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篇1

關(guān)鍵詞：鰱魚（Hypophthalmichthys molitrix）；水解蛋白；運(yùn)動型飲料；復(fù)配

中圖分類號：TS275.4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）16-3957-02

魚水解蛋白具有抗過敏、抗氧化、降低膽固醇、降低血壓和增強(qiáng)免疫力等諸多生理功能，因此目前已成為世界各國的研究熱點(diǎn)[1]。運(yùn)動型魚水解蛋白飲料最適合于運(yùn)動員在運(yùn)動期間飲用，既補(bǔ)充營養(yǎng)又提供水分。本研究以鰱魚為材料，研究運(yùn)動型飲料的最佳復(fù)配條件，旨在開發(fā)新型運(yùn)動飲料，為實(shí)際生產(chǎn)打下一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑 原料鰱魚為市售。木瓜蛋白酶（1.4萬U/g），中性蛋白酶（1萬U/g）。氫氧化鈉、溴甲酚綠、檸檬酸、氯化鈉、氯化鉀均為分析純；檸檬香精、亮藍(lán)均為食用級。

1.1.2 儀器與設(shè)備 電子天平，攪拌機(jī)，PHS-25型數(shù)顯酸度計(jì)，HH恒溫水浴鍋，離心機(jī)，SHZ-95A型循環(huán)水式多用真空泵，RE-52AAA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，85-2數(shù)顯恒溫磁力攪拌器。

1.2 方法

1.2.1 運(yùn)動型魚水解蛋白飲料的制作工藝 ①魚蛋白水解液的制取。原料—預(yù)處理—搗碎勻漿—配成溶液—過濾—加酶水解—滅酶—離心—抽濾上清液—取上清液[2]。②脫腥脫臭。添加10 g/L酵母粉，在35 ℃下作用1.5 h，添加15 g/L的活性炭，調(diào)節(jié)至pH 4.5，作用0.5 h，減壓過濾[3]。③濃縮。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將水解液濃縮至原有體積的10%。④復(fù)配工藝[4]。將20 mL魚蛋白水解濃縮液用去離子水定容至100 mL，將白砂糖、檸檬酸溶解于魚水解蛋白稀釋液中，加入維生素、香精、無機(jī)鹽調(diào)配后進(jìn)行灌裝、滅菌。

1.2.2 正交試驗(yàn) 選取直接影響飲料色澤、香氣、滋味的白砂糖、檸檬酸、香精、無機(jī)鹽（NaCl和KCl濃度比2∶1）為主要影響因素，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化復(fù)配條件，因素與水平見表1。

1.2.3 感官鑒定與檢測方法

1）感官鑒定評分標(biāo)準(zhǔn)。感官鑒定評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。運(yùn)動型魚水解蛋白飲料經(jīng)復(fù)配后，根據(jù)表2，對飲料的色澤、香氣、滋味以及組織狀態(tài)打分，進(jìn)行感官鑒定。

2）檢測方法。氨基氮含量測定采用電位滴定法，鉀、鈉含量的測定采用火焰光度測定法，維生素C（VC）含量的測定采用2，6-二氯靛酚滴定法[5，6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 配方的確定

由表3中4個因素的極差分析可知，各因素對飲料口感影響為A>B>C>D，即白砂糖對飲料口感影響最大，無機(jī)鹽對口感影響最小。最佳工藝配方為A2B2C2D1，即魚蛋白水解液添加量為20%，白砂糖為100 g/L，檸檬酸為2.5 g/L，香精為0.3%，NaCl為1.0 g/L，KCl為0.5 g/L，在此復(fù)配條件下獲得的運(yùn)動型魚水解蛋白飲料酸甜適中，無魚腥味，具有檸檬清香，口感最好。

2.2 滅菌條件的確定

pH

2.3 保溫試驗(yàn)結(jié)果

將運(yùn)動型魚水解蛋白飲料灌裝、滅菌后置于37 ℃條件下保溫一周，進(jìn)行感官鑒定。結(jié)果顯示，運(yùn)動型魚水解蛋白飲料無脹罐現(xiàn)象，色澤為淡藍(lán)色，均勻一致，無分層現(xiàn)象，無異味，口感無變化，各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)標(biāo)。

2.4 成品的質(zhì)量檢驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 感官檢驗(yàn)結(jié)果 色澤：淡藍(lán)色，清爽宜人；性狀：清澈透明，無懸浮物或沉淀；滋味與香氣：口感酸甜適中，具有檸檬香氣，無魚腥味，無苦味，無異味；穩(wěn)定性：無絮狀沉淀。

2.4.2 微生物檢驗(yàn)結(jié)果 微生物指標(biāo)檢測結(jié)果見表4。

2.4.3 理化檢驗(yàn)結(jié)果 飲料的營養(yǎng)成分見表5。

3 結(jié)論

利用鰱魚的蛋白水解液制備含肽運(yùn)動飲料，成品從口感、風(fēng)味、色澤上都令人滿意。運(yùn)動型魚水解蛋白飲料的研制為鰱魚等低值魚的綜合利用開辟了新的途徑，對提高蛋白質(zhì)利用率、拓寬蛋白質(zhì)利用渠道有重要意義。運(yùn)動型魚水解蛋白飲料有益于運(yùn)動后體力的恢復(fù)，為運(yùn)動型飲料的未來發(fā)展提供了新的思路。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李清春，張景強(qiáng).水解蛋白的特性及在食品中的應(yīng)用[J].食品工業(yè)，2001，22（3）：7-8.

[2] 許慶陵.鰱肉脫脂及其酶解技術(shù)研究[J].現(xiàn)代食品科技，2006， 22（2）：98-102.

[3] 施文正.白鰱魚蛋白水解液脫腥脫苦的研究[J].海洋水產(chǎn)研究，2004，25（3）：31-32.

[4] 裘迪紅，戴志遠(yuǎn)，周 濤，等.水解鮐魚蛋白制備運(yùn)動員飲料[J].食品科技，2000（6）：49.

[5] 侯曼玲.食品分析[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2008.128-129.

篇2

關(guān)鍵詞：大豆蛋白　Alcalase　酶解

一、實(shí)驗(yàn)原理

水解蛋白質(zhì)的反應(yīng)式。大豆蛋白原料組成：蛋白質(zhì)含量為91%；水分含量的測定采用常壓直接干燥法，測得水分含量為7.35％。

二、Alcalase水解大豆蛋白

1.酶解反應(yīng)

步驟如下：(1)將大豆蛋白在105℃下干燥至恒重，稱取一定量上述原料加入反應(yīng)釜，按照設(shè)計(jì)的底物濃度向反應(yīng)釜中補(bǔ)充適量水。(2)連接反應(yīng)釜和超級恒溫水浴，然后啟動磁力攪拌器和超級恒溫水浴，使溫度為控制溫度下。(3)在反應(yīng)釜上安裝pH計(jì)電極，在攪拌下以一定方式加入蛋白酶進(jìn)行水解。(4)在反應(yīng)過程中不斷進(jìn)行攪拌，并滴加2mol/LNaOH維持pH值不變。(5)水解結(jié)束后，水解液經(jīng)過高溫滅活(95℃下加熱5min)，在4000r/min的條件下離心10min，取適量上清液供分析用。

酶解效果評價(jià)：采用大豆蛋白的水解度指標(biāo)評價(jià)酶水解效果，大豆蛋白水解度（HD）的測定是描述蛋白質(zhì)水解程度的一個非常重要的量。測得的蛋白質(zhì)相應(yīng)含量就可以計(jì)算出1克水解大豆蛋白樣相應(yīng)的HD值：

HD=[0.01×V/（3×0.1）-0.33]/7.8

2.pH值定測

利用儀器校正后測量，將每組測取三個數(shù)據(jù)取平均值。

三、結(jié)果與討論

1.大豆蛋白的酶解

酶解蛋白質(zhì)通常是在維持體系pH值不變條件下進(jìn)行的。蛋白質(zhì)在酶解的過程中pH值一般呈明顯的下降趨勢，其根本原因是肽鍵打開后羧基的酸性造成的，可通過向水解液中加NaOH溶液維持pH值不變。

2.單因素水解條件的考察

2.1pH值對水解度的影響

水解條件：酶與底物比45

；底物濃度60g/L；水解時(shí)間2h；溫度60℃。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3-1所示。由圖3-1可以看出，水解度隨著pH值的增大先升后降，即存在著最佳的pH值， pH值為8.0時(shí)水解度最高。

2.2溫度對大豆蛋白水解度的影響

水解條件：酶與底物比75

；底物濃度60g/L；水解時(shí)間2h；pH值8.0。在pH值為8.0的條件下水解大豆蛋白時(shí)，水解度隨著溫度值的增大先升后降，即存在著最佳的溫度，溫度為70℃時(shí)水解度最高。

2.3酶與底物比對大豆蛋白水解度的影響

水解條件：水解溫度60℃；底物濃度60g/L；水解時(shí)間2h；pH值8.0。隨著酶與底物比的增加，水解度呈上升趨勢，但是當(dāng)酶與底物比達(dá)到40 以后，再增加酶與底物比水解度的增加不是非常顯著，這可能是因?yàn)槊概c底物比高于40

以后酶在底物表面的吸附作用己達(dá)到飽和。故我們選擇酶與底物比為40

。

底物濃度對大豆蛋白水解率的影響。水解條件：水解溫度60℃；酶與底物比60 ，pH值8.0；水解時(shí)間2h。由圖3-4可以看出，在較低的底物濃度時(shí)，隨著底物濃度增加，蛋白質(zhì)水解度逐漸增大，但底物濃度增加到一定程度后再繼續(xù)增加，水解度下降，故Alcalase水解大豆蛋白的最適反應(yīng)物濃度為50g/L。

3.正交試驗(yàn)確定大豆蛋白的最佳水解條件

考慮到各因素的相互依賴和相互制約，導(dǎo)致對酶解效果的影響，進(jìn)行正交試驗(yàn)以確定各參數(shù)的最佳組合。按正交表L9(34)設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以水解度測定指標(biāo)，來考查4個因素對水解效果的影響，水解時(shí)間為2h。

從正交試驗(yàn)得到的最佳水解條件為：底物濃度50g/L，水解溫度70℃，酶與底物比60

，pH值8.0。

在4個因素的極差值中，對于水解度與底物比最大，底物濃度其次，pH值最小，4個因素對水解度影響的大小順序?yàn)椋篊>D>A>B，即酶加入量>底物濃度>溫度>pH；

4.水解時(shí)間考查

影響酶解蛋白水解程度的另一重要因素為反應(yīng)時(shí)間，在以上最佳水解條件下，考察了大豆蛋白水解度隨時(shí)間的變化情況。隨著水解時(shí)間的延長，水解度不斷增加，但當(dāng)水解時(shí)間為4h后，再延長水解時(shí)間，水解度增加較慢，所以水解時(shí)間可取為4h，此時(shí)水解度達(dá)到24.6%。

篇3

關(guān)鍵詞：堿性蛋白酶 木瓜蛋白酶 協(xié)同水解 大豆蛋白

中圖分類號：R84 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1672-5336（2014）10-0085-03

1 引言

1.1 研究意義與目的

本實(shí)驗(yàn)以大豆蛋白為酶解底物，選擇工業(yè)用酶―堿性蛋白酶和常用的木瓜蛋白酶進(jìn)行深度水解，引入正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，借助數(shù)學(xué)模型統(tǒng)計(jì)分析獲得較高水解度的綜合方案，探討制備小分子大豆肽的最佳工藝，為開發(fā)功能性大豆蛋白，拓寬其應(yīng)用領(lǐng)域奠定基礎(chǔ)。

1.2 技術(shù)路線

實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線如下：

豆粕（粉碎）加水調(diào)漿水浴（90℃ 10min）水浴攪拌調(diào)pH

蛋白酶水解滅酶（90℃ 10min）調(diào)酸（pH4.5）離心（4000轉(zhuǎn) 10min）

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

堿性蛋白酶2.4L：食品級，酶活力2.4AU/g，丹麥NOVO公司出品；木瓜蛋白酶：食品級，酶活力2000U/g，西安Wolsen公司出品；低溫脫脂豆粕：含水量7.9%，蛋白質(zhì)含量51.49%，脂肪含量0.86%，山東萬德福。

2.2 主要儀器和設(shè)備

水浴鍋：DK―98―1型，天津市泰斯特儀器有限公司；pH計(jì)：pHSJ―4A，上海精密科學(xué)儀器有限公司；精密增力電動攪拌器：JJ―1，常周國華電器有限公司；自動電位滴定儀：ZDJ-4A，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

2.3 試驗(yàn)方法

2.3.1 水解條件的研究

（1）大豆蛋白的酶解反應(yīng)。1）大豆蛋白預(yù)處理。豆粕粉碎后加水調(diào)漿制成各濃度大豆蛋白溶液，在90℃溫度下恒溫水浴10min。2）大豆蛋白的酶解操作。稱取豆粕粉加入適量水配制成為一定濃度的大豆蛋白溶液，經(jīng)恒溫水浴預(yù)處理后，調(diào)節(jié)溫度至反應(yīng)溫度攪拌20min，調(diào)節(jié)pH值至反應(yīng)值，加入一定比例蛋白酶，在反應(yīng)溫度下進(jìn)行恒溫酶解，酶解過程中需要不斷進(jìn)行攪拌，同時(shí)通過滴加1N的NaOH溶液以保持反應(yīng)體系pH值恒定，反應(yīng)偏差一般控制在±0.1。記錄NaOH溶液的滴加量，利用pH-stat法計(jì)算水解度。

（2）酶組合順序的考察。在酶催化水解反應(yīng)中，以pH值、溫度、底物濃度、酶用量對反應(yīng)速度影響較大，而酶用量是針對溶液中蛋白質(zhì)的含量，與底物濃度成正比關(guān)系，因此只需確定適當(dāng)?shù)膒H值、溫度、底物濃度[1]。堿性蛋白酶最佳水解條件：pH8.5，60℃，[S]6%，酶用量6.0，木瓜蛋白酶最佳水解條件：pH6.7，55℃，[S]5%，酶用量0.51[2]。

因此結(jié)合堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶最佳水解條件，建立表2實(shí)驗(yàn)來對酶組合進(jìn)行考察。

2.3.2 最優(yōu)水解條件下產(chǎn)物的制備與測定

（1）水解產(chǎn)物的制備。

將大豆蛋白酶解液加熱升溫至90℃，保溫10min 使酶活力喪失。冷卻至室溫后取酶解液調(diào)節(jié)pH至大豆蛋白等電點(diǎn)（pH4.5）后取一部分酶解液在4°C靜置6-24h，以備觀察其沉淀情況。另一部分通過離心機(jī)在4000r/min，離心10min，制得上清液和沉淀。

（2）水解產(chǎn)物的測定。

1）沉淀的測定。把離心后的部分沉淀（m1）稱量后放入烘干箱（65℃）內(nèi)干燥3h后冷卻至室溫，取出稱重后，再按以上方法進(jìn)行復(fù)烘，每隔30min取出冷卻稱重一次，烘至前后兩次重量差不超過0.005g為止，平行試驗(yàn)三個。把干燥物取出，稱量離心管（m2）至恒重，記錄數(shù)據(jù)。

2）上清液的測定。測定離心后酶解液的上清液體積（v），倒出上清液測量體積并置于4℃冷藏保存，用凱式定氮法測定蛋白質(zhì)含量。

2.3.3 統(tǒng)計(jì)研究方法―正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法

在堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解大豆蛋白時(shí)，其水解度會隨著pH值、水解溫度（T）、底物濃度（[S]）等因素的變化會有所不同[2]。確定三因素的取值水平范圍，以水解度（DH）為指標(biāo)，選用三因素三水平實(shí)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案進(jìn)行研究。

3 結(jié)果與討論

3.1 堿性蛋白酶與木瓜蛋白酶協(xié)同水解條件的考察

3.1.1 水解順序的分析

根據(jù)表2做的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3。

結(jié)合表2和試驗(yàn)結(jié)果表3可知，實(shí)驗(yàn)組三、四、五的DH要大于實(shí)驗(yàn)組一、二的DH，說明了雙酶水解的水解程度要大于單酶水解的水解程度。DH7>DH5>DH6、DH10>DH8>DH9、DH13>DH11>DH12，說明在同溫同pH同底物濃度下，雙酶同時(shí)水解的水解程度要大于雙酶前后水解的水解程度。DH13>DH10>DH7>DH3>DH4，說明在同溫同底物濃度下，不同pH的雙酶同時(shí)水解的最小水解程度仍然大于雙酶單獨(dú)水解最佳pH情況下進(jìn)行的前后水解的程度。可以得出結(jié)論，雙酶同時(shí)作用水解要比雙酶前后作用水解程度大。

3.1.2 正交試驗(yàn)確定最佳水解條件

結(jié)合酶組合的考慮和各因素間的相互依賴、相互制約，進(jìn)行正交試驗(yàn)以確定各參數(shù)的最佳組合即酶解大豆蛋白的最佳水解條件。這里用正交表，以水解度（DH%）為測定指標(biāo)，雙酶同時(shí)水解，擬定出試驗(yàn)方案表來考察三個因素對水解的影響，水解時(shí)間為5h。因素分析表如表4。

正交試驗(yàn)表如表5。

由正交試驗(yàn)結(jié)果表5看出，空列R的值小于其它各因素的的R，可以判定個實(shí)驗(yàn)因素的效應(yīng)R是可靠的。極值R越大，則表示因素的水平變化對實(shí)驗(yàn)的影響越大，在實(shí)驗(yàn)中越重要。在影響堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶協(xié)同水解大豆蛋白的水解度的三個因素中，其影響程度大小為A>C>B，最優(yōu)組合為A3B2C1。在此組合條件下水解5h，測得水解度為36.30%。故確定堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶協(xié)同水解大豆蛋白的最佳水解條件：pH值為8.5，底物質(zhì)量濃度為5.0%，水解溫度為55℃。

3.1.3 最佳水解條件下的水解曲線

由圖1可知，在雙酶協(xié)同水解的最佳水解條件，水解1h，為保持恒定的pH（8.5）而消耗的堿量最大，此后消耗的堿量逐漸減少。在水解6h的延長時(shí)間里，蛋白質(zhì)酶解液水解程度隨著時(shí)間的延長明顯增加，而在水解的6h后水解速度幾乎不變。在水解時(shí)間達(dá)到6.5h時(shí)，水解度達(dá)到了36.44%。隨著時(shí)間的延長水解度雖呈上升趨勢，但蛋白酶可水解的肽鍵逐漸減少，從經(jīng)濟(jì)方面和水解液苦味的考慮，確定最佳水解時(shí)間為5h。

3.2 最佳水解條件下水解產(chǎn)物的分析

沉淀結(jié)果分析：100ml大豆蛋白溶液可制得約10g豆渣。上清液結(jié)果分析：100ml原料蛋白溶液可制的可溶性蛋白質(zhì)約為214.2mg。另在4℃靜置6-24h的酶解液，其沉淀情況很好，可以明顯的看出上清液和沉淀。

4 結(jié)語

（1）將堿性蛋白酶與木瓜蛋白酶的結(jié)合水解大豆蛋白，水解程度明顯高于單酶水解，雙酶加入順序?yàn)閴A性蛋白酶和木瓜蛋白酶同時(shí)水解較優(yōu)。（2）雙酶水解大豆蛋白的最佳工藝條件為：pH8.5、溫度55℃、底物濃度為5%、堿性蛋白酶加酶量為0.051%（W/V）、木瓜蛋白酶加酶量為6%（W/V），在反應(yīng)時(shí)間為5h的條件下，酶解液中可溶性大豆蛋白含量為3.06mg/ml，水解度為36.30%。（3）各因素對水解度的影響由大到小依次為：pH對水解度的影響最大，其它因素的影響從大到小依次為底物濃度>溫度>時(shí)間。

參考文獻(xiàn)

篇4

關(guān)鍵詞：林蛙油；酶解；營養(yǎng)液

中圖分類號：R282.74　文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A　文章編號：1672-979X(2011)11-0421-03

林蛙油(oviductus ranae)是中國雌性林蛙的干燥輸卵管，是我國東北特產(chǎn)的名貴中藥材，具有補(bǔ)腎益精、養(yǎng)陰潤肺等功效，有很高的藥用、營養(yǎng)價(jià)值。林蛙油含有豐富的蛋白質(zhì)，其粗蛋白含量達(dá)樣品總量50％以上，氨基酸總量達(dá)17.6％，其中人體必需氨基酸含量達(dá)12.8％，氨基酸種類齊全、組成合理，是人類理想的營養(yǎng)蛋白來源。林蛙油還含有鋅、錳、銅等多種微量元素及維生素；以及許多生理活性物質(zhì)，如雌二醇、孕酮、睪酮等激素，不僅是高級營養(yǎng)品和藥用上品，而且是我國出口藥用動物中的重要商品之一。

本研究以林蛙油為主料，采用蛋白酶酶解工藝，生產(chǎn)林蛙油蛋白水解類活性多肽、氨基酸復(fù)合營養(yǎng)液，使林蛙油蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為更易吸收的多肽和氨基酸。一方面可提高林蛙產(chǎn)品的開發(fā)加工層次和科技含量，變資源優(yōu)勢為經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢，另一方面可增加保健食品的花色品種。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

林蛙油(長白山北亞藥業(yè)，產(chǎn)地為長白山地區(qū))；胰蛋白酶(惠世生化)；木瓜蛋白酶(Sigma公司)；β-環(huán)狀糊精(鄭州天通)；732型和717型離子交換樹脂(上海華羚)；檸檬酸(鄭州大田)：蜂蜜為市售。

1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)備

電子天平(島津)；JY92?II超生波細(xì)胞粉碎機(jī)(新芝)；電熱恒溫水浴鍋(東方精瑞)；GL-21LM高速冷凍離心機(jī)(湖南星科)；均質(zhì)機(jī)(中東食品機(jī)械)；高壓滅菌鍋(百奧)。

1.3生產(chǎn)工藝

林蛙油預(yù)處理-酶解-脫鹽-調(diào)配-均質(zhì)-罐裝-殺菌-成品

-環(huán)狀糊精，檸檬酸，蜂蜜

1.4操作要點(diǎn)

1.4.1原料預(yù)處理林蛙油干品去筋膜和雜質(zhì)后，經(jīng)液氮研磨粉碎，配置成1：30的濃度，在功率300 W，超聲時(shí)間2 s，間隔時(shí)間2 s的條件下超聲處理，超聲波處理總時(shí)間10 min。

1.4.2酶解采用胰蛋白酶／木瓜蛋白酶分步水解：胰蛋白酶pH 8.5，溫度45℃，每克林蛙油加酶2.64×103U，時(shí)間4 h；木瓜蛋白酶pH 7.0，溫度60℃，每克林蛙油加酶6，24×103U，時(shí)間2 h。酶解反應(yīng)結(jié)束后置入沸水浴5 min，使酶失去活性，終止酶解反應(yīng)，離心取上清備用。

1.4.3酶解液脫鹽將一定體積的林蛙油水解上清液以10倍柱體積／h的流速通過732型陽離子交換樹脂脫鈉處理，收集、合并流出液。然后以同樣流速將水解液通過717型陰離子交換樹脂至流出液呈弱酸性，收集、合并流出液。

1.4.4均質(zhì)均質(zhì)壓力30 MPa，料液溫度一般控制在65～70℃。

1.4.5罐裝鐵聽罐裝，每罐240 mL。

1.4.6殺菌本實(shí)驗(yàn)選擇121℃，15 min；105℃，20min；115℃，20min 3種條件殺菌，比較殺菌效果。

1.5蛋白水解營養(yǎng)液配方的確定

根據(jù)單因素試驗(yàn)，以β-環(huán)狀糊精、檸檬酸、蜂蜜為三因素做三水平正交試驗(yàn)，由10位評價(jià)員采用評分檢驗(yàn)法評定蛋白水解營養(yǎng)液的口感、滋味，每項(xiàng)指標(biāo)各占50分，總分為100分，確定最佳配方。正交試驗(yàn)因素水平表見表l，感官評定表見表2。

2　結(jié)果分析

2.1酶解液脫鹽處理

脫除食品中的鹽分有離子交換、超濾、電滲析等多種方法。超濾和電滲析可有效地脫除大分子化合物中的鹽分，但用于蛋白質(zhì)水解物會損失一些低肽分子，影響氮回收率。本實(shí)驗(yàn)采用的脫鹽方法是強(qiáng)酸、強(qiáng)堿型離子交換樹脂脫除蛋白水解液中的鹽分。因?yàn)閺?qiáng)酸、強(qiáng)堿型樹脂的抗污性強(qiáng)，對有機(jī)物吸附力相對較弱，氮回收率較高。經(jīng)測定表明，經(jīng)過陰陽離子交換樹脂后大部分鹽分除去，脫鹽率達(dá)90.05％，氮回收率達(dá)92.05％。經(jīng)過離子交換樹脂后水解液顏色變淺，說明在脫鹽的同時(shí)也起到了脫色作用。

2.2蛋白水解營養(yǎng)液配方確定

一般蛋白飲料的蛋白質(zhì)含量≥1％，綜合考慮營養(yǎng)和成本，本實(shí)驗(yàn)采用蛋白質(zhì)濃度為2％。經(jīng)過凱氏定氮測得蛋白質(zhì)濃度為2，275％，故可直接調(diào)配。

由于水解物有一定的腥味、苦味，故使用B，環(huán)狀糊精來掩蓋異味。對β-環(huán)狀糊精、檸檬酸、蜂蜜3個因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，探討營養(yǎng)液的最佳配方。結(jié)果見表3。

由表3可見，影響因素大小依次為B>A>C，即檸檬酸>β-環(huán)狀糊精>蜂蜜；最佳配方為A282C，即β-環(huán)狀糊精添加量為2.0％，檸檬酸添加量為0.15％，蜂蜜添加量為8％。該產(chǎn)品酸甜適口，口感柔和，無林蛙油腥味，無酶水解后的苦味，回味較好。

2.3殺菌條件的確定

不同殺菌條件的效果見表4。

試驗(yàn)表明，105℃，20 min殺菌結(jié)果較好，營養(yǎng)成分破壞相對較少。

2.4蛋白水解營養(yǎng)液測定結(jié)果

蛋白水解營養(yǎng)液基本成分見表5。

2.5產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

(1)感官指標(biāo)：淺黃色，質(zhì)地均勻、無沉淀，酸甜適口，口感柔和，無異味；

(2)理化指標(biāo)：蛋白質(zhì)2.2％，總糖7.2％，脂肪0.32％；

(3)微生物指標(biāo)：細(xì)菌總數(shù)2個/mL，大腸菌群數(shù)0個；無致病菌檢出。

3　結(jié)論

3.1采用陰陽離子交換樹脂脫鹽，脫鹽率達(dá)90.05％，氮回收率達(dá)92.05％。同時(shí)起到一定的脫色作用。

3.2林蛙油蛋白水解營養(yǎng)液配方為β-環(huán)狀糊精添加量2.0％，檸檬酸添加量0.15％，蜂蜜添加量8％。

3.3林蛙油蛋白水解營養(yǎng)液殺菌條件：105℃，20 min。

參考文獻(xiàn)

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篇5

【摘要】 目的 探討丹參對內(nèi)毒素(LPS)致急性肺損傷(ALI)大鼠肺水通道蛋白-1(AQP-1)的調(diào)節(jié)作用。方法 SD大鼠48只，隨機(jī)分為正常組、丹參注射液預(yù)保護(hù)組、丹參注射液7 d治療組、ALI 7 d模型組、丹參注射液8 h治療組、ALI 8 h模型組，每組各8只。分別于7 d和8 h后電鏡及HE染色觀察各組大鼠肺組織病理改變、肺濕/干重比(W/D)及肺臟水通透性的變化，免疫組化法及肺組織勻漿后Western blotting法檢測AQP-1表達(dá)變化；測定血液氧分壓PaO2、血液流變學(xué)、內(nèi)皮素-1(ET-1)濃度。結(jié)果 模型組均出現(xiàn)肺損傷癥狀。丹參注射液7 d治療組的肺水腫病理改變與ALI 7 d模型組比較明顯減輕，血液流變學(xué)指標(biāo)明顯改善，但兩組AQP-1表達(dá)均與正常組無明顯差異(P

【關(guān)鍵詞】 丹參；急性肺損傷；脂多糖；水通道蛋白；血液流變學(xué)

Abstract：Objective To investigate the effect of SM on aquaporin-1 (AQP-1) expression in rats with acute lung injury (ALI) induced by lipopolysaccharide (LPS). Method 48 SD rats were randomly pided into normal group， ALI 7-day group， ALI 8-hour group， SM prevention group， SM 7-day treatment group， and SM 8-hour treatment group， 8 rats per group. At 8 hours and 7 days after treatment， lung wet to dry weight ratio， lung pathology， electron microscope， AQP-1 immunohistochemistry， and AQP-1 Western blotting were performed. The situation of hemorheology and serum level of PaO2 and Endothelin-1(ET-1) were also detected. Results The model group rats all appeared ALI symptom. Compared with the 7-day ALI group， the degree of lung edema statement alleviated in SM 7-day treatment group. But the expression difference of AQP-1 was not significant between the two groups (P

Key words：Salvia miltiorrhiza；acute lung injury；lipopolysaccharide；aquaporin-1；hemorheology

如何早期有效干預(yù)急性肺損傷(Acute Lung Injury，ALI)并阻止其發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)，是當(dāng)今研究的一大熱點(diǎn)。丹參(Salvia miltiorrhiza，SM)是常見的活血化瘀中藥，具有抗炎、抗氧化、清除氧自由基、抗粘附、抗血栓以及免疫調(diào)節(jié)作用，以往研究表明其對ALI具有保護(hù)作用[1]。肺的水液代謝與水通道蛋白密切相關(guān)，但丹參對AQPs的調(diào)節(jié)作用未見報(bào)道。我們采用內(nèi)毒素誘發(fā)ALI大鼠模型，觀察主要為丹參水溶性成分的丹參注射液對肺水通道蛋白-1(AQP-1)表達(dá)及其病理改變的影響，從而完善了丹參活血化瘀的機(jī)制，為丹參新的藥理效應(yīng)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、藥物及主要試劑

SD大鼠48只，體重180～220 g，雌雄各半，第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供；LPS(E.coliO55：B5 L2880，Sigma公司)；丹參注射液(四川升和制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字Z51021303)；內(nèi)皮素-1(ET-1)放射免疫分析測定試劑盒(北京東雅生物技術(shù)研究所)；AQP-1兔抗鼠多克隆抗體(AB3272，美國Chemicon)。

1.2 內(nèi)毒素大鼠ALI模型的制備及分組

隨機(jī)將48只雌雄各半SD大鼠分為正常組(A組)、ALI 7 d模型組(D組)、ALI 8 h模型組(F組)、丹參注射液預(yù)保護(hù)組(B組)、丹參注射液7 d治療組(C組)、丹參注射液8 h治療組(E組)，每組動物各8只。全部動物以速眠新Ⅱ注射液(0.8 mL/kg)肌肉注射麻醉，仰臥50°固定，B～F組氣管內(nèi)滴注LPS(150 μg/kg，0.5 mL/kg)，然后直立并旋轉(zhuǎn)大鼠，使藥物在肺內(nèi)均勻分布。A組以等量生理鹽水代替。B組每日預(yù)先給予腹腔注射丹參注射液(1.5 mL/kg)，B、C、E組分別于LPS滴注0.5 h后給予腹腔注射丹參注射液。D、F組同時(shí)同法給予等量生理鹽水。

1.3 觀察項(xiàng)目及方法

A、B、E、F組大鼠分別在給予生理鹽水或LPS后8 h，速眠新Ⅱ注射液肌注麻醉，腹主動脈取血8 mL。1 mL行血?dú)夥治觯? mL加入3%的EDTA-Na20.1 mL抗凝，離心(3 500 r/min，10 min)取上清液，-70 ℃冰箱保存待測ET-1；5 mL加入肝素鋰抗凝管中，于4 h內(nèi)檢測血液流變學(xué)。斷頭處死動物，開胸分離肺組織。取右肺上葉2.5%戊二醛固定，作透射電鏡觀察；結(jié)扎右肺中、下葉，肺內(nèi)注射少量10%甲醛固定，作病理學(xué)觀察及免疫組化染色(10%甲醛固定，石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察)，免疫組化結(jié)果以單個視野下每平方毫米陽性微血管數(shù)表示；取左肺下葉勻漿，用Western Blotting測AQP-1蛋白表達(dá)，應(yīng)用Kodak Digital Science 1D圖像分析軟件對特異性條帶進(jìn)行灰度掃描，以吸光光度值(A值)代表特異性條帶的信號強(qiáng)弱，以此來對目的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行半定量比較。各條帶隨機(jī)取3次，以β-actin為內(nèi)參照，凈密度值=(平均密度－背景密度)×面積。左肺上葉稱重后，置烤箱(60 ℃，5 d)烤至衡重，稱干重，計(jì)算肺濕/干重比值(W/D)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有計(jì)量資料均用x±s表示，應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，多個樣本均數(shù)間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P

2 結(jié)果

2.1 動物觀察

D、F組大鼠毛發(fā)豎直、蜷作一團(tuán)、呼吸急促、爪趾青紫。丹參治療組上述癥狀明顯改善，以C組明顯。C組和D組分別于第3、6天死亡1只。

2.2 肺組織病理學(xué)變化

肺大體觀察，正常對照組肺體積適中，顏色淡紅，無充血現(xiàn)象；ALI模型組肺體積增大，肺緣鈍圓，切面質(zhì)實(shí)，包膜下有點(diǎn)、片狀出血，以F組為重；丹參治療、干預(yù)組較ALI模型組上述病變明顯減輕。光鏡下觀察，正常組肺組織肺泡無萎陷，肺泡和肺間質(zhì)無炎細(xì)胞浸潤，肺泡壁無增厚，無毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血及白細(xì)胞附壁現(xiàn)象；ALI模型組見肺泡腔擴(kuò)張，肺泡壁斷裂，肺泡隔明顯增寬，毛細(xì)血管擴(kuò)張瘀血，腔內(nèi)充滿紅細(xì)胞，有較多中性粒細(xì)胞浸潤；丹參治療、干預(yù)組肺組織上述改變明顯減輕。電鏡下可見，F(xiàn)組大鼠肺組織內(nèi)部分肺泡壁毛細(xì)血管及肺泡上皮基板疏松、增寬；內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、變性，內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接出現(xiàn)裂隙；毛細(xì)血管腔增寬，有紅細(xì)胞聚集；肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞腫脹，胞漿內(nèi)局限性透亮區(qū)、空泡形成，線粒體腫脹、排列紊亂；肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞微絨毛萎縮、減少，部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清。LPS灌注7 d后肺水腫有所減輕，肺泡間隔膠原原纖維出現(xiàn)。丹參治療、預(yù)保護(hù)組肺組織上述改變明顯減輕，且與C組比較，D組膠原原纖維明顯減少。

2.3 W/D值變化

與正常組相比，ALI模型組大鼠W/D值顯著升高；而與ALI模型組相比，經(jīng)丹參治療和預(yù)處理的大鼠W/D值顯著降低。

轉(zhuǎn)貼于

2.4 血?dú)夥治黾?ET-1的水平變化

(見表1)表1 各組大鼠血漿PaO2、ET-1水平的變化(略) 注：與A組比較，*P

2.5 肺微血管內(nèi)皮AQP-1表達(dá)的變化

2.5.1 AQP-1表達(dá)

免疫組化染色顯示，肺組織中肺泡周圍和支氣管周圍的毛細(xì)血管內(nèi)皮及肺泡上皮均有AQP-1陽性染色(棕黃色)，且毛細(xì)血管內(nèi)皮整個周緣較肺泡上皮陽性染色強(qiáng)。提示AQP-1主要表達(dá)于肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞；正常組、模型組與治療組相比，不同時(shí)間AQP-1特異性表達(dá)細(xì)胞類型保持不變。LPS灌注后8 h，AQP-1在毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)明顯下降(P0.05)。

2.5.2 AQP-l蛋白印跡分析

LPS灌注8 h后AQP-1蛋白量較正常組減少(P

3 討論

ALI是以通透性肺水腫為特征的一種臨床綜合征。中醫(yī)認(rèn)為急性肺水腫的病因病機(jī)為邪毒內(nèi)侵，損及內(nèi)臟，氣血運(yùn)行障礙，氣機(jī)逆亂，脈絡(luò)瘀滯。治宜清熱瀉肺、活血利水為大法。丹參性寒味苦，具有養(yǎng)血活血、除煩生津功效。藥理有研究證實(shí)丹參能改善微循環(huán)，增加血流量，減少血小板聚集及血栓形成。有研究表明，丹參能降低內(nèi)毒素休克大鼠肺E-選擇素、白介素- 8水平[2]。

肺泡腔和血管腔間水的快速轉(zhuǎn)運(yùn)有極其重要的生理功能。水的轉(zhuǎn)運(yùn)障礙將會使肺水穩(wěn)態(tài)失衡，導(dǎo)致肺水腫等液體代謝紊亂性疾病。AQPs是一組分子量約為30 kD的小分子膜蛋白，在多數(shù)情況下，對水特異性通透。目前在哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)11種AQPs[3]。在肺組織肺泡內(nèi)水的轉(zhuǎn)運(yùn)主要有兩條途徑，一是伴隨鈉的主動轉(zhuǎn)運(yùn)；二是經(jīng)肺泡上皮的AQPs。分布于肺組織中的AQPs主要有4種：AQP1、AQP3、AQP4和AQP5。AQP1在肺組織中分布較多，主要表達(dá)于肺泡周圍的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，調(diào)節(jié)肺內(nèi)毛細(xì)血管與肺泡間水通透性[4]。

動物氣管滴注脂多糖(LPS)后，動物出現(xiàn)呼吸急促，PaO2顯著降低，血清(漿)ET-1與對照組相比顯著升高；W/D顯著增高，肺組織病理可見肺體積增大，包膜下有點(diǎn)、片狀出血，肺泡隔明顯增寬，肺泡及肺間質(zhì)有較多中性粒細(xì)胞浸潤，部分肺泡可見出血，符合急性肺損傷改變。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS灌注8 h后，肺泡周圍毛細(xì)血管AQP-1表達(dá)明顯降低，但表達(dá)部位沒有改變，7 d后已經(jīng)恢復(fù)。表明AQP的合成而不是轉(zhuǎn)移受到影響。已有研究證實(shí)，在內(nèi)毒素所致急性肺損傷中，4～12 h出現(xiàn)明顯的肺水腫[5]，同時(shí)肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮AQP-1表達(dá)數(shù)量明顯減少[6-7]；當(dāng)肺水腫于損傷24 h后開始明顯減輕時(shí)，檢測微血管AQP-1的表達(dá)有所恢復(fù)，提示肺微血管AQP-1表達(dá)增加對肺間質(zhì)水腫液的吸收有作用。LPS灌注4～12 h是肺水腫高峰期，AQP特異性的表達(dá)位置和量與時(shí)間的關(guān)系與其轉(zhuǎn)運(yùn)水的功能是一致的。AQP-1表達(dá)減少不僅局限于損傷較嚴(yán)重的部位，全肺均能觀察到，提示炎性細(xì)胞可能不是直接介導(dǎo)AQP-1表達(dá)減少的原因。

本實(shí)驗(yàn)給予丹參注射液后大鼠肺損傷程度明顯降低，表現(xiàn)為肺組織滲出明顯減輕、肺W/D顯著下降；動脈PaO2明顯高于模型組，血清(漿)ET-1水平明顯低于模型組。丹參注射液治療、干預(yù)后，血液流變學(xué)明顯改善、多形核中性粒細(xì)胞明顯減少?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》載“丹參味苦、性寒，主心腹邪氣，腸鳴幽幽如走水”。丹參效在活血養(yǎng)血，可舒張血管平滑肌，改善血液的濃、粘、凝、聚、栓狀態(tài)，升高動脈PaO2，降低血清(漿)ET-1水平。《金匱要略》有記載“血不利則為水”，丹參可以通過擴(kuò)張血管、加快血液流速，從而消除血液瘀滯，改善微循環(huán)，因此“血行則水行”，局部的水腫狀態(tài)得以改善。本實(shí)驗(yàn)通過直接觀察AQP-1蛋白的表達(dá)，證實(shí)了丹參對AQP-1的調(diào)節(jié)效應(yīng)，明確了活血化瘀藥丹參可以直接消除局部水腫。丹參注射液預(yù)保護(hù)后肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞AQP-1表達(dá)增加，而治療8 h后AQP-1升高不明顯，可能是因?yàn)闆]有在動物體內(nèi)形成保護(hù)機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，丹參可改善血液流變學(xué)，改善肺氣體交換功能，減輕肺出血；降低ET-1的表達(dá)，抑制肺內(nèi)炎癥反應(yīng)；調(diào)節(jié)AQP-1表達(dá)，減輕肺水腫等病理改變。本實(shí)驗(yàn)完善了丹參活血化瘀機(jī)制，為丹參新的藥理效應(yīng)提供依據(jù)。但丹參調(diào)節(jié)AQP-1的確切分子機(jī)制還有待更深入的研究。

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篇6

【關(guān)鍵詞】 銅，肌紅蛋白，高效液相色譜電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用，水解作用

1 引 言

多肽和蛋白的水解是化學(xué)和生物化學(xué)過程中最為重要的反應(yīng)之一，也是研究分析生物化學(xué)以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的最重要任務(wù)之一。蛋白的序列分析、蛋白結(jié)構(gòu)與功能研究、蛋白質(zhì)與核酸的相互作用以及新型化學(xué)治療藥物的合成等方面均涉及此類反應(yīng)。目前， 可用于促進(jìn)多肽和蛋白水解多采用蛋白水解酶，它們能水解諸如磷酯、蛋白質(zhì)和DNA這類大分子。但這些酶為數(shù)甚少，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能以及工程學(xué)研究的需要， 而且這類生物化學(xué)試劑制備困難、價(jià)格昂貴。因此， 人們一直在探求能夠替代或補(bǔ)充這類水解酶的化學(xué)試劑。由于某些肽酶是以金屬離子為活性中心的，因此， 長期以來人們把一些金屬化合物作為金屬肽酶模擬物加以研究。早期工作大多集中在研究酰胺化合物中酰胺鍵斷裂的結(jié)構(gòu)要求及其機(jī)理，自20世紀(jì)90年代起才在小肽和蛋白質(zhì)肽鍵的水解方面取得突破性進(jìn)展。所采用的金屬元素也日趨多樣，其中包括Co[1]，Ni [2]，Cu[3～5]，Pt[6]和Pd[7，8]等，研究的對象也從小肽發(fā)展到直接使用天然蛋白或基因工程產(chǎn)生的蛋白質(zhì)[9～11]。

Cu2+是一種具有人工金屬酶活性的過渡金屬離子，可以選擇性地水解斷裂多肽和蛋白。但要使Cu2+成為分析生物化學(xué)和蛋白工程中被廣泛接受和采用的試劑，還需要對不同蛋白進(jìn)行一系列的實(shí)驗(yàn)，來確定其水解效率、選擇性和其它相關(guān)性質(zhì)。在生物體系中具有儲存和運(yùn)輸氧功能的肌紅蛋白(Mb)，其大小中等，結(jié)構(gòu)信息已知，非常適用于研究過渡金屬化合物對蛋白的水解作用。本研究采用Cu2+化合物對馬心肌紅蛋白進(jìn)行水解切割研究。實(shí)驗(yàn)表明，Cu2+化合物對肌紅蛋白的水解具有很高的選擇性，并發(fā)現(xiàn)一個在Cu2+化合物水解多肽及蛋白的研究中從未觀察到的新的水解位點(diǎn)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

LCQ電噴霧質(zhì)譜儀(Finnigan MAT); MiniProtean Ⅱ電泳儀(BioRad);UV 3100紫外可見分光光度計(jì)(Shmidzu);UVP White/Ultraviolet 瞬變顯示光密度計(jì);pHS3C pH計(jì)。馬心肌紅蛋白(Sigma公司)、乙腈和三氟乙酸為色譜級，其它試劑均為分析純。

2.2 蛋白的水解反應(yīng)

肌紅蛋白溶于二次蒸餾水后，取上清液備用，其濃度通過在557 nm處測其UVVis譜確定(ε557=13.8 L/(mol·cm)[12]。將銅化合物和肌紅蛋白按Cu∶Mb=5∶1(摩爾比)的比例混合， 在50 ℃ 下恒溫3 d，然后加入EDTA溶液終止反應(yīng)。反應(yīng)終止后加入360 μL標(biāo)準(zhǔn)SDS還原緩沖溶液，將混合物在95 ℃恒溫5 min，然后再冷卻到室溫，取5 μL在BioRad MiniProtein 電泳儀上進(jìn)行聚丙烯酰胺電泳。分離膠：pH 8.8，18%聚丙烯酰胺;濃縮膠：pH 8.6，7%聚丙烯酰胺。用0.1%考馬斯藍(lán)R250染色。

2.3 色譜質(zhì)譜條件

Hypersil C8柱(100 mm×2.1 mm， 5 μm)，流速0.2 mL/min。洗脫液A：含0.1%三氟乙酸的水溶液;洗脫液B：含0.1%三氟乙酸的乙腈溶液。洗脫梯度為60 min內(nèi)從100%A到40%A+60%B。ESI離子源噴霧電壓4.5 kV，毛細(xì)管溫度250 ℃。ESIMS測得的原始數(shù)據(jù)通過Bioexplore軟件計(jì)算蛋白和多肽片斷的分子量。

3 結(jié)果與討論

3.1 銅化合物對蛋白的水解作用

將肌紅蛋白按實(shí)驗(yàn)方法分別與CuCl2，Cu(ClO4)2和Cu(AC)2在50 ℃下恒溫反應(yīng)3 d，聚丙烯酰胺凝膠電泳如圖1。

圖1中第1列為分子量標(biāo)記，第2列是控制實(shí)驗(yàn)，即肌紅蛋白中未加任何銅化合物，在此條件下肌紅蛋白未見任何斷裂現(xiàn)象。這表明水解反應(yīng)確實(shí)是由銅化合物引起的。圖1中3～5列除可觀察到2個主要的片斷帶外，還隱約可見2個較弱的片斷帶。經(jīng)HPLCESIMS實(shí)驗(yàn)證明，2個較強(qiáng)片斷帶之間以及2個較弱片斷帶之間互為補(bǔ)償帶。

從圖1還可見，在完整蛋白帶下還存在一條較淺的帶，即使在新鮮配制的肌紅蛋白的凝膠電泳中，這一淺帶仍然存在，這是由于肌紅蛋白中含有少量雜質(zhì)引起的，而不是其骨架水解斷裂的產(chǎn)物。在研究鈀配合物對肌紅蛋白的水解工作中也觀察到了這個對應(yīng)于蛋白雜質(zhì)的凝膠電泳帶[10] 。

3.2 肌紅蛋白的質(zhì)譜研究

圖2a為肌紅蛋白的原始質(zhì)譜圖，圖2b通過儀器自帶的Bioexplore軟件計(jì)算出的蛋白分子量。由于肌紅蛋白中的血紅素與其多肽骨架僅以His93與Fe2+軸向配位并以弱的氫鍵作用相結(jié)合，它在蛋白的水解反應(yīng)或ESIMS離子源較高的界面勢能中都很易失去。采用質(zhì)譜檢測到的肌紅蛋白的分子量都是去輔基肌紅蛋白的分子量Mr=16951.0，與理論計(jì)算的去輔基肌紅蛋白分子量16951.5十分接近，進(jìn)一步證明了電噴霧質(zhì)譜在生物大分子的分子量測定方面具有極高的可信度。

3.3 水解位點(diǎn)的確定

在蛋白質(zhì)和多肽化學(xué)水解的研究中，反應(yīng)產(chǎn)生的多肽片斷通常是由N端氨基酸序列分析結(jié)合MALDITOF或ESIMS來確定的。本研究采用HPLCESIMS確定水解位點(diǎn)。肌紅蛋白與銅化合物反應(yīng)終止后注入HPLC柱分離，分離后的樣品直接進(jìn)入與分離柱相連的ESIMS檢測分析。測得的多肽片斷分子量分別為10093.0和10388.0(圖3a)以及6876.0和6581.0(圖3b)。從得到的片斷分子量發(fā)現(xiàn)，圖3中分別有2個片斷分子量之和恰好等于去輔基肌紅蛋白的分子量加上1個水分子的分子量(10093+6876=16951+18，10388+6581=16951+18)。這表明，圖1中強(qiáng)度較強(qiáng)的片斷即分子量為10093和6876的片斷之間以及強(qiáng)度較弱的片斷即分子量為10388和6581的片斷之間互為補(bǔ)償帶，分別對應(yīng)于Gly1Gln91和Ser92Gly153以及Gly1Ala94和Thr95Gly153的肌紅蛋白多肽片斷的分子量。由HPLCESIMS測得的多肽片斷分子量與通過Paws軟件計(jì)算的相應(yīng)片斷分子量的值分別列于表1。表1 水解所得多肽片斷的實(shí)驗(yàn)值和理論值

Table 1 Experimental and theoretical molecular masses of fragments from hydrolyzation方法 MethodGly1Gln91Ser92Gly153Gly1Ala94Thr95Gly153HPLCESIMS10093.006876.0010388.006581.00Paws計(jì)算值 Calculated10092.586876.8910387.876581.59 由表1可見，實(shí)驗(yàn)值和理論計(jì)算值非常吻合，再次證明電噴霧質(zhì)譜對蛋白和多肽分子質(zhì)量的測量有著良好的精確度。圖3中還出現(xiàn)了1個分子量為8477.0的峰，此峰是完整肌紅蛋白的二價(jià)離子峰，此峰在完整肌紅蛋白的ESIMS中也可觀察到(圖2b)。這一峰值的出現(xiàn)表明，在HPLC條件下水解產(chǎn)生的多肽片斷和完整蛋白未能完全分離，而電噴霧質(zhì)譜仍能分別將它們檢出，這是對ESIMS高分辨能力的又一有力證明。

3.4 水解反應(yīng)的活性位點(diǎn)

在多肽及蛋白水解反應(yīng)中，被Cu2+水解的多肽和蛋白都有一個共同的特征，即都含有ThrHis或SerHis的氨基酸序列，且Cu2+都是與組氨酸的側(cè)鏈配位，只有直接位于SerHis或ThrHis前沿的肽鍵對水解反應(yīng)才靈敏。去輔基肌紅蛋白由153個氨基酸殘基組成，其中有11個組氨酸，它們都是Cu2+的可能配位點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)中還未發(fā)現(xiàn)Cu2+與His93以外的組氨酸配位從而引起相鄰肽鍵斷裂的跡象。而肌紅蛋白氨基酸序列中只有His93才與Ser或Thr 相鄰，即……Gln91Ser92His93Ala94Thr95Lys96……。本實(shí)驗(yàn)中，銅化合物與肌紅蛋白產(chǎn)生的水解反應(yīng)出現(xiàn)了2個斷裂點(diǎn)：His93前沿的Gln91Ser92，His93后沿的Ala94Thr95。前者與文獻(xiàn)[2]報(bào)道的Cu2+對蛋白水解反應(yīng)的特征相符，后者是本研究中觀察到的Cu2+離子水解反應(yīng)的一個新的活性位點(diǎn)。Gln91Ser92位點(diǎn)的斷裂對應(yīng)于圖1中2個較強(qiáng)的片斷帶，Ala94Thr95位點(diǎn)的斷裂則對應(yīng)于圖1中2個較弱的片斷帶。

肌紅蛋白中His93與其輔基血紅素中Fe2+軸向配位，要使Cu2+與His93配位，先將His93與Fe2+解配。無論血紅素解配還是Cu2+配體進(jìn)入血紅素空腔都要克服空間位阻、極化效應(yīng)等障礙，故Cu2+與His93配位比與肌紅蛋白中其它組氨酸配位都更困難。但是，在它與肌紅蛋白的水解作用中僅出現(xiàn)His93前后沿的肽鍵斷裂。這說明Cu2+對蛋白質(zhì)的水解具有非常高的選擇性。

參考文獻(xiàn)

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3 Buranaprapuk A， Leach S P， Kumar C V， Bocarsly J R. Biochim. Biophys. Acta， 1998， 1387: 309～316

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10 Zhu L， Bakhtiar R， Kostic' N M. J. Biol. Inorg. Chem.， 1998， 3: 383～391

篇7

[關(guān)鍵詞] 腦蛋白水解物注射液；腦卒中；抑郁；神經(jīng)功能

[中圖分類號] R743 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2012）07（a）-0026-02

Effects of cerebroprotein hydrolysate for injection combination with rehabilitation training in the treatment of post-stroke depression

LIANG Tianjia CHEN Zhaode QIN Fangwei TANG Juan CHEN Xiaoxia

The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, China

[Abstract] Objective To explore the plurality of post-stroke depression (PSD) treatment. Methods Sixty-eight cases of PSD were randomly divided into treatment group and control group with 39 cases in each group, both groups received conventional therapy combined with rehabilitation training and psychological counseling, treatment group was added with cerebroprotein hydrolysate for Injection treatment for 4 weeks. Both two groups were evaluated before and after treatment by Hamilton depression scale (HAMD) score, clinical neural function defect score (CSS) and activities of daily living (ADL) score. Results Before the treatment, two groups' clinical condition, HAMD, CSS and ADL score comparison showed no significant differences (P>0.05). After the treatment, HAMD, CSS and ADL score of two groups were obvious improved (treatment group: P < 0.01, control group: P < 0.05), the effect of treatment group was better than that of control group (P < 0.05). Conclusion Cerebroprotein hydrolysate for injection can promote PSD patients with depression and nerve function recovery, thus facilitating daily life ability.

[Key words] Cerebroprotein hydrolysate for injection; Stroke; Depression; Nerve function

腦卒中抑郁（post stroke depression， PSD）在臨床上發(fā)生率較高，其突出的心理、情緒改變使患者不能配合康復(fù)治療，對病后康復(fù)產(chǎn)生極為不利的影響。近期筆者用腦蛋白水解物結(jié)合康復(fù)訓(xùn)練治療腦卒中抑郁患者，取得較好療效。現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

篇8

1、水解蛋白奶粉強(qiáng)調(diào)的是經(jīng)過水解技術(shù)使得奶粉中的蛋白質(zhì)成分更易被消化吸收；

2、配方奶粉注重的是營養(yǎng)強(qiáng)化，其中會添加些奶粉中含量少的營養(yǎng)成分，強(qiáng)調(diào)完整均衡；

3、就現(xiàn)在的產(chǎn)品來講，水解蛋白奶粉屬于配方奶粉的一種。

（來源：文章屋網(wǎng) ）

篇9

1 資料與方法

1.1一般資料 70例患者均來自本院2005年5月至2011年5月就診病例中，按就診順序隨機(jī)分為治療組及對照組，各35例。治療組患者中年齡最小42歲，最大為82歲，平均年齡62歲，男22例，女13例。對照組年齡最小46歲，最大為80歲，平均年齡為61.5歲，男性25例，女性l0例。兩組在性別、年齡、病程、受教育程度等方面差異無顯著性(P>0.05)，具有可比性。

1.2病例選擇 所有患者均經(jīng)過詳細(xì)詢問病史、體格檢查和生化檢查，通過頭CT和(或)MRI明確診斷。

1.2.1診斷標(biāo)準(zhǔn) ①癡呆診斷標(biāo)準(zhǔn)：意識清醒但智力低下，記憶力減退，附加下列至少兩項(xiàng)不正常，如抽象思維、判斷力、語言表達(dá)、行為及人格異常；②多發(fā)梗塞性癡呆 (MID)的診斷要點(diǎn)如下：高血壓與腦動脈硬化者有小中風(fēng)或中風(fēng)發(fā)作，進(jìn)行性癡呆呈臺階式加重，有神經(jīng)系統(tǒng)局灶癥狀與體征，CT或MRI顯示多發(fā)性軟化灶、腦萎縮與腦室擴(kuò)大征，排除其他器質(zhì)性癡呆。

1.2.2排除標(biāo)準(zhǔn) ①因種種因素不能堅(jiān)持完成規(guī)定療程者；②合并嚴(yán)重的心腎疾患及合并嚴(yán)重糖尿病患者；③嚴(yán)重癡呆。

1.2.3簡易精神狀態(tài)檢查量表(MMSE) ①根據(jù)受教育的程度采用不同的評分界限，MMSE標(biāo)準(zhǔn)分為大學(xué)/大專

1.3治療方法 將入選病例隨機(jī)分為兩組，每組35例。①治療組給予腦蛋白水解物60mg加入5%葡萄糖或0.9%鹽水250ml靜脈點(diǎn)滴，1日1次，14天為1個療程，應(yīng)用4個療程，每兩個療程中間間歇7～10天，并同時(shí)口服銀杏葉片2片，1日3次，連服8周；②對照組給予丹參注射液20ml加5%葡萄糖或0.9%鹽水250ml靜脈點(diǎn)滴，銀杏葉片2片，1日3次，治療時(shí)間同治療組。兩組患者繼續(xù)常規(guī)服用腸溶阿司匹林及降糖、降壓抗感染等藥物對癥治療。

2 療效觀察

2.1療效評定標(biāo)準(zhǔn) 癡呆療效評定標(biāo)準(zhǔn)分為基本控制、顯效、有效和無效。采用簡易精神狀態(tài)檢查量表(MMSE) 得分作為參考標(biāo)準(zhǔn)。MMSE標(biāo)準(zhǔn)：治療后積分較治療前上升

2.2結(jié)果 治療組顯效11例，有效20例，無效4例，總有效率88.57%。對照組顯效8例，有效14例，無效13例，總有效率62.86%。治療組MMSE平均總分治療后比治療前MMSE顯著提高(P

3 討論

腦蛋白水解物是一種大腦所特有的肽能神經(jīng)營養(yǎng)藥物，能以多種方式作用于中樞神經(jīng)，調(diào)節(jié)和改善神經(jīng)元的代謝，促進(jìn)突觸的形成，誘導(dǎo)神經(jīng)元的分化，并進(jìn)一步保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受各種缺血和神經(jīng)毒素的損害。它可透過血腦屏障而促進(jìn)腦蛋白質(zhì)合成，影響呼吸鏈，具有抗缺氧的保護(hù)能力，改善腦內(nèi)能量代謝，激活腺苷酸環(huán)化酶和催化其他激素系統(tǒng)，改善神經(jīng)突觸間的遞質(zhì)傳遞功能，促進(jìn)神經(jīng)元的增生。這些作用可能與其含有的低分子肽的生物活性有關(guān)。動物試驗(yàn)也表明，腦蛋白水解物能調(diào)節(jié)神經(jīng)元代謝，影響神經(jīng)突觸的遞質(zhì)傳遞，主要是刺激神經(jīng)元的能量代謝，使有氧代謝顯著增加；能使葡萄糖透過血腦屏障的量增加，長期使用能顯著降低腦內(nèi)乳酸濃度，顯著提高警覺程度、注意力及記憶力。說明該藥可以改善腦功能，提高癡呆患者的智商，尤其是腦血管疾病所致腦功能障礙。

MMSE是反映患者的定向力、記憶力、注意力、語言能力、理解判斷能力等總體認(rèn)知功能的心理測量工具。由結(jié)果可見，腦蛋白水解物能顯著改善血管性癡呆患者的認(rèn)知功能，配合常規(guī)治療的療效明顯優(yōu)于單用常規(guī)治療，有助于提高患者的生活質(zhì)量。

參 考 文 獻(xiàn)

[1]李彪，時(shí)向東，趙德強(qiáng)，等.普思復(fù)對多發(fā)腦梗塞性癡呆治療效果的綜合評價(jià)[J]．現(xiàn)代康復(fù)，2000，4(1)：109.

[2]王新德.老年人癡呆[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1990：160～173.

篇10

文/楊曉娜

您可能不知道，黃豆除了食用之外，還有別的保健用途。利用黃豆可制作一些防病治病的工具，如黃豆穴位治療包、熱敷袋、足底按摩袋、頸椎枕等。

黃豆穴位治療包：找一塊棉布，做一個雞蛋大小的口袋，裝滿生黃豆，然后縫好成球狀，做5-6個備用。用的時(shí)候把黃豆包放到微波爐里加熱半分鐘左右，不燙手即可，然后放在穴位上熱敷就可以了。比如吃了寒涼食物或者吹空調(diào)導(dǎo)致胃脘疼痛的時(shí)候，可以將加熱的黃豆包放于中脘穴(腹正中線肚臍上4寸)，10分鐘左右即可緩解。

黃豆熱敷袋：用毛巾做一個長30厘米、寬15厘米的袋子，將600克黃豆裝入袋中，封口即成。使用前，將黃豆袋放入微波爐中加熱1分鐘即可，用布袋敷腿、敷腰、敷肩都可以。溫度降低后可以反復(fù)加熱，多次熱敷患處。例如：腰痛時(shí)仰臥，把黃豆熱敷袋加熱后墊在腰部，袋內(nèi)黃豆順勢移動，自然與腰部各部位接觸，能使肌肉、肌腱和韌帶等組織松弛，解除因肌肉痙攣、強(qiáng)直而引起的疼痛。治療腹痛時(shí)俯臥，將熱黃豆袋平墊在腹部，可緩解胃腸痙攣，增強(qiáng)腸道的節(jié)律性收縮，疼痛癥狀會明顯減輕。

黃豆足底按摩袋：選擇一雙完好的襪子，裝入200克黃豆，扎好襪口，按摩袋就做成了。每次按摩時(shí)，取坐位或站位皆可，將按摩袋放在地上，足底緊貼按摩袋前后滑動(需小心滑倒)，兩替進(jìn)行，可根據(jù)自身情況調(diào)控按摩的力度和節(jié)奏，每次按摩約15分鐘，每天按摩2-3次。此法可刺激足底反射區(qū)，使得血液循環(huán)暢通，排除積聚在體內(nèi)的毒素，促進(jìn)新陳代謝，起到保健強(qiáng)身的效果。

黃豆頸椎枕：將2公斤黃豆充分晾曬，裝入一個長約30厘米、寬約15厘米的布袋里，封口，即做成了一個黃豆枕。睡覺時(shí)把枕中間壓低些，高度低于自己的一個拳頭，躺下后兩肩頂住枕兩邊，睡姿選仰臥，睡眠中不自主地活動頭部，可使一粒粒的黃豆始終在按摩頸部，能舒筋通絡(luò)，緩解痙攣，使頸肩部僵硬的肌肉逐漸趨于柔軟，從而緩解和消除頸椎病癥狀。

膽結(jié)石者常飲四種水

文/李飛龍

玉米須水：玉米須能促進(jìn)膽汁排泄，降低其黏度，減少膽汁中膽色素含量，從而達(dá)到預(yù)防膽結(jié)石的目的。每次取10克干玉米須，加水煎煮10分鐘，得玉米須水300毫升飲服。每日1次。

綠茶水：綠茶富含多酚類、氨基酸、咖啡堿，另外還含有維生素C和一些微量元素等，具有明顯減少膽固醇的作用，從而有效地預(yù)防膽結(jié)石的形成。取綠茶3-6克，泡水飲用。

絞股藍(lán)水：絞股藍(lán)具有改善肝細(xì)胞處理過飽和膽固醇的功能，降低膽固醇含量，增加膽汁酸含量，從而提高了飽和微膠粒對膽固醇的溶解能力，防止形成膽固醇過飽和的病理性膽汁，逆轉(zhuǎn)結(jié)石形成趨勢，達(dá)到預(yù)防膽結(jié)石的目的。每日取絞股藍(lán)6克，泡水飲用。

生姜水：生姜中所含的姜酚成分，能抑制前列腺素的合成，并且有很強(qiáng)的利膽作用。據(jù)研究，人體前列腺素分泌過多可導(dǎo)致膽汁中的黏蛋白增加，并與鈣離子和膽紅素結(jié)合形成膽石。姜酚恰好能抑制前列腺素的合成，相對減少膽汁中黏蛋白的形成，從而起到抑制膽結(jié)石的作用。每日用生姜片6克，泡水飲用，至味淡為止。

茶療百疾――高血壓茶療方劑

文/孟羽賢

天麻茶

綠茶3克，天麻6克，蜂蜜適量。把天麻加水煎沸20分鐘后，加入綠茶，稍沸片刻，即可取用湯汁，調(diào)入蜂蜜溫服，可達(dá)到平肝潛陽、疏風(fēng)止痛的功效。此茶特別適用于頭痛、高血壓、頭暈等癥。

梔子茶

梔子、芽茶各30克。以上兩味加水一同煎服，可起到瀉火清肝，涼血降壓的作用。此茶適用于高血壓、頭暈、頭痛等癥。