流式細胞儀對細胞等生物粒子的理、化及生物特性進行分析的方法。流式細胞儀是近代細胞生物學、分子生物學、分子免疫學和單克隆技術、激光技術、電子計算機術等學科高度發(fā)展的綜合結晶。在免疫學、血液學、腫瘤學等學科及臨床研究方面得到廣泛應用［1］。

FC500是由美國貝克曼庫爾特（BECKMAN COULTER）公司2003年推出的臨床及科研型流式細胞儀系統(tǒng)。該儀器可同時測定前向散射光（FORWARD SCATTER）、側向散射光（SIDE SCATTER）及利用一個488 nm單束激光激發(fā)五個熒光染科所產(chǎn)生的熒光信號。因此，該儀器可對各個細胞進行相關的多參量的分析。

FCM的應用標志著細胞學、腫瘤學、免疫學等進入了細胞的分子水平的研究，隨著對FCM研究的日益深入，其價值已經(jīng)從科學研究走入了臨床應用階段，在我國臨床醫(yī)學領域里已有著廣泛的應用。

1 FCM在免疫學中的應用

FCM廣泛地應用于檢測各種免疫細胞的表面標志及細胞內各種細胞因子等，通過對病人淋巴細胞各亞群數(shù)量的測定來監(jiān)控病人的免疫狀態(tài)，指導治療。有大量文獻介紹了淋巴細胞在各種疾病中的變化。正常人群T淋巴細胞CD4/CD8比值大約為2∶1，但在人體細胞免疫力低下時可出現(xiàn)比例下降甚至倒置。B細胞CD19與機體免疫球蛋白呈正相關。NK細胞反應機體對病毒感染的細胞和腫瘤細胞的殺傷能力及巨噬細胞的殺菌活性。FCM通過對人白細胞抗原（HLA）配型的測定可以為異體干細胞移植病人選擇出最合適的供體并進行骨髓或器官移植后免疫狀態(tài)的監(jiān)測。外周血HLAB27的表達及其表達程度與強直性脊髓炎的發(fā)生有很大程度的相關性，運用HLAB27/HLAB7雙標記特異性單克隆抗體檢測抗原，可同時排除交叉反應，其敏感性較傳統(tǒng)的微量細胞毒實驗大大提高［2］。用FCM檢測陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿患者血細胞細胞膜上的CD55、CD59已能從病理上提供直接的證據(jù)，比傳統(tǒng)的溶血試驗具有更高的特異性和靈敏度。用FCM檢測紅細胞、粒細胞抗體及血小板表面的相關抗體，對確診自身免疫性貧血、粒細胞減少癥及血小板減少性疾病，均具有檢測速度快、靈敏度高、特異性好的優(yōu)點［2］。

2 FCM在血液學中的應用

白血病分型是MIC分型的重要組成部分，也是對FAB分型的補充；是對白血病診斷、選擇化療方案和判斷預后的重要依據(jù)；對白血病發(fā)病機制的研究也具有重要作用。由于白血病不同系列、不同分化階段血細胞膜表面及漿內表達不同的分化抗原，且與相應正常骨髓細胞的表達存在差異，故應用FCM能很好的對白血病進行免疫分型，并能夠提供正常細胞在演變成惡性腫瘤過程中細胞基因及抗原標志發(fā)生變化的信息，而這種變化常常是細微的，以至于常規(guī)FAB方法不能分辨。這使我們對血液腫瘤細胞的生物學特征有了更深入和更精確的認識。FCM還可用于血小板膜糖蛋白異常所致疾病的診斷，包括先天性或獲得性血小板的疾病，評價活化血小板程度在血栓疾病和血栓前狀態(tài)發(fā)生發(fā)展中的作用。用FCM通過對外周血網(wǎng)織血小板的測定，有助于血小板減少癥的病因學診斷?？勺鳛楣撬枰浦?、造血促進因子和骨髓移植后骨髓血小板造血恢復有用的監(jiān)控指標。

應用FCM檢測某些免疫指標，能對再生障礙性貧血的發(fā)病機制進行研究。再障是一組由不同發(fā)病機制介導的骨髓造血功能障礙綜合征。其發(fā)病機制復雜，目前尚未完全明了，但越來越多的臨床和實驗室證據(jù)表明免疫介導的造血抑制，是再生障礙性貧血最常見的病理之一。而且，具有免疫表型異常（如CD4/CD8倒置、CD8+活化T細胞或TCRγ，δ等異常增高）的患者臨床表現(xiàn)相對嚴重，但免疫治療相對有較好的療效。

微小殘留病灶（MRD）檢查：白血病病人在獲得血液學緩解后，體內還存在1010以下的白血病細胞。這樣少量的白血病細胞常規(guī)的顯微鏡不能檢出。在強化治療和維持治療后可逐步減少，但難以徹底清除，這是復發(fā)的根源。檢測MRD是決定進一步治療策略和選擇采集外周血造血干/祖細胞自體移植及異基因骨髓移植時機的依據(jù)。

多發(fā)性骨髓瘤（MM）：多發(fā)性骨髓瘤是漿細胞異常增生性疾病，正常漿細胞為CD38+/CD45 dim-，使用CD38/CD45雙標記檢測外周血和骨髓標本，可以準確劃定漿細胞群。通常使用CD38和CD45，結合輕鏈檢查，對多發(fā)性骨髓瘤細胞進行分析。另外，正常漿細胞的表面標記為CD19+/CD56-，而多發(fā)性骨髓瘤細胞通過為CD19-/CD56+。這樣，使用流式細胞儀對外周血或骨髓標本進行多參數(shù)分析，并計算漿細胞含量，對于多發(fā)性骨髓瘤的診斷和治療評估有重要意義。

CD34的絕對計數(shù)：造血干/祖細胞移植加強烈化療是治愈某些難治性疾病的有效方法；它不僅可以用于某些惡性血液病的治療，而且還可以用于其他惡性實體瘤的治療。骨髓移植（BMT）或外周血造血干細胞移植（PBSCT）的成功與否，除了與是否合并并發(fā)癥有關外，移植物中CD34+細胞的數(shù)量和質量是快速成功植活的重要因素。精確測定CD34對于判斷移植后的植活和選擇GCSF動員外周血干細胞的采集時間，有著重要指導意義。

3 FCM在腫瘤學中的應用

流式細胞術利用實體瘤標本或穿刺標本、胸腹腔液體、膀胱沖洗液、尿液、食道鏡及支氣管鏡鉗取的少量活檢組織等對腫瘤細胞DNA會計師測定，解析細胞周期，通過腫瘤細胞異倍體測定，鑒別良性與惡性腫瘤，預測各種癌的預后，并能在化療中對藥物的選擇，放療中強度、時間的決定等起主要作用［5］。根據(jù)細胞周期分析結果，適當選用周期特異性藥物或非周期特異性藥物，可協(xié)助擬定治療方案；根據(jù)化療過程中腫瘤細胞DNA會計師分布直方圖的變化，可了解細胞動力學變化，以此評估藥物療效。

多藥耐藥（MDR）的研究：白血病治療及腫瘤化療的失敗在很大程度上是由于白血病細胞及腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生了耐藥。因此，對白血病和腫瘤細胞耐藥機制的研究具有重要的意義。但耐藥的形成過程很多，主要有幾個方面，包括藥物吸收減少、細胞解毒作用增強、靶分子改變、DNA損傷修復能力增強、細胞內藥物溢出增多、細胞凋亡的抑制等。多藥耐藥基因編碼的P糖蛋白，是白血病細胞及腫瘤細胞抗藥性的分子學基礎，也是影響化療療效的主要障礙。利用FCM檢測多藥耐藥基因，則可為藥理學研究提供依據(jù)。

參 考 文 獻

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篇8

關鍵詞：IPS細胞；分化；造血干細胞

0 引言

目前，臨床上普遍使用造血干細胞移植，用于白血病、非霍奇金淋巴瘤、地中海貧血等病的治療。造血干細胞的主要來源是臍帶血、骨髓。如果直接進行骨髓移植，則需要進行人體的白細胞抗原配型，否則發(fā)生免疫排異會危及患者生命?，F(xiàn)有臍帶血庫儲存的造血干細胞免疫原性弱，但數(shù)量供不應求，使其在疾病中的臨床應用中受到限制。隨著誘導性多能干細胞（IPS）提取技術的出現(xiàn)，使分化自身細胞變?yōu)榱爽F(xiàn)實，不但避免了倫理問題，解決了免疫排斥問題，造血干細胞的數(shù)量也能滿足臨床需求。下面將分化研究過程報道如下：

1 材料和方法

1.1細胞株的來源

小鼠骨髓基質細胞OP9購于美國ATCC，誘導性多能干細胞IPS由中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院提供。

1.2試劑和儀器

小鼠骨髓基質細胞OP9的培養(yǎng)基為α-MEM，內含20%的胎牛血清，OP9細胞誘導干細胞分化培養(yǎng)基為α-MEM（15%的DFBS、0.25%胰酶、0.1%明膠），CD34來自MACS公司?？贵w為APS-TRA-1-85，半固體培養(yǎng)基購于SCT公司。流式細胞儀為美國AccuriC6型，定量PCR儀為CFX96型。

1.3方法

在六孔板中先鋪好1%的metrigel進行細胞培養(yǎng)，每三天添加0.5mmol/L的EDTA，以保持對照組細胞的未分化狀態(tài)，OP9用細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)時放在大小為10cm且鋪有0.1%的明膠的盤里，，每隔四天用胰酶消化傳代。細胞培養(yǎng)溫度為37℃，CO2濃度為0.5，濕度飽和。

OP9細胞進行傳代培養(yǎng)4天后，將OP9的培養(yǎng)液換成誘導干細胞分化的培養(yǎng)液，將UC013細胞洗兩遍后，再對邊緣部位細胞進行消化，將細胞吸出后加入Dispace，再用槍頭吹吸混勻細胞后，將其轉移到加有分化培養(yǎng)液的細胞盤中搖勻，在與上述培養(yǎng)的溫度、空氣CO2濃度和濕度相同的條件下進行培養(yǎng)，培養(yǎng)的第二天將培養(yǎng)液換為共培養(yǎng)液，第四天開始每隔一天半換一次培養(yǎng)液，第九天收樣品。

免疫磁珠法分選CD34+細胞，將細胞用PBS洗兩遍，接著用胰蛋白酶進行消化，制備單細胞懸液，再將細胞收集到離心管中進行離心，收集沉淀，再向其中加入2%血清吹打均勻。過濾后，向其中加入FCR和 CD34標記細胞，30秒后加入流式細胞緩沖液，再離心，然后吸取上清，加入流式細胞緩沖液重懸。將制備好的細胞懸液加入流式細胞儀進行分離，通過流式細胞儀分離柱的CD34-細胞被移出分離柱棄之，最終，通過加壓洗脫分離柱上黏附的細胞，即得到CD34+細胞。

用流式細胞術進行檢測，將共培養(yǎng)9天后的細胞用PBS清洗、胰蛋白酶消化后，制備單細胞懸液，收集到離心管中，靜置五秒后，用加有2%血清的流式緩沖液重懸，細胞過濾后，加入FCR和抗體，孵育15min，再用流式緩沖液清洗，重懸，最后用流式細胞儀進行檢測。

集落形成實驗。將分選的CD34+細胞接種到半固體培養(yǎng)基中，放于培養(yǎng)皿中進行培養(yǎng)，每孔接種1萬個細胞，培養(yǎng)14-16天。然后，在顯微鏡下根據(jù)集落成的血細胞形成特征，對集落細胞進行分類和計數(shù)。同時，提取共培養(yǎng)2、4、6、8、10和12天的細胞的RNA，用RT-PCR法檢測各基因在細胞中的相對表達量。

2 結果

2.1細胞培養(yǎng)與觀察

觀察培養(yǎng)的細胞，結果顯示，對照組未分化的人體細胞集落狀生長，呈扁平狀，排列緊密，沒有分化的跡象。實驗組培養(yǎng)2天后的細胞，表面布滿細胞集落，已進行造血干細胞分化。OP9細胞貼著細胞壁生長，細胞為三角形，周圍向外出伸出像纖維狀的偽足，細胞排列規(guī)則，生長迅速，培養(yǎng)4天后細胞鋪滿了培養(yǎng)皿底。

2.2誘導造血干細胞分化

通過在本實驗組的誘導分化條件下，對實驗組和對照組細胞的培養(yǎng)，實驗組細胞分化到一定程度后，便開始大量克隆，細胞的形態(tài)也發(fā)生了分化，接著，OP9細胞開始出現(xiàn)老化跡象。

2.3流式細胞術檢測

共培養(yǎng)9天后用流式細胞儀檢測細胞造血表面標志物表達情況，用流式細胞儀分析培養(yǎng)細胞的CD34、CD43、CD31的表達情況，結果顯示表達上述表面標志物的細胞分別占有比例為20%、2%和7.1%。

2.4 4RT-PCR檢測

運用RT-PCR對共培養(yǎng)的細胞進行基因表達檢測，結果顯示，IPS細胞發(fā)生造血分化時，Oct-4基因的表達慢慢消失；造血轉錄因子基因表達緩慢升高；Runx-1基因在造血干細胞分化12天當中的表達呈波浪式變化，其中分化第二天表達量最高，第四天開始下降，第八天開始升高；CD34在造血分化過程中的基因表達量逐漸增高。

2.5 CD34+細胞集落實驗

CD34+細胞在半固體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，根據(jù)造血干細胞的形態(tài)特征，對細胞集落進行分類和計數(shù)。結果顯示，紅系集落（CFU-E）、粒系集落（CFU-G）、巨核系集落（CFU-M）、粒―巨核系集落（CFU-GM）集落數(shù)量持續(xù)升高，混合系集落（CFU-GEMM）的集落數(shù)量逐漸降至最低。

3 討論

隨著干細胞技術的發(fā)展，通過誘導分化得到造血干細胞已經(jīng)成為事實。相對于多能干細胞而言，IPS通過導入轉錄因子以及重編程進行定向分化的比例較低，，但是IPS的獲得方法比較簡單穩(wěn)定，避免了胚胎干細胞面臨的倫理和法律等問題，使IPS可以應用于細胞替代性治療，并可以進行疾病的機理研究和腫瘤治療藥物的篩選。IPS細胞分化得到的造血干細胞免疫原性較低，解決了移植排斥的問題。

在本文的研究中，沒有外加細胞因子，直接將IPS細胞誘導分化為造血干細胞，結果獲得了20%的CD34+細胞，即造血干細胞，CD34是表達于造血干細胞的表面標志物，表明IPS可以分化為造血干細胞，但是轉化率比較低。Runx1是調控造血干細胞分化的轉錄因子，期基因的表達量在分化過程中呈現(xiàn)波浪式的變化，Gata-2的表達則逐漸升高。體外分化得到的造血干細胞在半固體培養(yǎng)基中成集落狀態(tài)，說明IPS可以向各細胞系進行分化。

現(xiàn)在多能干細胞分化為造血干細胞的方法主要有：一是形成胚狀體后再進行誘導生成造血干細胞；二是基質細胞與多能干細胞共培養(yǎng)；三是形成EB后與OP9進行共培養(yǎng)；四是單層誘導ESC生成造血干細胞。利用OP9細胞與胚胎干細胞共培養(yǎng)，可以模擬體內的造血微環(huán)境，為研究細胞定向分化為造血干細胞創(chuàng)造了可能性，OP9細胞主要支持早期的造血干細胞分化，并協(xié)助B淋巴細胞增殖?；|細胞通過釋放的細胞因子支持造血干細胞的分化。這種誘導方法分化時間短，為臨床造血干細胞的移植提供了便利。誘導分化過程中不用添加細胞因子，比較經(jīng)濟。但該誘導方法也存在著一定的缺點，即存在鼠源性污染細胞的可能性，加之所用血清的成分的不明確性，限制了其在臨床應用。

目前臨床上移植造血干細胞主要是用臍血和骨髓來源的造血干細胞，而體外分化和擴增得到造血干細胞只能通過動物試驗來獲得。將造血干細胞植入重建小鼠體內，可以評價造血干細胞的功能。體外分化獲得的造血干細胞和臍血中的造血干細胞與重建小鼠體內造血系統(tǒng)差異較大，需要進一步優(yōu)化體外誘導多能干細胞分化為造血干細胞的過程，才能滿足該實驗需求

4 小結

通過將IPS定向分化為造血干細胞的研究，成功誘導了造血干細胞，分化得到的細胞在體外培養(yǎng)中形成了所需的各系集落，本文的研究所采用的技術方法希望可以為IPS細胞在造血疾病中的應用提供一定的實驗依據(jù)。

參考文獻：

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篇9

關鍵詞：槲皮素；抑制；膀胱癌

【中圖分類號】R735.2 【文獻標識碼】A 【文章編號】1672-3783(2012)06-0277-01

槲皮素(quercetin，Que)是一種天然的黃酮類化合物，廣泛存在于多種植物中，尤以紅麻葉和湖南連翹中含量較高，具有抗感染、抗過敏、清除氧自由基、降血脂等多種藥理作用[1]。最近也發(fā)現(xiàn)其具有廣泛的抗腫瘤的作用[2]。本實驗主要探討了槲皮素抑制人膀胱癌細胞增殖的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料來源:槲皮素購自Sigma公司，用DMSO(上海生物試劑廠)配成1000×儲存液，-20℃保存。BIU-87人膀胱癌細胞株購自武漢大學典藏中心。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組培養(yǎng):將膀胱癌細胞株培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基中，在對數(shù)生長期時，收集細胞并調整細胞濃度為 4×104個／ml，接種于96孔板，每孔加100μl細胞懸液。24h后，實驗組分別加入終濃度分別為 0、70、140、210μmol／L的槲皮素，另一孔只加培養(yǎng)液，作為空白對照，每組分別設5個復孔。

1.2.2 活性檢測:分別在24、48和72h后，加入20μl (5mg／ml)的MTT，4h后棄上清。再加入200μl 的DMSO，用酶標儀(波長570nm)測定各孔吸光度(A值)，并計算細胞生長抑制率。

1.2.3 細胞凋亡率檢測:取對數(shù)期膀胱癌細胞，接種于6孔板，培養(yǎng)24h后，再加入槲皮素至終濃度70、140和210μmol／L，然后在流式細胞儀(FACS-Calibur)上進行細胞凋亡分析檢測。

2 實驗結果

2.1 形態(tài)觀察:對照組膀胱癌細胞呈長梭形，邊緣比較光滑整齊，核大。而經(jīng)槲皮素處理的膀胱癌細胞開始變圓，核部分碎裂，并有部分細胞脫離培養(yǎng)板。

2.2 細胞活性檢測:與對照組相比，各濃度間的增殖抑制率差異顯著（p

2.3 流式細胞儀檢測凋亡結果:分別是0、70μmol/L、 140μmol/L 和210μmol/L槲皮素濃度作用結果。槲皮素作用24h后凋亡率分別為0.58%、12.28%、15.14%和24.31%；作用48h后凋亡率分別為0.77%、14.15%、23.32%和37.39%；作用72h后凋亡率分別為14.24%、55.48%、57.81%和62.57%。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可誘導多種惡性腫瘤細胞的生長，但槲皮素作用于人膀胱癌細胞的研究報道較少。結果顯示，終濃度為70-210μmol/L 的槲皮素對膀胱癌細胞有顯著地抑制作用，通過流式細胞儀檢測其凋亡，隨著時間和濃度的增加，凋亡率也增加，作用48h凋亡率最大達到37.39%，而到72h凋亡率達到了62.57%。其凋亡機制可能與下列因素有關：阻滯細胞周期[3]、下調熱休克蛋白、誘發(fā)Bcl-2的表達等導致細胞增殖抑制。本研究建立了槲皮素抑制膀胱癌細胞生長的細胞模型，并且槲皮素還可抑制腫瘤血管生成和轉移等多種途徑來發(fā)揮其抗腫瘤的作用，因而推測它將是很有應用前景的治療腫瘤的天然藥物。

參考文獻

[1] Nijveldt R J，Van Nood E，Van Hoorn D，et a1．F1avonoids：a review of probable mechanisms of action and potentials applications[J]．AMJ Clin Nutr，2001，74：418-425

篇10

    【關鍵詞】 粉防己堿 ;卵巢癌 ;增殖; 凋亡

    粉防己堿(Tetrandrine)別名稱漢防己甲素,是從中草藥粉防己的塊根中提取的雙芐基異喹啉類生物堿,對高血壓、心律失常、肺纖維化等疾病具有較好的療效。近年來的研究表明,粉防己堿可抑制多種腫瘤細胞生長,作為一種潛在的抗腫瘤藥物,其相關研究頗受關注。卵巢癌是女性生殖器官三大惡性腫瘤之一,其死亡率高居婦科腫瘤之首,術后化療仍是卵巢癌最重要的輔助治療措施,但由于化療的毒副作用及腫瘤抗藥性的增加其療效顯著降低,我們從抗腫瘤的植物藥中,篩選出粉防己堿,觀察其對卵巢癌HO-8910細胞的作用。

    1 材料與方法

    1.1 材料 人卵巢癌細胞株HO-8910(中科院上海細胞所提供);粉防己堿(江西銀濤藥業(yè)有限公司),25℃溶于DMSO中;胰蛋白酶、RPMI-1640、吖啶橙、胎牛血清(華美生物公司);MTT及二甲亞砜DMSO(sigma公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 細胞培養(yǎng) 人卵巢癌HO-8910細胞株,培養(yǎng)基為RPMI-1640內含10%滅活胎牛血清、37℃、5%二氧化碳的飽和濕度培養(yǎng)傳代。

    1.2.2 實驗分組 共分5組:實驗組:加入粉防己堿,終濃度分別為1.0mg/L,5.0 mg/L,10.0 mg/L及20.0 mg/L組;對照組:加入等量的RPMI-1640培養(yǎng)液(每組設6個復孔)。

    1.3 實驗指標的檢測

    1.3.1 MTT試驗

    取對數(shù)生長期的HO-8910細胞,制成濃度為1×105個/mL的單細胞懸液,接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔200μL,過夜貼壁后;實驗組加入1.0mg/L, 5.0 mg/L,10.0 mg/L及20.0 mg/L的粉防己堿,對照組加等量的RPMI-1640。每組設6個復孔,繼續(xù)培養(yǎng)24、48h后加入MTT(5mg/mL) 20μL/孔,4h后吸凈上清液,加入DMSO 20μL/孔,震蕩10min,用酶標記光儀在波長為560nm時測定每孔的吸光度(A)值,計算不同濃度抗體對細胞增殖的抑制率[抑制率=(對照組A均值-實驗組的A均值) /對照組A均值 [1]]。

    1.3.2 AO染色

    取對數(shù)生長期的HO-8910細胞,制成濃度為5×105個/mL的單細胞懸液,按上述粉防己堿濃度培養(yǎng)48h后,離心棄上清,用PBS洗3次,95%乙醇固定15~30min;1%醋酸酸化30s;加入0.01%AO染色1~5min,封片,鏡下觀察并攝影。

    1.3.3 流式細胞儀檢測細胞周期

    取對數(shù)生長期的HO-8910細胞,制成濃度為1×106個/mL的單細胞懸液,按上述濃度培養(yǎng)24h后,收集細胞,PBS洗滌,制成單細胞懸液,用70%的冰乙醇4℃固定12h,用含核糖核酸酶及碘化丙錠的染液染30min,上流式細胞儀進行檢測。

    1.3.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡率

    取對數(shù)生長期的HO-8910細胞,制成濃度為1×106個/mL的單細胞懸液,接種于6孔培養(yǎng)板中,按上述濃度培養(yǎng)24h后,收集細胞,用AnnexinV-FITC/PI雙標記染色后做流式細胞儀雙色分析。

    1.4 統(tǒng)計學處理

    采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析,所有數(shù)據(jù)均用±s表示,統(tǒng)計方法采用方差分析,組間比較采用q檢驗。

    2 結 果

    2.1 MTT試驗結果

    實驗結果顯示:粉防己堿對HO-8910細胞的生長具有明顯的抑制作用, 實驗范圍內最大抑制率達61.35%,且抑制作用隨藥物濃度增加、作用時間延長而增強,呈現(xiàn)劑量、時間依賴性作用, 經(jīng)統(tǒng)計學檢驗差異具有顯著性意義(P< 0.01,見表1)。

    表1 實驗組和對照組卵巢癌細胞內的吸光度值和增殖抑制率(±s)組別粉防己堿

    (mg/L)24h吸光度值(±s)抑制率(%)48h吸光度值(±s)抑制率(%)對照組00.605±0.00600.608±0.0050實驗組10.562±0.004*7.110.535±0.003*12.0150.508±0.009*16.030.420±0.005*30.92100.450±0.008*25.620.325±0.003*46.55200.333±0.008*44.960.235±0.003*61.35

    注:同一作用時間采用方差分析及q檢驗*P<0.01;同一濃度組采用t檢驗P<0.05

    2.2 AO染色

    凋亡細胞體積明顯縮小,核碎裂,核內可見濃縮邊集的染色質,呈新月形或腎形致密濃染的黃綠色染色,熒光亢進 (圖1)。

    2.3 粉防己堿對卵巢癌細胞周期分布和凋亡率的影響

    不同濃度粉防己堿作用卵巢癌細胞24h后,與對照組相比,細胞周期分布、凋亡率均發(fā)生改變,即G1/G0期細胞比例數(shù)上升,S期和G2/M期下降,細胞凋亡率上升,均有顯著差異(P<0.05),且與粉防己堿濃度之間具有劑量依賴性(P<0.05,見表2)。

    表2 粉防己堿對卵巢癌細胞周期分布和凋亡率的影響(±s)注:采用方差分析*P<0.01

    3 討 論

    粉防己堿是一種具有廣泛藥理學作用的雙芐基異喹啉類生物堿,是粉防己的主要有效成分。早期研究表明粉防己堿具有消炎、鎮(zhèn)痛、降壓、抗纖維化等廣泛的藥理作用。近年來的研究證實粉防己堿是天然的非選擇性的鈣通道阻滯劑,又是鈣調蛋白的拮抗劑,具有直接抗腫瘤的作用。Kuo等[2]發(fā)現(xiàn),粉防己堿不僅抑制人肝癌Hep G2細胞株的生長,還可誘發(fā)凋亡。何琪揚[3]等采用臺盼藍計數(shù)法發(fā)現(xiàn)粉防己堿對敏感急性白血病細胞株HL260和抗三尖杉酯堿的HL-60細胞均有生長抑制作用。王瑞珍[4]等用粉防己堿處理人食管癌細胞,觀察到腫瘤細胞分裂指數(shù)低于對照組約50%。Dong Y[5]等觀察到粉防己堿可抑制HL260細胞生長,認為粉防己堿可通過誘導腫瘤細胞凋亡而抑制腫瘤細胞生長。