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篇1

【關(guān)鍵詞】熱休克蛋白70創(chuàng)傷熱應(yīng)激PC12細(xì)胞

【中圖分類號】Q753 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】1004-7484(2010)03-00-02

Effects of heat shock protein 70 in traumic stress of PC 12 cells

【Abstract】Objective: To investigate the changes of heat shock protein 70 (HSP70) expression levels in neurons in traumic stress. Methods: The expression amounts of HSP70 were determined of PC12 cells using immunocytochemical approach during heat stress. Results: The expression levels of HSP70 increased in heat stress. In the present study, the proliferations of PC 12 cells also increased. Conclusions: High level expressions of HSP70 is one of protective mechanisms in PC 12 cells.

【Key words】Heat shock protein 70;Trauma;Heat stress;PC 12 cells

熱休克蛋白 (heat shock proteins,HSP) 70 是一類廣泛存在于所有原核和真核細(xì)胞內(nèi),具有高度保守性的蛋白家族,在正常情況下基礎(chǔ)水平表達(dá)較低。當(dāng)生物體受到應(yīng)激刺激(如熱、機(jī)械力、缺血、缺氧以及感染等)和其它損傷因素作用而發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)時(shí),就會(huì)啟動(dòng)HSPs臺(tái)成基因,促使HSPs的合成,以對細(xì)胞起一定的保護(hù)作用[1,2]。本實(shí)驗(yàn)探究PC12細(xì)胞在熱應(yīng)激狀態(tài)下表達(dá)HSP70的情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

PC12細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存細(xì)胞株。HSP70單克隆抗體購自Sigma公司;SABC免疫細(xì)胞化學(xué)試劑盒由博士德公司提供,臺(tái)盼蘭染液等其它試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)體系為含l0%胎牛血清和雙抗的MEM培養(yǎng)基,置于37℃,濃度為5%CO2的培養(yǎng)箱中。上述細(xì)胞培養(yǎng)試劑均購自GIBCO公司。

1.3 細(xì)胞存活率測定

實(shí)驗(yàn)分為熱應(yīng)激組和對照組。PC12細(xì)胞依3×104/孔密度接種于96孔板內(nèi),待細(xì)胞融臺(tái)成單層后,予以熱應(yīng)激損傷刺激,即置于42℃水浴中20min,然后用培養(yǎng)液清洗三次,以除去脫落細(xì)胞;接著更換新鮮培養(yǎng)液在37℃恢復(fù)培養(yǎng)3h,用胰酶將細(xì)胞消化,臺(tái)酚蘭染色,計(jì)算細(xì)胞活性。

1.4 免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測HSP70

將PC12細(xì)胞按照1×106/孔密度接種于24孔板內(nèi)的直徑為12mm的蓋玻片上。PC12細(xì)胞融合后,予以熱損傷刺激(同前述方法),應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)方法分析HSP70表達(dá)變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

熱應(yīng)激損傷組和對照組數(shù)據(jù)使用SPSS 10.0軟件進(jìn)行方差分析和t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

PC12細(xì)胞為貼壁細(xì)胞,呈梭形或多突起形扁平狀。一般地,接種24h后即可貼壁;培養(yǎng)48-72h即可達(dá)到增殖旺盛狀態(tài),形成單層融合。

細(xì)胞生存率評價(jià)結(jié)果顯示,熱損傷組和對照組PC12細(xì)胞生存率分別為90.9±2.7%和93.2±2.4%,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率略低于對照組,但是,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩組比較無顯著性差異(P>0.05)。

在實(shí)驗(yàn)組,熱應(yīng)激刺激后即可見PC12細(xì)胞漿內(nèi)!HSP70表達(dá),其表達(dá)一直持續(xù)在較高水平,即使當(dāng)細(xì)胞長成單層時(shí),HSP70的表達(dá)仍為陽性。與之相比較,對照組PC12細(xì)胞接種24h后細(xì)胞貼壁、伸展,HSP70表達(dá)基本為陰性;48h時(shí)細(xì)胞增殖旺盛,可見細(xì)胞分裂現(xiàn)象,胞漿及胞核內(nèi)均可見HSP70著色;72h后長成單層細(xì)胞,HSP70表達(dá)又轉(zhuǎn)為陰性。

3 討論

作為一種非特異性細(xì)胞保護(hù)蛋白質(zhì),Hsp70主要通過提高細(xì)胞對應(yīng)激原的耐受性、分子伴侶作用以及抗細(xì)胞凋亡等途徑達(dá)到對細(xì)胞的保護(hù)[3]。近年來,大量研究證實(shí)HSP70在哺乳類動(dòng)物損傷局部迅速誘導(dǎo)產(chǎn)生,對機(jī)體有明顯的保護(hù)作用[4]。采用免疫組化染色可以直接觀察細(xì)胞和/或組織中HSP70的表達(dá)。

生物體在各種損傷后將啟動(dòng)復(fù)雜的全身反應(yīng),導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)一系列特殊應(yīng)激因子的基因表達(dá),HSP70就是在各種刺激因素作用下細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)合成的蛋白質(zhì)。研究報(bào)道HSP70在組織細(xì)胞損傷的過程中表達(dá)增強(qiáng),并對細(xì)胞具有保護(hù)作用,同時(shí)也能反映細(xì)胞損傷的程度[5,6]。細(xì)胞內(nèi)HSP70的表達(dá)是當(dāng)今的研究熱點(diǎn),研究認(rèn)為細(xì)胞外的HSP70在機(jī)體的生理和免疫機(jī)制上起著主要的作用,其中包括保持自身遺傳的高度保守性、免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)等。但其作用機(jī)制還需進(jìn)一步的研究。有文獻(xiàn)報(bào)道,應(yīng)激時(shí)大部分誘導(dǎo)型Hsp70位于細(xì)胞核內(nèi)并包圍核仁,恢復(fù)后則移人胞漿,另外血液中的單核細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞等能夠釋放HSP70[7]。

本研究以PC12神經(jīng)細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象,研究熱應(yīng)激損傷對HSP70的影響和作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在熱應(yīng)激損傷作用下,神經(jīng)細(xì)胞中HSP70作為細(xì)胞自我保護(hù)機(jī)制,HSP70蛋白持續(xù)較高水平表達(dá),可能與早期免疫炎性反應(yīng)及創(chuàng)傷愈合有關(guān)。數(shù)據(jù)顯示HSP70的表達(dá)變化與細(xì)胞和/或組織的增殖活性密切相關(guān)。即細(xì)胞增殖旺盛時(shí),HSP70表達(dá)水平升高。換言之,在創(chuàng)傷的早期,HSP70的表達(dá)以炎細(xì)胞為主,當(dāng)細(xì)胞/組織轉(zhuǎn)入修復(fù)階段時(shí),HSP70開始在修復(fù)的細(xì)胞/組織中表達(dá),在細(xì)胞/組織增生旺盛時(shí),表達(dá)更為強(qiáng)烈;當(dāng)創(chuàng)傷完全愈合后,HSP70的表達(dá)水平逐漸下降。其作用機(jī)制有待于在將來工作中從分子水平上深入研究,加以闡述。

4 結(jié)論

熱休克蛋白是細(xì)胞受應(yīng)激原刺激后誘導(dǎo)產(chǎn)生的一組應(yīng)激蛋白,一般認(rèn)為HSP70可以提高細(xì)胞的應(yīng)激能力,抵御各種損害因素的影響,起到保護(hù)細(xì)胞的作用。研究表明,HSP70在創(chuàng)傷后即開始在神經(jīng)細(xì)胞中持續(xù)較高水平表達(dá)。

參考文獻(xiàn)

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篇2

[關(guān)鍵詞]熱休克蛋白90(HSP90);糖尿病;難愈創(chuàng)面;創(chuàng)面愈合

[中圖分類號]R622 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A [文章編號]1008-6455(2010)05-0691-04

Heat shock protein 90 promotes wound healing in the diabetic rats

REN Jing,ZENG Hai-feng,XIA Wei,LIU Bei,LI Yong

(Institute of Plastic Surgery of People's Liberation Army,Xijing Hospitol,the Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,Shaanxi,China)

Abstract:ObjectiveHeat shock protein 90 (HSP90) could promote human epidermal cell migration in hypoxia which is the essential processes for skin wound healing. These processes are often disrupted in diabetic chronic wounds, causing patients morbidity and fatality. So we want to find out whether HSP90 could promote the epidermal cell migeration in the diabetic wound. Methods A d=2cm-sized stented wound were created in 80 streptozotocin-induced rats. A total of 100 diabetic wounds were studied in 5 groups (n = 20). The group B is blank Vaseline, the group C is 1μg/ml HSP90 plus Vaseline, the group D is 30μg/ml insulin plus Vaseline, the group E is 1μg/ml HSP90 and 30ug/ml insulin plus Vaseline. And we set group A as control group that is normal rats without treatment. We rubbed these kinds of Vaseline into the diabetic rat's wounds for 2 days. We used a group of normal rats without therapy as controls. The state of the wound healing was observed, and the percent of wound healing determined by measuring its size and by performing a histopathologic study. The statistical analyses were performed by t-test, using SPSS 14.0 software. On the 3th, 5th,7th, 10th, 14th and 21th, we tested the wound tissues by immunohistochemical staining and calculated integrated optical density (IOD) and density mean(DM)by image pro plus 6.0 software. Results On the 21th day, the wound closure rates of the group C(85.9%),D (86.8%)and E(96.8%) is significantly higher than group B(79.7%) (P

Key words: heat shock protein90(HSP90);diabetic wound;wound healing;diabetes

糖尿病造成的難愈創(chuàng)面已成為目前臨床治療的一大難題,研究表明,高糖會(huì)抑制人表皮細(xì)胞的遷移,從而導(dǎo)致創(chuàng)面上皮化延遲[1-2]。近來,Li.W的研究發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白90(heat shock protein 90,HSP90)能夠有效促進(jìn)人表皮細(xì)胞的遷移[3],而關(guān)于其是否能夠有效促進(jìn)糖尿病性難愈創(chuàng)面的研究并未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在將HSP90應(yīng)用于糖尿病性難愈創(chuàng)面,并輔以胰島素作為參照,以觀察不同時(shí)期各組創(chuàng)面的愈合程度及創(chuàng)面中HSP90的表達(dá)含量。

1材料和方法

1.1動(dòng)物及分組:選用健康清潔級雄性SD大鼠100只,由第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心提供,體重(200±3)g,分為A、B、C、D、E五組,每組20只。A組為正常創(chuàng)面但不予以任何治療,即對照組;B組為糖尿病大鼠難愈創(chuàng)面給予空白凡士林藥膏治療組,即空白組;C組為糖尿病大鼠難愈創(chuàng)面給予含有HSP90的凡士林藥膏治療組,即HSP90組(HSP90濃度:1μg/ml);D組為糖尿病大鼠難愈創(chuàng)面給予含有胰島素的凡士林藥膏治療組(胰島素濃度:30μg/ml)E組為糖尿病大鼠難愈創(chuàng)面給予含有HSP90及胰島素的凡士林藥膏治療組,即聯(lián)合用藥組(E組,HSP90濃度:1μg/ml,胰島素濃度:30μg/ml)。每組n=(5n1+n2)=20只,共100只大鼠,

1.1.1 構(gòu)建2型糖尿病難愈創(chuàng)面模型:采用鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)法誘導(dǎo)2型糖尿病造模。各組提前4周高脂高糖飲食,饑餓12h后以40mg/kg腹腔注射STZ并維持高脂高糖飲食,并于注射后48h用強(qiáng)生穩(wěn)步血糖儀檢測空腹血糖(fasting blood glucose,FBG),FBG值>16.7mmol/L,體重明顯下降(>50g)為造模成功[4]。三天后補(bǔ)注STZ(以10～20mg/kg體重劑量腹腔注射),并測量FBG值。切取全層皮膚暴露肉膜為準(zhǔn)后以d=2cm的金屬環(huán)間斷縫合固定于創(chuàng)緣,防止創(chuàng)面攣縮。

1.1.2 給藥及分組:A組不涂抹任何藥物;B組為空白藥膏;C組為含有濃度1μg/ml HSP90的藥膏;D組為含有濃度30μg/ml胰島素的藥膏;E組為含有1μg/ml HSP90及30μg/ml胰島素的藥膏。各給藥組均以外用涂抹局部給藥,藥膏均勻覆蓋整個(gè)創(chuàng)面(約1g/次)為準(zhǔn)(含有藥物的藥膏均委托金花生物制藥集團(tuán)有限公司完成)。HSP90的濃度為我們參考了Li.W試驗(yàn)中用于正常創(chuàng)面的治療濃度后[3],并以15只糖尿病大鼠給予1μg/ml,5μg/ml,10μg/ml進(jìn)行了簡單的預(yù)實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)三種濃度的效果并無顯著差異,所以取最小濃度。

6941,

2實(shí)驗(yàn)過程及觀察設(shè)計(jì)

在創(chuàng)面形成后即時(shí)給予難愈創(chuàng)面藥物治療持續(xù)2天,A組則不治療,動(dòng)物創(chuàng)面予以暴露。創(chuàng)面的固定環(huán)會(huì)于創(chuàng)面形成后的第10天予以摘除,因?yàn)榇藭r(shí)皮膚攣縮力量較大,會(huì)導(dǎo)致縫合線斷裂,為統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)予以摘除。并創(chuàng)面形成后第3天、第5天、第7天、第10天、第14天及第21天進(jìn)行大體觀察及活體取材做常規(guī)病理學(xué)觀察,在第3天、第5天、第7天、第10天及第14天5個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取n1=3個(gè)標(biāo)本,而在第21天取n2=5個(gè)標(biāo)本,各標(biāo)本取材時(shí)取全層厚皮膚,保留創(chuàng)緣約1～2mm的正常皮膚。

2.1 大體觀察指標(biāo):分別于用藥后第3、5、7、10、14、21 進(jìn)行大體拍照觀察并采用ADOBE photoshop cs4 計(jì)算各時(shí)期的創(chuàng)面愈合率;

2.2 鏡下觀察指標(biāo):并于3、5、7、10、14、21天取創(chuàng)面標(biāo)本,3、5、7、10、14天每組各時(shí)間點(diǎn)3只,21天時(shí)每組5只。皮膚標(biāo)本剪成橫斷面,標(biāo)本均用1%中爾馬林固定,石蠟包埋,連續(xù)切片,分別進(jìn)行HE染色、并使用ABC法進(jìn)行HSP90的免疫組化染色。并采用image pro plus 6.0彩色圖像分析系統(tǒng), 每張切片選取5個(gè)有代表性的200倍視野,測量每個(gè)標(biāo)本HSP90陽性表達(dá)密度及積分光密度IOD值的均值并記錄。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì):所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS11。文中數(shù)據(jù)以均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差(x±s) 表示,并且對創(chuàng)面愈合率采用兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 大鼠創(chuàng)面愈合率差異比較:各組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面愈合率比較見表1。由表可見,單獨(dú)使用HSP90(C組)及單獨(dú)使用胰島素(D組)均能夠提高創(chuàng)面的愈合率(與同期B組相比,P

3.2 各組創(chuàng)面第10天時(shí)HSP90的免疫組化對比:見圖1～5。由圖可見,聯(lián)合用藥組及正常創(chuàng)面對照組創(chuàng)面中,HSP90的陽性表達(dá)較為強(qiáng)烈。

3.3 HSP90陽性表達(dá)的比較:為更加客觀的反應(yīng)HSP90在創(chuàng)面中的陽性表達(dá)狀況我們選取平均陽性率及積分光密度作為指標(biāo)[5-6]。各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)HSP90平均陽性率(Density Mean,DM)值的比較見圖6。各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面中HSP90的平均積分光密度(Identical Optical density,IOD)的比較見圖7。

由圖6、圖7我們發(fā)現(xiàn):①在糖尿病大鼠創(chuàng)面中,HSP90的表達(dá)明顯下調(diào)(同期對照組相比,P

4討論

美國創(chuàng)面愈合協(xié)會(huì)的資料顯示大約有66%的難愈性創(chuàng)面即使經(jīng)過6個(gè)月的治療護(hù)理仍無法治愈[7],僅處理創(chuàng)面的材料每年就花費(fèi)90億美元[8]。糖尿病創(chuàng)面的治療一直是難題,表皮細(xì)胞遷移遲緩也是其發(fā)生機(jī)制的一個(gè)重要特點(diǎn)。 在糖尿病創(chuàng)面的臨床治療中,胰島素的局部應(yīng)用的療效及作用機(jī)制均得到了驗(yàn)證,這一方法也成為了臨床治療糖尿病創(chuàng)面的經(jīng)典方法。而其作用機(jī)制主要在于降低創(chuàng)面組織血糖濃度,加快糖尿病創(chuàng)面的新生毛細(xì)血管形成,促進(jìn)上皮細(xì)胞的增殖與遷移[9-10]。

2007年DR. Woodley等發(fā)現(xiàn)人表皮細(xì)胞受到缺氧刺激后,會(huì)大量分泌HSP90α,在胞外的HSP90α能夠有效促進(jìn)人表皮細(xì)胞的遷移,并將其應(yīng)用于正常創(chuàng)面,發(fā)現(xiàn)HSP90α能夠加速創(chuàng)面的再上皮化過程[3,11]。在此之前,人們對于HSP90的關(guān)注了解更多的集中在癌癥領(lǐng)域,作為重要的分子伴侶,它介導(dǎo)了多條調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、遷移的信號通路[12],并保護(hù)細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng),抵抗各類損傷帶給機(jī)體的不可逆性傷害[13]

在本實(shí)驗(yàn)中我們主要為了研究HSP90是否能夠促進(jìn)糖尿病性難愈創(chuàng)面的愈合,并觀察HSP90在糖尿病性難愈創(chuàng)面中的表達(dá),探索HSP90在創(chuàng)面中的表達(dá)是否與創(chuàng)面的愈合速率有關(guān)聯(lián)。我們的研究發(fā)現(xiàn):在大體觀察下,①外源性給予糖尿病性難愈創(chuàng)面HSP90,同期的創(chuàng)面愈合率有所提高(與同期空白組相比,P0.05)。僅從大體實(shí)驗(yàn)的觀察結(jié)果我們認(rèn)為,創(chuàng)面中HSP90的表達(dá)與糖尿病難愈創(chuàng)面的愈合是存在相關(guān)性的。在鏡下觀察,我們發(fā)現(xiàn):①糖尿病性難愈創(chuàng)面的高糖微環(huán)境明顯抑制了HSP90的表達(dá)(空白組與同期對照組相比,P

分析結(jié)果我們認(rèn)為,高糖環(huán)境會(huì)降低HSP90在創(chuàng)面中的表達(dá),減弱HSP90對細(xì)胞的保護(hù)作用。并且創(chuàng)面中HSP90的表達(dá)高低與創(chuàng)面的愈合速率具有相關(guān)性。雖然無論是局部給予胰島素改善高糖微環(huán)境,還是局部應(yīng)用HSP90提高創(chuàng)面中HSP90的表達(dá),均能夠提高糖尿病性難愈創(chuàng)面的愈合率,但是我們發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用后糖尿病性難愈創(chuàng)面的愈合效果最好。據(jù)此我們認(rèn)為,胰島素改善了糖尿病性難愈創(chuàng)面的局部微環(huán)境,有利于創(chuàng)面中HSP90的表達(dá)提高,進(jìn)一步局部給予HSP90,提高創(chuàng)面中HSP90的含量,從而激活部分HSP90參與調(diào)控的信號通路,提高創(chuàng)面中各類生長因子的表達(dá),促進(jìn)了糖尿病性難愈創(chuàng)面的愈合。

然而,我們的研究尚屬淺顯,對于HSP90在糖尿病創(chuàng)面愈合過程中的作用機(jī)制也未進(jìn)行研究。但是,依然為我們尋找糖尿病創(chuàng)面的治療方向提供了一個(gè)具有臨床應(yīng)用意義的思路。下一步,我們會(huì)對HSP90在糖尿病性難愈創(chuàng)面的作用機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的研究,探索HSP90在糖尿病性難愈創(chuàng)面中所調(diào)控的與創(chuàng)面愈合密切相關(guān)的生長因子與細(xì)胞外基質(zhì)的變化。并且HSP90的提取目前還很昂貴,所以進(jìn)一步尋找到其穩(wěn)定的上游信號分子或?qū)ふ乙环N能夠有效且廉價(jià)的提取HSP90的方法會(huì)成為我們今后的研究方向。

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篇3

【關(guān)鍵詞】 熱證／中藥療法

摘要：【目的】探討清熱復(fù)方對大鼠熱休克蛋白70(HSP70)表達(dá)的調(diào)控作用?！痉椒ā繉?0只大鼠隨機(jī)分為熱休克模型組、熱休克加白虎湯組、熱休克加黃連解毒湯組、內(nèi)毒素模型組、內(nèi)毒素加白虎湯組、內(nèi)毒素加黃連解毒湯組和正常對照組7組，每組10只。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RTPCR)對熱休克模型組、內(nèi)毒素模型組和正常對照組大鼠的肝、肺組織進(jìn)行了HSP70 mRNA表達(dá)的檢測，觀察清熱復(fù)方白虎湯和黃連解毒湯分別對兩種模型大鼠肝、肺組織HSP70 mRNA表達(dá)的影響。【結(jié)果】熱休克模型組、熱休克加白虎湯組和熱休克加黃連解毒湯組中HSP70 mRNA的表達(dá)高于正常對照組（P＜005）；熱休克加白虎湯組和熱休克加黃連解毒湯組均高于熱休克模型組（P＜005）；內(nèi)毒素模型組、內(nèi)毒素加白虎湯組和內(nèi)毒素加黃連解毒湯組之間的HSP70 mRNA表達(dá)以及與正常對照組相比均無顯著性差異（P＞005）?！窘Y(jié)論】提示不同因素導(dǎo)致的熱證狀態(tài)下HSP70的基因表達(dá)不一致，清熱復(fù)方可誘導(dǎo)熱休克大鼠肝、肺組織中HSP70表達(dá)的增加，從而提高細(xì)胞的耐受力，避免細(xì)胞組織的損傷。

關(guān)鍵詞：熱證／中藥療法；白虎湯／藥理學(xué)； 黃連解毒湯／藥理學(xué)；

熱休克蛋白70；疾病模型，動(dòng)物

生物體在高溫或其他因素刺激下會(huì)誘導(dǎo)基因開放而合成一組新的蛋白質(zhì)―熱休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)。許多研究證實(shí)整體動(dòng)物的熱處理可預(yù)防隨后的心、腦、肺、視網(wǎng)膜等損傷，并認(rèn)為全身熱處理對這些器官的保護(hù)作用與HSPs的表達(dá)有關(guān)［1］。HSPs作為分子伴侶，在維持細(xì)胞的正常形態(tài)及功能中起著重要作用，參與其他蛋白質(zhì)的折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)、合成等過程，與細(xì)胞內(nèi)的其他肽類蛋白質(zhì)結(jié)合，參與細(xì)胞的抗損傷、修復(fù)和熱耐受過程，其在多種疾病過程中的重要作用已經(jīng)被大量證據(jù)證實(shí)。本研究主要采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RTPCR）觀察白虎湯和黃連解毒湯對熱休克、內(nèi)毒素兩種大鼠熱證模型的HSP70基因表達(dá)的調(diào)控，以探討清熱解毒中藥對HSP70表達(dá)的影響。

1 材料與方法

11 研究對象

清潔級健康雄性SD大鼠70只，體重(200±10)g，由中山醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號：2696001。

12 藥物與試劑

藥物：白虎湯(石膏30g、粳米9g、知母9g、甘草3g)，每劑水煎濃縮至50mL，相當(dāng)于生藥1g/mL；黃連解毒湯(黃連9g、黃芩6g、黃柏6g、梔子9g)，每劑水煎濃縮至30mL，相當(dāng)于生藥1g/mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

主要試劑：總RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)試劑盒(大連寶生物工程有限公司提供)；RTPCR引物(Canada，Stress Gen Corp，STM507);βaction引物(上海生工生物工程公司提供)；DL2000 DNA Marker(大連寶生物工程有限公司提供)。

13 主要儀器

TGL16G型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；DNA／RNA純度檢測儀(Gene Quant American Pharmacia Biotech Corp)；PE9600型PCR擴(kuò)增儀(American Perkin Corp)；EDAS120電泳凝膠圖象分析系統(tǒng)(American Kodak Corp)。

14　動(dòng)物分組及處理

70只雄性SD大鼠隨機(jī)分為熱休克模型組、熱休克加白虎湯組、熱休克加黃連解毒湯組、內(nèi)毒素模型組、內(nèi)毒素加白虎湯組、內(nèi)毒素加黃連解毒湯組、正常對照組7組，每組10只。

141 熱休克組大鼠模型的制備與處理

將大鼠按不同組別分別用生理鹽水、白虎湯、黃連解毒湯灌胃(100g/kg)，1h后進(jìn)行第2次灌胃，再經(jīng)1h將大鼠置恒溫烤箱中進(jìn)行熱休克處理，參考Cruiie方法［2］，溫度控制在約55℃，測量大鼠肛溫達(dá)到42℃，維持10～15min，密切觀察大鼠動(dòng)態(tài)，大鼠出現(xiàn)煩躁、亂竄動(dòng)、毛發(fā)豎立、爪底濕潤后，斷頭處死，取肺、肝組織備用。

142 內(nèi)毒素組大鼠模型的制備與處理

將大鼠按不同組別分別用生理鹽水、白虎湯、黃連解毒湯灌胃(100g/kg)，1h后于尾靜脈注射內(nèi)毒素(15mg/kg)，1h后再重復(fù)灌胃，3h后觀察大鼠出現(xiàn)煩躁、亂竄動(dòng)后，斷頭處死，取肺、肝組織備用。

143 正常對照組

生理鹽水灌胃，不經(jīng)其他任何處理，斷頭處死，取其肝、肺組織備用。

15 實(shí)驗(yàn)方法

采用RTPCR法檢測各組大鼠肝、肺組織中HSP70 mRNA的表達(dá)。

βaction引物序列：Sense Primer 5′ ACCACAGTCCATGCCATCAC 3′；Antisense Primer 5′ TCCACCACCCTGTTGCTGTA 3′。

HSP70引物序列：Sense Primer 5′ CTCCAGCATCCGACAAGAAGC 3′；Antisense Primer 5′ ACGGTGTTGTGGGGGTTCAGG 3′。

βaction擴(kuò)增片段長度為450個(gè)堿基對(base pair，bp)，HSP70擴(kuò)增片段長度為234bp。

RTPCR反應(yīng)體系組成：MgCl2 60μL，10×RNA　PCR　Buffer 80μL，TaKaRa LA Taq05μL，HSP70上下游引物各1μL，βaction上下游引物各1μL，Rnase Free dH2O 615μL，總反應(yīng)體積為80μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：前預(yù)變性94℃ 2min，1個(gè)循環(huán)；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共28個(gè)循環(huán)；后延伸15min。取出反應(yīng)液約10μL，在2%瓊脂糖凝膠上電泳，溴乙錠染色，將電泳結(jié)果置于EDAS120電泳凝膠圖象分析系統(tǒng)內(nèi)掃描并攝片。采用Gelbase電腦軟件對HSP70 DNA與βaction DNA條帶進(jìn)行光密度掃描，計(jì)算HSP70 DNA和βaction DNA吸收峰面積之比，即D值，以此估計(jì)HSP70 mRNA的表達(dá)情況。

16 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS100軟件進(jìn)行多組間兩兩比較。

2 結(jié)果

各組大鼠肝、肺組織中HSP70 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的比較結(jié)果見表1。表1 各組大鼠肝、肺組織中HSP70 mRNA轉(zhuǎn)錄水平（略）

結(jié)果顯示，熱休克各組與內(nèi)毒素各組大鼠的肝、肺組織中HSP70 mRNA表達(dá)不同，熱休克各組HSP70 mRNA表達(dá)均比正常對照組高（均P＜005），而內(nèi)毒素各組的表達(dá)與正常對照組相比均無顯著性差異（P＞005）。說明熱刺激(熱休克)比致熱源更容易刺激細(xì)胞組織合成熱休克蛋白，從而增加對組織細(xì)胞的耐熱性和保護(hù)作用。熱休克加白虎湯組及熱休克加黃連解毒湯組的HSP70 mRNA的表達(dá)高于熱休克模型組（P＜005）；熱休克加黃連解毒湯組大鼠在肝、肺組織中HSP70的表達(dá)與熱休克加白虎湯組相比有顯著性差異（P＜005）。表明白虎湯和黃連解毒湯均能誘導(dǎo)HSP70表達(dá)的增加，從而增強(qiáng)對肝、肺組織的保護(hù)作用。相比之下，白虎湯較黃連解毒湯在肝、肺組織中更能誘導(dǎo)HSP70的表達(dá)。內(nèi)毒素模型各組HSP70的表達(dá)與對照組相比差異無顯著性（P＞005），內(nèi)毒素模型各組之間HSP70的表達(dá)亦無顯著性差異（P＞005）。表明給大鼠靜脈注射內(nèi)毒素不能誘導(dǎo)HSP70表達(dá)的增加，中藥清熱復(fù)方亦不能誘導(dǎo)內(nèi)毒素模型組中HSP70表達(dá)的增多，提示內(nèi)毒素導(dǎo)致的炎性發(fā)熱不能刺激組織細(xì)胞合成對細(xì)胞有保護(hù)作用的HSP70。

3 討論

一切生物在受到高溫、缺氧、感染、創(chuàng)傷及乙醇等因素的刺激時(shí)，會(huì)發(fā)生細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)，其共同特點(diǎn)是產(chǎn)生一組具有生物活性的蛋白――熱休克蛋白。HSPs是一組高度保守的伴隨細(xì)胞蛋白，可使細(xì)胞非特異性抗損傷能力增加，能對抗更為嚴(yán)重的應(yīng)激損傷。HSPs與一些基本的細(xì)胞功能有關(guān)，如蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、折疊和裝配，是存在于細(xì)胞內(nèi)的一種主要“分子伴侶”，在維持組織細(xì)胞的自身穩(wěn)定和環(huán)境適應(yīng)性方面有重要作用，對細(xì)胞抗御外界損傷具有保護(hù)作用，在生理和應(yīng)激條件下均能表達(dá)。據(jù)報(bào)道，熱休克時(shí)細(xì)胞中許多編碼正常功能蛋白質(zhì)的基因關(guān)閉，使大部分蛋白質(zhì)的合成受抑制，而熱休克基因被開啟，HSPs合成增加［3］。自20世紀(jì)70年代以來，按照分子量的大小HSPs有HSP90、HSP70、HSP60及小分子HSP等家族，其中HSP70是目前國內(nèi)外研究較多的，也是最重要的一類熱休克蛋白。

目前認(rèn)為HSP70有多種功能，是一種非特異性保護(hù)蛋白，人體在高溫及各種有害因素刺激下，HSP70合成明顯增加，以提高機(jī)體耐熱和抗病毒能力，其廣泛的生理和病理作用已成為當(dāng)今生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)［4］。王燕如等［5］采用Western印跡法發(fā)現(xiàn)熱休克預(yù)處理使肺泡巨噬細(xì)胞(PAMs)中HSP70 mRNA表達(dá)增多，且獲得抵抗H2O2損傷的能力；用放射菌酮和放射菌素D分別從蛋白合成及基因轉(zhuǎn)錄水平阻斷熱休克基因的表達(dá)，能取消熱休克對H2O2所致PAMs損傷的保護(hù)作用。李國成等［6］發(fā)現(xiàn)其自制健脾益氣方能誘導(dǎo)大鼠提高HSPs的表達(dá)，防止胃粘膜損傷，促進(jìn)潰瘍的愈合，認(rèn)為HSPs可能介導(dǎo)胃粘膜防御。

本研究結(jié)果表明，不同因素導(dǎo)致的熱證狀態(tài)下HSP70的基因表達(dá)是不一致的，熱休克反應(yīng)更類似中醫(yī)所說的“陽明氣分熱盛證”，其表達(dá)的增強(qiáng)是細(xì)胞保護(hù)作用的體現(xiàn)，而白虎湯誘導(dǎo)其表達(dá)的進(jìn)一步增強(qiáng)，一方面從HSP70的角度闡明了白虎湯對“實(shí)熱證”的治療效應(yīng)；另一方面更證實(shí)了中醫(yī)辨證論治的正確性。

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篇4

【關(guān)鍵詞】 α-突觸核蛋白;熱休克蛋白70;過表達(dá)

α-突觸核蛋白是一種在中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸前表達(dá)的可溶性蛋白，具有調(diào)節(jié)膜穩(wěn)定性和神經(jīng)可塑性等生理功能。近年研究發(fā)現(xiàn)，α-突觸核蛋白基因過表達(dá)或突變可引起α-突觸核蛋白的錯(cuò)誤折疊、有毒蛋白寡聚體和多聚體的形成，使其結(jié)構(gòu)和功能障礙，從而啟動(dòng)一系列級聯(lián)反應(yīng)致多巴胺能系統(tǒng)損傷，最終導(dǎo)致帕金森病(PD)。研究認(rèn)為神經(jīng)保護(hù)劑可能是治療PD的一個(gè)新的有效途徑，而熱休克蛋白70(HSP70)就是其中之一。HSP70是分子伴侶家族中的一員，作為一種重要的應(yīng)激蛋白，能與　錯(cuò)誤折疊的蛋白相互作用，阻止聚集物的形成;除此之外，HSP70還有助于錯(cuò)誤折疊蛋白的降解〔1，2〕。在果蠅及酵母的PD模型中發(fā)現(xiàn)，HSP70能減輕α-突觸核蛋白的毒性及其引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡〔3，4〕，而HSP70抑制α-突觸核蛋白毒性可能與其能夠與α-突觸核蛋白相互作用，阻止α-突觸核蛋白纖維樣聚集，降低α-突觸核蛋白表達(dá)量有關(guān)〔5，6〕。為進(jìn)一步證實(shí)HSP70在α-突觸核蛋白所致PD的作用，本實(shí)驗(yàn)首次在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)PD模型中檢測了HSP70的作用及機(jī)制，發(fā)現(xiàn)HSP70可以通過降低α-突觸核蛋白水平發(fā)揮對PD細(xì)胞模型的保護(hù)作用。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料SH-SY5Y細(xì)胞購自ATCC公司;限制性內(nèi)切酶購自Takara公司;QIAprep TIP100 Kit購自QIAGEN公司;人胎腦cDNA文庫、胎牛血清(FBS)、Lipofectamine2000購自Invitrogen公司;蛋白酶抑制劑cocktail購自Sigma公司;anti-α-synuclein 204抗體、anti-beta-actin抗體購自Santa cruz公司;聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購自Millipore公司。

1.2方法

1.2.1質(zhì)粒構(gòu)建以人胎腦cDNA文庫為模板，PCR獲得α-突觸核蛋白可編碼序列(CDS序列)以NotⅠ和HindⅢ連接到pCDNA3.1真核表達(dá)載體中，通過overlap PCR方法，構(gòu)建A53T突變體，同樣以NotⅠ和HindⅢ連接到pCDNA3.1真核表達(dá)載體中。按照QlAprep TIP100 Kit Protocol抽取并純化質(zhì)粒，測序證實(shí)。pCDNA3.1-HSP70質(zhì)粒由湘雅二醫(yī)院肝移植中心李杰群博士惠贈(zèng)。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞采用含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染嚴(yán)格按照Lipofectamine2000說明書進(jìn)行。用不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2次，24孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加入含2 μl Lipofectamine2000及0.8 μg質(zhì)粒DNA、不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基500 μl，在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育3 h，改用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)孵育48 h。

1.2.3免疫熒光將穩(wěn)定表達(dá)蛋白的SH-SY5Y細(xì)胞接種到有蓋玻片的24孔板中，用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中36 h后，棄去培養(yǎng)基，3.7%的多聚甲醛/磷酸緩沖液(PBS)室溫下固定15 min。PBS洗2次，每次5 min。0.2%的TritonX-100/PBS透化10 min，PBS洗2次，5%牛血清白蛋白(BSA)封閉液，室溫封閉30 min。加入1∶400稀釋的anti-α-synuclein204一抗室溫孵育60 min，PBS洗3次，每次5 min。5%BSA封閉液，室溫封閉20 min。加入1∶200稀釋的anti-鼠IgG-Cy2二抗100 μl，避光室溫下孵育60 min。1×PBS洗3次，每次5 min。4，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染細(xì)胞核，室溫，避光反應(yīng)2 min。PBS洗2次，每次5 min。去離子水洗1次，封片，用激光共聚焦顯微鏡掃描和照相。

1.2.4免疫印跡取細(xì)胞，吸去培養(yǎng)基，加入2×十二烷基硫酸鈉(SDS)sample buffer(125 mmol/L Tris HCl，20% Glycerol，4% SDS，0.1% bromphenol blue，pH 6.8)加入蛋白酶抑制劑cocktail裂解細(xì)胞，超聲后，使用蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。均取20 μg總蛋白經(jīng)18% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，并電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。以5%脫脂奶粉封閉1 h后，加入相應(yīng)一抗，4℃過夜，Tris緩沖生理鹽水溶液(TBST)洗膜后，加入對應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育60 min，TBST洗膜后，電化學(xué)發(fā)光免疫分析法(ECL)發(fā)光，曝光。內(nèi)參照為鼠抗-actin單克隆抗體。

1.2.5細(xì)胞活力測定調(diào)節(jié)SH-SY5Y細(xì)胞密度約5×104/ml，以100 μl/孔接種于96孔板，24 h后分別轉(zhuǎn)染pCDNA

3.1+HSP70;α-突觸核蛋白野生型+ pCDNA3.1;α-突觸核蛋白野生型+HSP70;α-突觸核蛋白A53T+pCDNA3.1;α-突觸核蛋白A53T+HSP70;每種處理設(shè)3個(gè)復(fù)孔，24 h后每孔加5mg/ml四甲基偶氮唑鹽(MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄培養(yǎng)基，每孔加二甲基亞砜(DMSO)100μl振蕩混勻，待顆粒溶解后置于酶標(biāo)儀上，空白孔調(diào)零，以570 nm波長檢測各孔吸光度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析利用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間差異比較。

2結(jié)果

2.1PD細(xì)胞模型的構(gòu)建α-突觸核蛋白野生型和突變型A53T在轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞后，胞漿和胞核都有分布，以胞漿分布為主，部分細(xì)胞α-突觸核蛋白呈點(diǎn)狀分布，可能為其聚集體。免疫印跡也顯示，SH-SY5Y細(xì)胞中α-突觸核蛋白野生型和突變型A53T都得到了過表達(dá)，說明PD細(xì)胞模型構(gòu)建成功。見圖1A、B。

2.2HSP70對PD細(xì)胞模型中α-突觸核蛋白的影響了探討HSP70對PD細(xì)胞模型中過表達(dá)的α-突觸核蛋白的作用，將HSP70與α-突觸核蛋白進(jìn)行了共轉(zhuǎn)染，通過免疫印跡檢測HSP70對α-突觸核蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，無論是在α-突觸核蛋白野生型還是突變型PD細(xì)胞模型中，HSP70均能降低α-突觸核蛋白的表達(dá)。見圖2。A：免疫熒光檢測α-syunclein 野生型(左圖)與A53T突變體(右圖)在SH-SY5Y中的表達(dá)。一抗為anti α-syunclein 鼠單克隆抗體，二抗為cy2標(biāo)記的anti mouse IgG抗體。藍(lán)色為DAPI染色的細(xì)胞核。B：western印跡檢測α-syunclein在SH-SY5Y中的表達(dá)。一抗為anti α-syunclein 鼠單克隆抗體，二抗為HRP標(biāo)記的anti mouse IgG抗體。內(nèi)參為細(xì)胞骨架蛋白beta actin。圖1α-syunclein過表達(dá)PD模型的建立Western印跡檢測α-syunclein與HSP70共轉(zhuǎn)染后，HSP70對α-syunclein 野生型和突變性表達(dá)量的影響。一抗為anti α-syunclein 鼠單克隆抗體，antiHSP70單克隆抗體，二抗為HRP標(biāo)記的anti mouse IgG抗體。內(nèi)參為細(xì)胞骨架蛋白β-actin。圖2HSP70降低α-synuclein的表達(dá)量

2.3HSP70對PD細(xì)胞模型活力的影響轉(zhuǎn)染野生型和突變體α-突觸核蛋白后，SH-SY5Y細(xì)胞活性明顯降低，說明α-突觸核蛋白對SH-SY5Y具有毒性作用，PD細(xì)胞模型建立成功。而增加HSP70的表達(dá)后，對比α-突觸核蛋白野生型(α-synuclein WT)+ pCDNA3.1組和α-突觸核蛋白突變型(α-synucleinA53T)+pCDNA3.1組，表達(dá)HSP70能分別提高α-synuclein WT和α-synuclein A53T引起的細(xì)胞活性降低(P

3討論

α-突觸核蛋白是一種分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸前末梢，約15~20 kD的可溶性蛋白質(zhì)。自然狀態(tài)下呈一種非折疊構(gòu)象，不形成明顯的三維結(jié)構(gòu)，但其N末端2/3的序列可以形成一系列雙極性區(qū)域，可能介導(dǎo)其與膜結(jié)構(gòu)的結(jié)合;當(dāng)高濃度或異常修飾時(shí)，構(gòu)象改變形成寡聚體甚至是聚集體，具有細(xì)胞毒性〔7，8〕。與單體不同，這類寡聚體富含8片層結(jié)構(gòu)，在原子力顯微鏡及電鏡下，可以觀察到這類寡聚體形成過程中，一般先呈包含20～30個(gè)α-突觸核蛋白分子的圓狀結(jié)構(gòu);隨后因彼此聚合形成鏈狀結(jié)構(gòu)，最終轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的纖維狀結(jié)構(gòu)。這種由單體向纖維狀結(jié)構(gòu)的改變，可能是α-突觸核蛋白產(chǎn)生毒性作用的重要原因〔5，10〕。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，與家族性PD有關(guān)的α-突觸核蛋白 A53T及A30P突變蛋白在體外均可以促進(jìn)寡聚體的形成，同時(shí)，野生型α-突觸核蛋白的過量表達(dá)也可以導(dǎo)致寡聚體的增加〔11，12〕。當(dāng)機(jī)體無法處理有毒的α-突觸核蛋白中間體時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致α-突觸核蛋白形成聚集體，最終導(dǎo)致PD的發(fā)生〔11，13，14〕。

分子伴侶作為一類介導(dǎo)協(xié)助蛋白形成與維持天然構(gòu)象的重要細(xì)胞因子，在α-突觸核蛋白蛋白結(jié)構(gòu)狀態(tài)轉(zhuǎn)換過程中可能發(fā)揮著很重要的調(diào)控作用。實(shí)驗(yàn)表明，路易小體中除α-突觸核蛋白外，還含有其他蛋白質(zhì)，而HSP是其中重要的蛋白之一〔15〕。當(dāng)α-突觸核蛋白本身結(jié)構(gòu)的改變或分子伴侶、降解系統(tǒng)出現(xiàn)異常時(shí)，α-突觸核蛋白的毒性作用就體現(xiàn)出來了。在模型動(dòng)物的研究中發(fā)現(xiàn)，分子伴侶(HSP70、HSP40)的表達(dá)可減輕α-突觸核蛋白的細(xì)胞毒性。譬如，在PD果蠅模型中，HSP70的表達(dá)可以減輕或阻止α-突觸核蛋白引起的神經(jīng)元損傷;而在酵母中HSP70水平的增加也可以有效地減緩或抑制PD的發(fā)生〔3，4〕。因此，分子伴侶蛋白可能通過協(xié)助α-突觸核蛋白形成并維持正確構(gòu)象而防止其聚集產(chǎn)生有毒害作用的聚集體。本研究中，利用α-突觸核蛋白過表達(dá)細(xì)胞模型發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)HSP70后能使PD細(xì)胞活性增加，說明HSP70對PD細(xì)胞模型具有保護(hù)作用。過表達(dá)HSP70后，α-突觸核蛋白的表達(dá)量也降低，而目前已知α-突觸核蛋白是導(dǎo)致PD發(fā)生的重要因素〔11，13，14〕，因此認(rèn)為HSP70對PD細(xì)胞模型的保護(hù)作用是通過減少α-突觸核蛋白的表達(dá)量的表達(dá)量而實(shí)現(xiàn)的。由于

α-突觸核蛋白的細(xì)胞毒性作用與其由單體向寡聚體轉(zhuǎn)化有關(guān)〔9，10〕，因此推測，HSP70可能通過參與維持α-突觸核蛋白的正確構(gòu)象，減少其向有毒的寡聚體和聚集體狀態(tài)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，減少細(xì)胞的毒性作用。

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篇5

目的 構(gòu)建人熱休克蛋白70(HSP70)的腺病毒表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究HSP70對應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞的保護(hù)作用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法 采用AdEasy系統(tǒng)構(gòu)建攜帶外源性HSP70編碼基因的重組腺病毒載體pAdHSP70，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染人胚腎293細(xì)胞，包裝產(chǎn)生重組腺病毒vAdvHSP。收獲病毒進(jìn)行滴度鑒定， RTPCR方法檢測目的基因在Hela細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。結(jié)果 PCR、序列測定以及限制性酶切證實(shí)HSP70基因正確插入腺病毒表達(dá)載體，并在HEK293細(xì)胞中包裝出重組腺病毒；熒光顯微鏡下可觀察到GFP的表達(dá)，收獲病毒的滴度為3.2×1012 U/L。結(jié)論 成功構(gòu)建pAdHSP70重組腺病毒表達(dá)載體，且重組腺病毒在Hela細(xì)胞能有效轉(zhuǎn)錄。

【關(guān)鍵詞】 HSP70熱休克蛋白質(zhì)類 腺病毒科 遺傳載體

［ABSTRACT］ Objective To construct recombinant adenovirus expression vector containning human HSP70 and provide a base for investigating the protection of HSP70 on the cellunder stringent state. Methods The recombinant adenovirus vector pAdHSP70 carrying HSP70 was constructed with AdEasy system and then transfected 293 cells to produce recombinant adenovirus vAdHSP70. The viral titer was tested. The expression of target gene in Hela was tested by RTPCR. Results It was confirmed by PCR， sequencing identification and restrictive analysis that the target gene was cloned correctly to the shuttle plasmid. The expression of GFP could be observed by fluorescence microscope. The viral titer was 3.2×1012 U/L， and RTPCR indicated that HSP70 could effectively express in Hela. Conclusion Recombinant adenovirus vector was constructed successfully and packed in 293 cells.

［KEY WORDS］ HSP70 heatshock proteins; Adenoviridae; Genetic vectors

熱休克蛋白70（HSP70）是一組高度保守的蛋白，作為一種重要的應(yīng)激蛋白，HSP70可參與應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)蛋白的正確折疊、移位以及降解等，從而維持細(xì)胞的正常形態(tài)及功能，保證細(xì)胞的穩(wěn)定性。研究結(jié)果表明，HSP70在正常情況下表達(dá)水平很低或不表達(dá)，而在應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)熱休克蛋白編碼基因被激活，表現(xiàn)為表達(dá)上調(diào)。本研究旨在將外源性HSP70編碼基因插入含GFP標(biāo)記基因的腺病毒載體中構(gòu)建重組腺病毒載體，經(jīng)293細(xì)胞包裝獲得可高效轉(zhuǎn)錄表達(dá)HSP70的重組腺病毒，為探討外源性HSP70表達(dá)對應(yīng)激狀態(tài)下靶細(xì)胞的保護(hù)作用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和材料

逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Promega公司，限制性核酸內(nèi)切酶PacⅠ和PmeⅠ為英國NEB公司產(chǎn)品；DNA Marker、限制性內(nèi)切酶EcoRⅤ和KpnⅠ、T4 DNA連接酶、pMD18T載體為大連寶生物工程公司產(chǎn)品；TRIzol購自美國Invitrogen公司。攜帶GFP報(bào)告基因的腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrackCMV，E1區(qū)和E3區(qū)缺失的復(fù)制缺陷5型腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy1，大腸桿菌JM109、BJ5183和 DH10B以及人宮頸癌細(xì)胞系Hela和人胚腎293細(xì)胞均由青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA Hela細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)0.10的胎牛血清、105 μg/L 鏈霉素、105 U/L青霉素的DMEM于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)80%匯合后，42 ℃水浴30 min，然后迅速放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)8 h，胰蛋白酶消化離心收集細(xì)胞，采用TRIzol一步法提取細(xì)胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明合成cDNA 。

1.2.2 目的基因的PCR擴(kuò)增及TA克隆 根據(jù)GenBank中編碼HSP70的核苷酸序列及pAdTrack　CMV載體的多克隆位點(diǎn)，采用Primier 5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增HSP70基因的特異性引物。并分別在兩條引物中的5′端引入KpnⅠ和EcoRⅤ酶切位點(diǎn)以及保護(hù)性堿基。上游引物序列為：5′CGGGTACCCAACGACGGAGACAGCC3′，下游引物序列為：5′GCGATATCTCCAGCCACGAGATGACC3′，下劃線部分為引入的酶切位點(diǎn)。引物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成，擴(kuò)增片段長度為1 486 bp。反應(yīng)體系為：10×buffer 2.5 μL， MgCl2 1.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，上下游引物各0.3 mmol/L，Taq 1 U， cDNA 2 μL，無菌去離子水補(bǔ)至25 μL。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；然后94 ℃ 1 min，70 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)； 最后72 ℃延伸10 min。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物于1 g/L的瓊脂糖凝膠（含0.5 mg/L溴化乙錠）中電泳，凝膠自動(dòng)成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

自瓊脂糖凝膠中回收純化目的基因，然后與PMD18T載體在連接酶的作用下進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物以1×TSS 兩步法轉(zhuǎn)化E.coli JM109，涂布于氨卞抗性的LB平板，37 ℃過夜培養(yǎng)。次日挑取平板克隆振蕩培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，KpnⅠ和EcoRⅤ雙酶切鑒定篩選陽性克隆，產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)有限服務(wù)公司測序。

1.2.3 穿梭載體pAdTrackCMVHSP70的構(gòu)建 測序確證序列正確無誤后，分別用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和EcoRⅤ雙酶切目的基因片段和穿梭載體pAdTrackCMV，并在T4 DNA連接酶作用下以摩爾比1∶3進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)化已準(zhǔn)備好的感受態(tài)細(xì)菌JM109，取轉(zhuǎn)化菌涂布于含卡那抗性的LB瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)14～16 h。然后，從轉(zhuǎn)化菌平板上挑取若干個(gè)生長良好的單個(gè)菌落接種至5 mL含卡那霉素的LB 培養(yǎng)液中，37 ℃振蕩培養(yǎng)16～24 h，取1.5 mL培養(yǎng)液用堿裂解法小量提取質(zhì)粒。將所提質(zhì)粒使用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和EcoRⅤ進(jìn)行雙酶切電泳鑒定，陽性克隆命名為pAdTrackCMVHSP70。

1.2.4 重組腺病毒載體AdHSP70的構(gòu)建 將pAdTrackCMVHSP70線性化和去磷酸化，隨后與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy1在大腸桿菌BJ5183中進(jìn)行同源重組。自平板挑取較小克隆轉(zhuǎn)入卡那抗性LB培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)16 h，采用堿裂解法小量提取質(zhì)粒，進(jìn)行PacⅠ酶切鑒定，鑒定為陽性者命名為pAdHSP70。

1.2.5 293細(xì)胞包裝腺病毒和重組腺病毒滴度測定 QIAGEN質(zhì)粒純化試劑盒純化AdHSP70后，用PacⅠ酶切線性化，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染對數(shù)生長期的293細(xì)胞包裝重組腺病毒，同期制備載體對照。用本原正陽公司快速腺病毒感染滴度（TCID50）檢測試劑盒測定所獲腺病毒滴度，操作按說明書進(jìn)行，并計(jì)算病毒滴度。計(jì)算公式：病毒滴度=101+d(s+0.5)×103U/L， d=log10稀釋度，s=陽性比率之和。

1.2.6 病毒感染靶細(xì)胞后RTPCR檢測目的基因 取100 μL重組腺病毒液感染Hela細(xì)胞，3 d后約90%的細(xì)胞觀察到綠色熒光時(shí)收集細(xì)胞， TRIzol一步法提取細(xì)胞總RNA，所獲RNA加DNaseⅠ消化處理可能污染的DNA，應(yīng)用RTPCR檢測目的基因mRNA的表達(dá)。并取5 μL DNaseⅠ消化處理的RNA直接作為模板進(jìn)行PCR作為對照，以確定是否有DNA污染。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2 結(jié)果

2.1 HSP70編碼基因的PCR擴(kuò)增及pAdTrackCMVHSP70的酶切鑒定

采用RTPCR自熱刺激Hela細(xì)胞擴(kuò)增HSP70編碼序列cDNA，可在約1 486 bp處觀察到特異性擴(kuò)增條帶，與理論預(yù)計(jì)值相符且測序后與GenBank報(bào)道的HSP70編碼序列完全一致。見圖1。內(nèi)切酶KpnⅠ和EcoRⅤ雙酶切重組質(zhì)粒pAdTrackCMVHSP70，電泳后可觀察到長約9.2 kb的載體片段和長1 486 bp的目的基因片段，表明目的基因片段成功插入表達(dá)載體。

2.2 重組腺病毒載體pAdHSP70的鑒定

重組腺病毒載體pAdHSP70經(jīng)限制性內(nèi)切酶PacⅠ酶切，瓊脂糖凝膠電泳可觀察到長4.5 kb和30 kb左右的兩條帶，結(jié)果提示穿梭質(zhì)粒pAdTrackCMVHSP70和骨架質(zhì)粒pAdEasy1的重組發(fā)生在ori與右臂之間。見圖2。

2.3 重組腺病毒的包裝

質(zhì)粒pAdHSP70經(jīng)PacⅠ酶切線性化后，用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后在熒光顯微鏡下可觀察到細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光，表明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功，外源基因開始表達(dá)。之后表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞數(shù)目逐漸增多，轉(zhuǎn)染后5 d達(dá)高峰，細(xì)胞開始變圓、脫落，第7～9天約90%的細(xì)胞表達(dá)熒光蛋白時(shí)收獲細(xì)胞，反復(fù)凍融3次后離心除去細(xì)胞碎片，取上清的1/3繼續(xù)感染293細(xì)胞以擴(kuò)增病毒，24 h后細(xì)胞內(nèi)開始出現(xiàn)熒光并逐漸增多，說明包裝出的重組腺病毒具有感染性且在細(xì)胞內(nèi)不斷增殖。重復(fù)上述過程3～4次即可獲得大量具有穩(wěn)定感染性的重組腺病毒，所獲病毒命名為vAdHSP70，經(jīng)檢測病毒滴度為3.2×1012 U/L。

2.4 RTPCR檢測

提取經(jīng)重組腺病毒感染的Hela細(xì)胞總RNA經(jīng)RTPCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳后可明顯觀察到特異性長為1 486 bp大小的片段，而未感染腺病毒和熱應(yīng)激處理后的Hela細(xì)胞此條帶相對較弱。見圖3。

圖1 目的基因的RTPCR擴(kuò)增及重組質(zhì)粒pAdTrackCMVHSP70的雙酶切分析（略）

①M(fèi)arker DL15000;②HSP70 mRNA RTPCR產(chǎn)物;③pAdTrackCMVHSP70 PCR 產(chǎn)物s;④pAdTrackCMVHSP70/KpnⅠ與EcoRⅤ酶切產(chǎn)物;⑤pAdTrackCMVHSP70

圖2 同源重組質(zhì)粒的PacⅠ酶切鑒定（略）

①M(fèi)arker DL2000;②AdHSP70 PCR產(chǎn)物；③pAdTrackCMVHSP70/PacⅠ酶切產(chǎn)物;④AdHSP70/PacⅠ酶切產(chǎn)物；⑤AdHSP70；⑥Marker DL15000

圖3 RTPCR檢測Hela細(xì)胞中HSP70的表達(dá)（略）

①M(fèi)arker DL2000；②vAdHSP70感染Hela細(xì)胞；③未感染腺病毒和熱應(yīng)激處理的Hela細(xì)胞；④Hela細(xì)胞對照

3 討論

生物體在受到周圍環(huán)境刺激或不良因素影響時(shí)，會(huì)產(chǎn)生一系列為適應(yīng)環(huán)境變化而做出的快速細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)。在這期間，細(xì)胞內(nèi)某些正?；虻谋磉_(dá)受到抑制，而另外一些特殊的基因則被激活，表現(xiàn)為表達(dá)上調(diào)，其中熱休克蛋白就是這類特殊的基因。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)30余種熱休克蛋白，根據(jù)同源性和相對分子質(zhì)量大小，可將其分為HSP70、HSP90、HSP60、小分子HSP以及泛素等[1]。其中HSP70是熱休克蛋白家族中含量最多也是最保守的一類。

研究發(fā)現(xiàn)，HSP70具有明顯增強(qiáng)應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞對損害的耐受程度、維持細(xì)胞正常功能代謝和提高細(xì)胞生存率等作用[2]。DONNELLY等[3]研究結(jié)果表明，HSP70在心肌細(xì)胞的過量表達(dá)是提高心肌對缺血再灌注耐受性的重要途徑之一。KINOUCHI等[4]用免疫組化法檢測大鼠大腦中動(dòng)脈阻斷后HSP70蛋白的表達(dá)，研究結(jié)果顯示HSP70 蛋白在梗死灶周圍神經(jīng)元，即缺血半影區(qū)大量表達(dá)。MATSUYAMA等[5]和SAKURAI等[6]將缺血預(yù)處理分別用于狗和兔的脊髓缺血性損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究，他們在脊髓缺血前48 h進(jìn)行缺血預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)脊髓缺血后HSP70的表達(dá)增強(qiáng)而且表達(dá)時(shí)間延長，因而減少隨后的脊髓缺血造成的損傷。在這諸多研究中，大多采用熱誘導(dǎo)、缺血預(yù)處理等方法來誘導(dǎo)內(nèi)源性HSP70的表達(dá)，以證明其保護(hù)作用。這種方法簡單、直接，但是仍存在一些弊端。因?yàn)閷?shí)驗(yàn)過程中，在對機(jī)體給予熱刺激或者缺血預(yù)處理等的同時(shí)，除HSP70基因水平的升高以外，其他基因的表達(dá)也會(huì)不同程度地受到影響。相對而言，利用分子生物學(xué)技術(shù)將攜帶外源性HSP70基因的載體導(dǎo)入特定細(xì)胞，使其在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，能夠更加客觀地研究HSP70在應(yīng)激狀態(tài)下對靶細(xì)胞的保護(hù)作用。因此，如何大量獲取外源性HSP70基因和選擇高效、安全的載體就顯得格外重要。

HSP70普遍存在于所有真核和原核生物體中，但表達(dá)量很低。而在機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)，包括熱應(yīng)激，化學(xué)物質(zhì)（氧自由基、乙醇等）刺激，缺血低氧，感染以及嚴(yán)重創(chuàng)傷等時(shí)表達(dá)量明顯增加[7～9]。而在這些應(yīng)激中，熱應(yīng)激是誘導(dǎo)HSP70大量表達(dá)的最重要因素。研究報(bào)道，雖然腫瘤細(xì)胞內(nèi)HSP70的表達(dá)高于正常細(xì)胞，但含量仍然較低，將其在熱療等應(yīng)激條件下處理后HSP70產(chǎn)生明顯增多[10]。而對于不同溫度誘導(dǎo)引起HSP70表達(dá)量的差異，VAN等[11]報(bào)道，較激烈的熱誘導(dǎo)（43 ℃）作用于腫瘤細(xì)胞僅有少量HSP70蛋白表達(dá)，而較緩和熱誘導(dǎo)（42 ℃），可于誘導(dǎo)后8 h出現(xiàn)且持續(xù)高水平表達(dá)的HSP70蛋白，激烈的熱休克刺激(45 ℃)可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞來不及合成HSP70，以致死亡。在本實(shí)驗(yàn)中我們從溫?zé)嵝菘颂幚砗? h人宮頸癌細(xì)胞系Hela中提取外源性HSP70 mRNA作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示擴(kuò)增后目的基因與理論預(yù)計(jì)值相符，經(jīng)測序與GenBank中的序列一致。同時(shí)，我們選擇了宿主范圍廣、包裝容量大，對人致病性低、滴度高，在增殖和非增殖細(xì)胞中均感染和表達(dá)基因且與人類基因同源的腺病毒作為載體[12]，并通過AdEasy系統(tǒng)與骨架質(zhì)粒pAdEasy1在大腸桿菌內(nèi)同源重組而獲得重組腺病毒載體[13]。

本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了攜帶外源性HSP70基因的重組腺病毒表達(dá)載體，并在293細(xì)胞中包裝獲得重組腺病毒vAdHSP70，應(yīng)用RTPCR鑒定結(jié)果表明，vAdHSP70重組腺病毒可在靶細(xì)胞中高效轉(zhuǎn)錄。從而為進(jìn)一步研究HSP70對應(yīng)激狀態(tài)下的細(xì)胞保護(hù)作用及其在臨床治療和診斷中的應(yīng)用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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篇6

[關(guān)鍵詞]熱休克蛋白質(zhì) 視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞 高眼壓 熱耐受 免疫組化

熱休克蛋白(heal shock protein，HSP)是一組所有的細(xì)胞能在應(yīng)激情況下由熱休克基因所編碼合成的序列高度保守的伴隨細(xì)胞蛋白，并能對抗更為嚴(yán)重的應(yīng)激損傷，這種現(xiàn)象稱為熱休克反應(yīng)(heat shock response，HSR)[1]。目前認(rèn)為熱休克反應(yīng)是細(xì)胞對各種不利因素刺激所表現(xiàn)的一種以基因表達(dá)和調(diào)控方面發(fā)生改變的反應(yīng)。目前的研究發(fā)現(xiàn)高溫、缺氧、再灌注局部損傷或感染等多種有害因素刺激均可產(chǎn)生熱休克蛋白[2]。

HSP通常按分子量大小進(jìn)行分類，主要有HSP70、HSP90、HSP60以及小分子HSP[3]。在HSP家族中，HSP70與神經(jīng)保護(hù)有著最為密切的聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)高熱誘導(dǎo)HSP合成后具有保護(hù)光感受器免受光損害的作用[4]。而熱耐受是否可以提高在體眼急性高眼壓視網(wǎng)膜HSP70的表達(dá)而減少組織細(xì)胞的損傷，目前尚未見報(bào)道。為此，本研究在眼急性高眼壓動(dòng)物模型建立的基礎(chǔ)上，研究眼急性高眼壓后視網(wǎng)膜HSP70的動(dòng)態(tài)表達(dá)情況以及熱耐受后對在體眼急性高眼壓視網(wǎng)膜HSP70表達(dá)的調(diào)節(jié)，為急性青光眼的藥物防治提供相關(guān)理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60只清潔級Sprague―Dawley(SD)大鼠，鼠齡2～3周，雌雄不限，體重50～100g。實(shí)驗(yàn)前散瞳并行裂隙燈顯微鏡檢查排除角膜病、葡萄膜疾病、晶狀體及玻璃體等疾病。

1.2 主要試劑與儀器

兔抗鼠HSP70單克隆抗體(濃縮型)，S-P超敏免疫組化試劑盒，DAB顯色試劑盒，均購自福州邁新公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

(1)分組：56只SD大鼠隨機(jī)隨機(jī)分為2組，分別為高眼壓組、水浴+高眼壓組。每組28只，右眼為實(shí)驗(yàn)眼。①高眼壓組組：28只，隨機(jī)分成7個(gè)亞組，每組4只。分別為：A：不予高眼壓立即取材組；B：高眼壓后立即取材組；C：高眼壓后2 h取材組；D：高眼壓后4 h取材組；E：高眼壓后12 h取材組；F：高眼壓后24 h取材組；G：高眼壓后36h取材組。②水浴+高眼壓組：28只，隨機(jī)分成7個(gè)亞組，每組4只。分別為：A：水浴后立即取材組；B：水浴+高眼壓后立即取材組；C：水浴+高眼壓后2 h取材組；D：水浴+高眼壓后4 h取材組；E：水浴+高眼壓后12 h取材組；F：水浴+高眼壓后24 h取材組；G：水浴+高眼壓后36 h取材組。 (2) 急性高眼壓模型制作方法及水浴方法：急性高眼壓模型按賈莉君等[5]介紹的方法，具體步驟如下：大鼠予10％水合氯醛3mg／kg體重腹腔內(nèi)注射麻醉后固定在鼠用立體定位儀上，用4號半一次性輸液針頭作右眼前房穿刺，經(jīng)一次性消毒輸液器連接乳酸鈉林格氏液輸液瓶，將液面高度調(diào)整至距實(shí)驗(yàn)眼水平面1387mm，使之產(chǎn)牛102 mmHg靜水壓，在大鼠右眼前房內(nèi)持續(xù)加壓灌注，2 h后撥出針頭，大鼠自行蘇醒。水浴時(shí)將SD大鼠麻醉后置于45℃ 恒溫水中，肛溫表測量其直腸溫度達(dá)40.5～41.5℃ ，維持10 min，常溫下置放3 h后制高眼壓模型。

1.3.2 取材和切片

戊巴比妥鈉按35mg/kg 行大鼠腹腔注射，待大鼠深度麻醉后，將大鼠固定于手術(shù)臺(tái)上。剪開大鼠胸部皮膚及胸廓組織后，暴露出心臟，剪開左心室尖，插入供灌注用的9號灌注針頭至升主動(dòng)脈，止血鉗夾閉主動(dòng)脈并固定灌注針頭，先用生理鹽水l00mL以40mL/min 速度推注，后快速推注40g/L的多聚甲醛200mL左右(防止視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞變性)，直到大鼠全身僵硬。完整取出大鼠的左右眼球，分別放入40g/L 的多聚甲醛中，30min后用前房穿刺刀穿刺前房，2h后將角膜、晶狀體剔去(大鼠的玻璃體極少)制成眼杯，再將眼杯繼續(xù)固定4～6h，取出眼杯后依次梯度灑精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，同一標(biāo)本連續(xù)切出3～4張厚度為5um的切片，免疫組化使用。

1.3.3 免疫組化染色

石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化；加3％ H2O2室溫下孵育10min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性；加1：100稀釋的HSP70單克隆一抗，陰性對照用PBS代替一抗，37℃溫育30min；加聚合物增強(qiáng)劑室溫下孵育20 min；加酶標(biāo)抗鼠／兔聚合物，室溫下孵育30min；加新鮮配制的DAB顯色液顯色3～10min，顯微鏡下控制顯色時(shí)間，自來水充分沖洗，蘇木素復(fù)染40s，lg/L 鹽酸酒精分化2s，自來水沖洗返藍(lán)l5min；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.3.4 免疫組化結(jié)果判定

光鏡下觀察胞漿或胞核內(nèi)呈現(xiàn)不同程度的棕黃色粗大顆粒反應(yīng)者為抗HSP70抗體染色陽性細(xì)胞，反之染色陰性。每份標(biāo)本取一張未復(fù)染切片，每張切片隨機(jī)取3個(gè)視野，應(yīng)用LeicaQ5OOMC圖像分析儀對陽性反應(yīng)部位進(jìn)行平均灰度和面密度分析?；叶戎挡捎肕edian(QR)表示，記錄相應(yīng)數(shù)據(jù)，取平均值作為該標(biāo)本的結(jié)果，結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

實(shí)驗(yàn)中HSP70表達(dá)強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析 。對兩實(shí)驗(yàn)組(高眼壓組和水浴＋高眼壓組)間、兩組的A-F亞組結(jié)果之間的比較采用兩因素析因方差分析(即組別、時(shí)段兩因素)，A組和其他各亞組間的比較采用Dunnett-f檢驗(yàn)，兩實(shí)驗(yàn)組同一亞組間的比較采用t 檢驗(yàn)，以P

2 結(jié)果

免疫組化結(jié)果：圖1為正常視網(wǎng)膜組織切片光鏡下的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，免疫組化顯示棕黃色顆粒位于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGCs)胞漿內(nèi)(圖2、圖3、圖4)，其余各層均未見明顯表達(dá)，各組及亞組圖像分析平均灰度值Median(QR)見圖5。

通過析因分析，顯示高眼壓組與水浴+高眼壓組兩組組間、不同亞組間HSP70表達(dá)強(qiáng)度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(組間及亞組間P值均小于0.01)。高眼壓組和水浴+高眼壓組HSP70 蛋白的表達(dá)強(qiáng)度均于高眼壓后4 h開始增強(qiáng)(與各自A組相比行Dunnett-t檢驗(yàn)，P=0.00)， 24后h達(dá)到高峰， 36小時(shí)后回落，但仍高于正常組(與各自A組相比行Dunnett-t檢驗(yàn)，P=0.00) 。

水浴后大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞HSP70的表達(dá)基礎(chǔ)水平提高，水?。哐蹓航MA～F各亞組的HSP70表達(dá)強(qiáng)度均較相應(yīng)高眼壓組高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為-4.25，-5.78，-l1.05，-8.31，-7.29，-6.77，-4.31；其P值均小于0.05)。36 h后水?。哐蹓航M的HSP70表達(dá)強(qiáng)度雖然回落，但與高眼壓組相比，差異仍然有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-6.77，P

3 討論

近年來，抗青光眼手術(shù)設(shè)計(jì)日臻完善，加之各種高效降眼壓藥物的開發(fā)和應(yīng)用，將青光眼患者的眼內(nèi)壓控制在靶眼壓以內(nèi)不再象以前那樣困難，但即使是最大限度地降低了眼內(nèi)壓，仍不能阻止部分患者視功能惡化。另外，正常眼壓性青光眼患者的眼內(nèi)壓正常，發(fā)病機(jī)制不清，降眼壓治療缺乏針對性，視神經(jīng)保護(hù)的研究成為研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

熱休克蛋白與青光眼視神經(jīng)保護(hù)的研究日益受到重視，而在HSP家族中，作為與神經(jīng)保護(hù)聯(lián)系最密切的HSP70，其保護(hù)視神經(jīng)的機(jī)制包括：（1）通過分子伴侶作用在蛋白質(zhì)代謝過程中發(fā)揮著極其重要的作用。分子伴侶作用的主要功能包括：幫助新合成蛋白質(zhì)的折疊，防止其互相聚集；幫助蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)移位；幫助變性蛋白質(zhì)復(fù)性以及清除嚴(yán)重受損的蛋白質(zhì)[6]。（2）幫助細(xì)胞對抗凋亡刺激因素侵襲，這些因素有熱休克、腫瘤壞死因子、生長因子、氧化應(yīng)激、化療藥物、宇宙輻射等。所有HSP中，HSP70是凋亡的主要抑制者[7,8]。（3）保護(hù)線粒體使之免受活性氧族的毒害作用的作用[9]。

本實(shí)驗(yàn)?zāi)M青光眼高眼壓環(huán)境，探討急性高眼壓條件下RGCs與HSP70表達(dá)的關(guān)系。結(jié)果表明在前房內(nèi)加壓灌注時(shí)，眼內(nèi)壓急劇升高；當(dāng)眼內(nèi)壓超過大鼠尾動(dòng)脈壓的75％(102 mmHg)時(shí)，視網(wǎng)膜動(dòng)靜脈血流由于機(jī)械受壓停止，RGCs處于缺血和機(jī)械受壓應(yīng)激狀態(tài)下，在缺血再灌注4小時(shí)后細(xì)胞內(nèi)HSP70的表達(dá)增加,并逐漸加強(qiáng) ,到24小時(shí)達(dá)到高峰，36小時(shí)后開始減少。HSP70的表達(dá)呈峰時(shí)出現(xiàn)亦說明HSP70作為一種應(yīng)激蛋白，其蛋白保護(hù)作用具有時(shí)間依賴性。

本實(shí)驗(yàn)還探討了熱耐受對RGCs的HSP70表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。 熱耐受(thermotolerance)作為HSP的一個(gè)重要生物學(xué)功能，是指細(xì)胞經(jīng)過預(yù)先的熱休克處理后誘導(dǎo)HSP的合成，使細(xì)胞能夠耐受一個(gè)更為強(qiáng)烈的熱處理。Caprioli[10]等研究提示通過熱耐受可以提高視網(wǎng)膜細(xì)胞的耐熱能力，從而減少組織細(xì)胞的損傷。本實(shí)驗(yàn)采用45℃ 溫水浴的方法，通過溫水浴加熱大鼠，使熱量均勻傳導(dǎo)至全身。由于熱耐受與HSP表達(dá)有關(guān)，因此若要產(chǎn)生熱耐受，則第2次的應(yīng)激一般要在第1次熱休克恢復(fù)期，有研究顯示[11]大鼠熱休克后恢復(fù)37℃ 2―3 h再給予第2次的應(yīng)激是必要的。因此本實(shí)驗(yàn)在給予第二次應(yīng)激時(shí)，予常溫恢復(fù)是必須的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HSP70表達(dá)的峰值時(shí)間高眼壓組與水浴組一致，但水浴組的轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度均高于高眼壓組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本研究結(jié)果證實(shí)，熱應(yīng)激能誘導(dǎo)RGCs內(nèi)源性HSP70的表達(dá)，從而提高RGCs對急性高眼壓的耐受性，起到保護(hù)視神經(jīng)的作用。

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篇7

[關(guān)鍵詞] 消化性潰瘍；中醫(yī)證型；中藥方劑；熱休克蛋白70；瘦素

[中圖分類號] R259 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）02（a）-0084-03

The influence comparison on expression of heat shock protein 70 and Leptin by two types Chinese herbal medicine prescription in the treatment of peptic ulcer

LI Changjun ZHANG Ping

Department of Gastroenterology， Hubei Provincial Corps Hospital of Chinese People′s Armed Police Forces， Hubei Province， Wuhan 430061， China

[Abstract] Objective To observe the expression influence of heat shock protein 70 （HSP70） and Leptin on patients with peptic ulcer （PU） treated by traditional spleen-nourishing middle-warming and soothing liver regulating qi prescription. Methods 41 patients with Helicobacter pylori （HP） positive in active stage in Hubei Provincial Corps Hospital of Chinese People′s Armed Police Forces from October 2011 to April 2013， were divided into two groups， of which there were 19 cases with deficiency cold of spleen and stomach （control group）， 22 cases with qi-stagnation of liver and stomach （treatment group）. The two groups were treated respectively by spleen-nourishing middle-warming and soothing liver regulating qi decoction while using western medicine， reexamination of gastroscope and HP were taken after 6 weeks. The HSP70 and Leptin content in serum were tested by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. Results The HP eradication rat and gastroscopic curative effect were not significantly different between control group and treatment group （P > 0.05）. The HSP70 and Leptin content were no significant differences between control group and treatment group before treatment （P > 0.05） after treatment， the content of HSP70 in control group was significantly higher than that in the treatment group （t=3.531， P < 0.01）， the content of Leptin improved was much higher in treatment group than that in control group （t=2.487， P < 0.05）. Conclusion There are intensive difference on expression of HSP70 and Leptin in serum of patients with peptic ulcer treated by traditional spleen-nourishing middle-warming and soothing liver regulating qi prescription， the medicine physicians should attach much weight to the consistence of TCM syndrome type and Chinese herbal medicine prescription.

[Key words] Ulcer peptic； TCM syndrome type； Chinese herbal medicine prescription； Heat shock protein 70； Leptin

由于獨(dú)特的預(yù)防和治療作用，尤其在某些疾病上發(fā)揮著化學(xué)藥品不可替代的重要作用，各大醫(yī)院采購品種繁多的中成藥[1]，我國約70%的中成藥由綜合醫(yī)院西醫(yī)醫(yī)師開出，但不合理使用率高達(dá)四成。許多中成藥也被聯(lián)合運(yùn)用于消化性潰瘍（peptic ulcer，PU）治療，PU病理過程中相關(guān)因子的變化及中藥或中成藥對相關(guān)因子的影響及該影響對優(yōu)勢療效的作用有許多與單用西藥的對照性報(bào)道[2]。由于不少中成藥已從傳統(tǒng)的以主治證命名方式改變?yōu)橛械囊怨πШ妥饔妹?，有的以治療某病命名，甚至冠以通俗效能名，雖然方便了臨床醫(yī)師運(yùn)用，但也易產(chǎn)生對病不對證等問題。中藥治病，處方基于中醫(yī)辨證，鑒于以辯證分型為基礎(chǔ)的分類中藥方劑機(jī)制對照研究不多，以及西醫(yī)醫(yī)師缺乏中醫(yī)辨證的相關(guān)知識與經(jīng)驗(yàn)，本文對中西醫(yī)結(jié)合治療PU過程中不同類別中藥對患者熱休克蛋白70（heat shock protein，HSP70）及瘦素（Leptin）表達(dá)的影響進(jìn)行比較分析，望提高西醫(yī)醫(yī)師對中成藥對證作用的重視，并對西醫(yī)醫(yī)師盡量準(zhǔn)確對證使用中成藥提出建議。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2011年10月～2013年4月武裝警察部隊(duì)湖北省總隊(duì)醫(yī)院門診患者41例，均經(jīng)胃鏡檢查證實(shí)為活動(dòng)期潰瘍，并經(jīng)活檢排除胃癌；幽門螺桿菌（helicobacter pylori，HP）快速尿素酶檢測及14C尿素呼氣試驗(yàn)均為陽性；男32例，女9例，年齡22～52歲；胃潰瘍9例，十二指腸潰瘍32例?；颊?周內(nèi)未服用抗生素、鉍劑、抑酸劑及對HP有抑制作用的藥物，有嚴(yán)重心、肺、肝、腎及內(nèi)分泌疾病；多發(fā)性及復(fù)合性或有嚴(yán)重并發(fā)癥；疑有惡變或有外科手術(shù)指征；特殊類型胃潰瘍或十二指腸潰瘍（如胃泌素瘤患者）；不愿、不便參與及有心理精神疾患者，均不列入觀察。脾胃虛寒型（對照組）19例，男15例，女4例，年齡23～50歲，胃潰瘍4例，十二指腸潰瘍15例；肝胃氣滯型（治療組）22例，男17例，女5例，年齡22～52歲，胃潰瘍5例，十二指腸潰瘍17例。各組年齡、性別、職業(yè)、飲酒、吸煙、飲食習(xí)慣等差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。

1.2 主要試劑與儀器

人熱休克蛋白70 ELISA試劑盒（美國RD公司）；人瘦素ELISA試劑盒（安徽安科生物工程股份有限公司）；Elx800自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國Bio.TekInstruments公司）。

1.3 方法

1.3.1 中醫(yī)分型及療效判定標(biāo)準(zhǔn) 參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》（試行）[3]，中醫(yī)辨證分型標(biāo)準(zhǔn)：必備胃痛隱隱，喜暖喜按主癥，兼具其余主癥中1項(xiàng)加次癥2項(xiàng)為脾胃虛寒型；必備胃脘脹痛，兩脅脹悶，兼具其余主癥中1項(xiàng)加次癥2項(xiàng)為肝胃氣滯型。胃鏡療效判定標(biāo)準(zhǔn)：臨床痊愈為潰瘍及周圍炎癥全部消失；顯效為潰瘍消失，仍有炎癥；有效為潰瘍縮小50%及以上；無效為潰瘍縮小不及50%。

1.3.2 治療方法 兩組患者均給予泮托拉唑（海南海力制藥有限公司，批號：11120290）40 mg/d，餐前0.5 h服用，2次/d；阿莫西林膠囊（珠海聯(lián)幫制藥股份有限公司中山分公司，批號；18578）1000 mg/d、克拉霉素分散片（黑龍江肇東華富藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號：100901）500 mg/d，2次/d，餐后即服；10 d后，泮托拉唑20 mg，1次/d；1個(gè)月后，雷尼替丁（杭州民生藥業(yè)有限公司，批號：4110101）300 mg/d，2次/d。對照組加服自擬健脾溫中湯（由黨參20 g，炒白術(shù)15 g，炙甘草10 g，干姜6 g，肉桂3 g等組成，由本院制劑室制作成煎劑，每袋100 mL，下同），200 mL/d，2次/d，飯前1 h服用；治療組加服自擬自疏肝理氣湯（由柴胡15 g，陳皮15 g，香附10 g，枳殼12 g，炙甘草6 g等組成），飯后1 h服用，均每7天為停服1 d。6周后進(jìn)行胃鏡等復(fù)查。

1.3.3 標(biāo)本采集和處理 治療前后，每例患者取胃竇及胃體黏膜組織各2塊做尿素酶試驗(yàn)；清晨空腹，用帶分離膠的血清采集管采前臂靜脈血6 mL，室溫靜置1 h，離心取上清2 mL分裝2個(gè)EP管，分置-27℃、-85℃冰箱保存。

1.3.4 血清標(biāo)本檢測方法 按ELISA試劑使用說明進(jìn)行操作，在酶標(biāo)儀450 nm波長下測定光密度值（OD值），以曲線回歸方程計(jì)算樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HP根除率

對照組17/19（89.47%），治療組20/22（90.91%），兩組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.024，P=0.877 > 0.05）。

2.2 胃鏡療效

對照組19例，痊愈15例（78.95%），顯效2例（10.53%），有效1例（5.26%），無效1例（5.26%），總有效率94.73%。治療組22例，痊愈18例（81.82% ），顯效2例（9.09% ），有效1例（4.55% ），無效1例（4.55%），總有效率95.45%。兩組臨床痊愈率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.054，P=0.817 > 0.05）。

2.3 血清HSP70及Leptin含量

治療前兩組血清HSP70及Leptin含量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.052，t=0.197，P > 0.05）。治療后，對照組HSP70含量顯著增加（t=25.241，P < 0.01），治療組亦明顯增加（t=2.136，P =0.045 < 0.05），對照組增加顯著高于治療組（t=3.531，P =0.001 < 0.01）；治療組Leptin含量顯著提高（t=97.018，P < 0.01），對照組明顯提高（t=0.264，P =0.472 < 0.05），治療組提高明顯高于對照組（t=2.487，P =0.017 < 0.05）。表明健脾溫中與疏肝理氣類中藥對PU患者HSP70及Leptin的表達(dá)促進(jìn)作用存在強(qiáng)度區(qū)別。見表1。

表1 兩組患者治療前后血清HSP70及Leptin含量比較（ng/mL，x±s）

注：與對照組治療后比較，*P < 0.05，**P < 0.01；HSP70：熱休克蛋白70；Leptin：瘦素

3 討論

中醫(yī)中藥在治療消化性潰瘍方面積累了豐富經(jīng)驗(yàn)，有許多臨床觀察和研究[4]，中西醫(yī)結(jié)合治療PU能提高療效，能更快地改善臨床癥狀[5]，但對按中醫(yī)辯證分型確定的不同類中藥配方進(jìn)行較為深入機(jī)制對照研究不多?；谌魏斡行У闹兴幏絼┒伎赡鼙恢谱鳛橹谐伤幍目紤]，筆者根據(jù)辨證分型以對證的自擬方劑合用西藥進(jìn)行PU治療對照觀察，結(jié)果胃鏡下臨床痊愈率，對照組78.95%，治療組81.82%，與相關(guān)中藥方劑合用西藥療效接近[6]，再次說明中西醫(yī)結(jié)合治療能提高PU的療效。

各種生物受到外界不利或有害因素刺激時(shí)都會(huì)發(fā)生熱休克反應(yīng)并產(chǎn)生熱休克蛋白（HSPs），它們具有參與蛋白折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)、機(jī)體免疫和細(xì)胞凋亡等多種生理功能[7]。HSP70是熱休克蛋白家族主要成員之一，其通過提高細(xì)胞對應(yīng)激的耐受性、抑制炎性反應(yīng)、抗氧化、抗凋亡等多種途徑發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。Leptin在機(jī)體內(nèi)作用廣泛，在免疫功能，細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)移和調(diào)亡等方面具有重要的調(diào)節(jié)作用，其對免疫功能和炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用是目前的研究熱點(diǎn)[8]。有研究顯示，黃芪建中湯合失笑散能顯著增加消化性潰瘍患者血清HSP70及瘦素的表達(dá)水平，并通過它們各自的保護(hù)機(jī)制促進(jìn)潰瘍愈合[9]，筆者觀察PU患者治療后HSP70及Leptin含量兩組有顯著和明顯增加，推測較好的中西醫(yī)結(jié)合療效可能與上述兩種因子通過相關(guān)環(huán)節(jié)與因素的保護(hù)作用有關(guān)。PU患者HSP70表達(dá)較正常人增強(qiáng)[10]，消化性潰瘍的發(fā)生可使黏膜組織中Leptin的表達(dá)增加[11]，PU病理過程中的相關(guān)因子因素對HSP70及Leptin的表達(dá)應(yīng)該有激發(fā)作用。但也有研究表明，PU患者治療前Leptin水平與正常人接近，治療后水平輕度下降[12]，與相關(guān)研究結(jié)果不一致的原因有待進(jìn)一步研究，與本研究結(jié)果不一致的原因，筆者推測可能與病例選擇標(biāo)準(zhǔn)及檢驗(yàn)時(shí)間不同有關(guān)，更有可能是中藥的促進(jìn)表達(dá)影響作用。HSP70及Leptin調(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜，潰瘍病理過程中的組織壞死性毒素、缺氧、胃酸和疼痛等諸多刺激因素可激活HSP70表達(dá)，而Leptin的表達(dá)促進(jìn)則受體脂含量、某些激素、炎癥等多因素影響。他們的調(diào)控與作用涉及相關(guān)基因水平的激活與抑制，包含激素、酶類、神經(jīng)機(jī)制等諸多因子因素間環(huán)節(jié)相互作用與反饋?zhàn)饔?。筆者觀察發(fā)現(xiàn)健脾益氣類中藥提升HSP70作用強(qiáng)勢于疏肝理氣類中藥，而疏肝理氣類中藥提升Leptin作用強(qiáng)勢于健脾益氣類中藥，提示兩類中藥對PU患者HSP70及Leptin的表達(dá)的促進(jìn)強(qiáng)度存在區(qū)別。該結(jié)果雖不能代表兩類中藥作用的全面機(jī)制，也可能對證使用的表達(dá)促進(jìn)強(qiáng)度差異對機(jī)體發(fā)揮保護(hù)作用是適宜的，但從HSP70及Leptin調(diào)控機(jī)制及環(huán)節(jié)作用分析，兩種因子的表達(dá)差異應(yīng)該對機(jī)體整體病理生理產(chǎn)生不同影響。盡管HSP70及Leptin對機(jī)體不良影響研究不多，但上述差異對療效和機(jī)體在不對證使用中藥時(shí)可能產(chǎn)生的不利影響應(yīng)引起重視，也提示西醫(yī)醫(yī)師使用中成藥時(shí)要認(rèn)真考慮對證作用。至于差異的原因仍有待進(jìn)一步研究，也應(yīng)加強(qiáng)治療前與正常人和組內(nèi)與單用西藥治療的對照觀察。

中醫(yī)的證，是對致病因素與機(jī)體反應(yīng)性兩方面情況的綜合，辨證是根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)，辨別出病變當(dāng)前的位置和性質(zhì)，既含病因又含機(jī)制。客觀而言，高年資中醫(yī)醫(yī)師能做到辯證精準(zhǔn)也屬不易，加之中醫(yī)癥狀體征、病因病機(jī)描述術(shù)語及身體部位的概念與西醫(yī)又存在很大區(qū)別，要求西醫(yī)醫(yī)師正確辯證極不現(xiàn)實(shí)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)PU患者中醫(yī)各證型與感染HP關(guān)系比較有顯著差異性[13]，更有學(xué)者對慢性腎功能衰竭不同中醫(yī)證型與HSP70、尿水通道蛋白2含量等指標(biāo)的關(guān)系作了研究[14]，即便如此，也很難做到西醫(yī)檢查的客觀依據(jù)與中醫(yī)辨證所需要素的有機(jī)對應(yīng)。目前，除傳統(tǒng)的膏、丹、丸、散外，針劑、口服液等穩(wěn)定安全的新劑型逐漸進(jìn)入市場。但許多中成藥說明書，功能與主治說明既含中醫(yī)的證，也含西醫(yī)的病，或說明治療西醫(yī)某病中的某證，或按西醫(yī)藥理直接寫明某作用，如此勢必導(dǎo)致不熟悉中醫(yī)辯證的西醫(yī)醫(yī)師按病開藥，或按藥理和效能處方，不考慮對證或?qū)ψC不準(zhǔn)的問題在所難免。中醫(yī)界應(yīng)加快與證相關(guān)檢查、檢驗(yàn)客觀依據(jù)的定性、量化系統(tǒng)研究；中西醫(yī)結(jié)合工作者在中醫(yī)癥狀體征、部位術(shù)語等方面描述與西醫(yī)的差異要多作對照融通探索和宣教工作；單方復(fù)方機(jī)制研究，應(yīng)將對證藥物可能引起對應(yīng)癥狀體征改變的原因在機(jī)制上以現(xiàn)代醫(yī)學(xué)已有的病理生理及藥理認(rèn)識和發(fā)展趨勢進(jìn)行預(yù)測，開展如西醫(yī)的激動(dòng)與阻滯、抑制與興奮似的中藥宏觀歸類與微觀作用的系列研究。要盡力減少只作與西醫(yī)相關(guān)因子符合性、驗(yàn)證性的研究，避免支離性和分散性，中醫(yī)辨證分型結(jié)果關(guān)聯(lián)中藥性味，要把性味概念提升為西醫(yī)醫(yī)師易于理解的中藥藥理依據(jù)，中成藥說明書也應(yīng)根據(jù)上述工作的開展作必要的內(nèi)容調(diào)整。如此，也許能為西醫(yī)醫(yī)師盡量對證準(zhǔn)確運(yùn)用中成藥提供便利。

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篇8

“腫瘤”是非常令人恐懼的疾病，很多人都認(rèn)為，“患了腫瘤，就判了死刑”，這種想法不完全正確，事實(shí)上有一部分腫瘤可以治愈，還有一部分患者可以帶瘤長期生存。

腫瘤治療理念的變化

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，對腫瘤研究的深入，治療方法也在不斷完善。如上個(gè)世紀(jì)腫瘤外科醫(yī)生側(cè)重于腫瘤的手術(shù)切除，因此，很多外科醫(yī)生認(rèn)為，“我的手術(shù)做得好，手術(shù)以后就不用化療了”。實(shí)際上，經(jīng)過多年的臨床實(shí)踐，大家逐漸將腫瘤的治療從單純手術(shù)或化療過渡到了外科手術(shù)后接受化療和放射治療，在此基礎(chǔ)上，又認(rèn)識到手術(shù)前化療和放療的重要性（和腫瘤的性質(zhì)、分期有關(guān)）。

隨著生物治療基礎(chǔ)研究的深入，特別是免疫治療在腫瘤治療研究的開展，使醫(yī)學(xué)工作者建立起新的腫瘤治療理念：腫瘤的治療是外科手術(shù)、藥物化療、放射治療和生物治療聯(lián)合的綜合治療，當(dāng)前的生物治療主要是指免疫治療。

如何認(rèn)識腫瘤的免疫治療

對于腫瘤的認(rèn)識，大家早期覺得是一種“要命”的病，所以無論是醫(yī)生還是患者都認(rèn)為必須想盡辦法先把腫瘤清除干凈，也就是常說的“為了保命，再難受也得用（化療）”。

通過多年的經(jīng)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腫瘤化療過程中對患者的打擊很大，如化療出現(xiàn)的副作用（包括惡心、嘔吐、精神不佳、白細(xì)胞減少、免疫力下降等）導(dǎo)致患者的生活質(zhì)量下降，身心健康受到嚴(yán)重影響，甚至部分患者的死亡與化療導(dǎo)致機(jī)體極度衰弱有直接關(guān)系。因此，現(xiàn)在的化療過程中，醫(yī)生對上述副作用予以了高度重視，認(rèn)識到在治療腫瘤的同時(shí)，應(yīng)該兼顧患者的生活質(zhì)量。開發(fā)沒有或較小副作用的腫瘤治療方法一直是醫(yī)學(xué)工作者研究的重點(diǎn)之一。

二十世紀(jì)五十年代起，人們對腫瘤免疫學(xué)進(jìn)行了大量研究，證明機(jī)體對腫瘤存在特異性免疫反應(yīng)，為腫瘤治療打開一條新的思路，免疫療法成為腫瘤治療重要手段之一。

有觀點(diǎn)認(rèn)為：手術(shù)、放療、化療能治愈部分腫瘤患者，不是由于上述療法殺死了全部腫瘤細(xì)胞，而是由于當(dāng)腫瘤細(xì)胞負(fù)荷明顯降低時(shí)，機(jī)體的免疫功能恢復(fù)，清除了微小殘留病灶或明顯抑制了殘留腫瘤細(xì)胞的增殖。這說明機(jī)體免疫對腫瘤生長、轉(zhuǎn)化有重要意義。腫瘤的免疫治療和化療、放療相比，是一種副作用很小的“綠色治療”，是一種專門攻擊腫瘤細(xì)胞，而對正常細(xì)胞無損害的療法。

腫瘤的免疫治療主要包括：（1）腫瘤疫苗或主動(dòng)免疫治療；（2）單克隆抗體以及過繼性細(xì)胞免疫治療；（3）細(xì)胞因子治療等。以下重點(diǎn)介紹一種腫瘤疫苗――混合熱休克蛋白/肽免疫治療。

混合熱休克蛋白/肽免疫治療機(jī)制

傳染病疫苗以預(yù)防疾病為主（如乙肝疫苗預(yù)防乙肝的發(fā)生），但是，我們研發(fā)的腫瘤疫苗大部分是治療性疫苗，這些疫苗通過特異性激活機(jī)體的體液和細(xì)胞免疫殺傷腫瘤細(xì)胞。腫瘤疫苗的優(yōu)勢在于一旦應(yīng)用成功，可產(chǎn)生長期的免疫記憶細(xì)胞，消除腫瘤微小殘留病灶并減少腫瘤復(fù)發(fā)，其缺點(diǎn)是干擾因素多，起效時(shí)間長。混合熱休克蛋白就是一種腫瘤疫苗。

混合熱休克蛋白（heart shock protein，簡稱HSP）是一種分子伴侶，其亞型HSP―70、Gp―96、HSP110具有結(jié)合腫瘤抗原和遞呈抗原的作用，因此從腫瘤細(xì)胞中分離提取的HSP―70、Gp―96、HSP110、攜帶了廣譜腫瘤抗原，類似DNA指紋庫，稱為熱休克蛋白/肽復(fù)合物。這三者都可遞呈抗原給T細(xì)胞，誘發(fā)CD4+、CD8+細(xì)胞反應(yīng)，促進(jìn)樹突狀細(xì)胞成熟，即促進(jìn)了針對腫瘤的特異性細(xì)胞免疫，是誘發(fā)機(jī)體的抗腫瘤免疫作用的重要手段。它們具有多價(jià)性、特異性，只對自身的腫瘤有殺傷作用。

熱休克蛋白的另一種亞型HSP―60，具有活化機(jī)體非特異免疫作用，可活化吞噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、γδT細(xì)胞，以及自然殺傷細(xì)胞（NK），從而釋放多種細(xì)胞因子，并殺傷腫瘤細(xì)胞。

混合熱休克蛋白/肽的“綠色治療”

腫瘤患者，經(jīng)過多次入院治療，通過對周圍患者的觀察，一定注意到：和自己年齡相近的患者，患相同部位、相同大小的腫瘤，全程接受同一醫(yī)生的治療方案，最后出現(xiàn)不同的結(jié)果，是什么原因呢？

我們知道同一個(gè)環(huán)境成長的兩個(gè)孩子，雖然他們的語言相似（當(dāng)?shù)氐姆窖裕?，飲食?xí)慣相同，但是兩者之間仍然有很多性格方面的區(qū)別，成年后兩者的能力相差很大，此個(gè)體化性格造就了他們不同的發(fā)展前途。同樣的道理，同樣性質(zhì)的腫瘤發(fā)生在不同患者的機(jī)體，一樣存在不同的腫瘤生物學(xué)特性（只是現(xiàn)在的科學(xué)技術(shù)還不能發(fā)現(xiàn)他們之間的所有差別），因此，采用同一治療方案對待不同的患者，自然會(huì)出現(xiàn)不同的治療結(jié)果，其實(shí)這也就是醫(yī)生常說的“患者的個(gè)體差異”。

那么，腫瘤患者在接受常規(guī)治療的同時(shí)，如何再增加一種針對他本人的個(gè)體化治療方案呢？解決這個(gè)問題就必須從每位患者人手。就像我們經(jīng)常說的乙肝疫苗，它是通過對乙肝病毒信息深入研究的基礎(chǔ)上研制出來的，能夠把乙肝的信息作用于機(jī)體使機(jī)體產(chǎn)生預(yù)防乙肝病毒感染的能力，同時(shí)又不引起乙肝疾病。同樣的道理，我們通過對每位患者腫瘤組織的微觀信息進(jìn)行深入研究，能否也從患者的腫瘤組織中獲取能夠代表他自己的“個(gè)體化腫瘤信息物質(zhì)”，提取這種物質(zhì)成分，注射到患者機(jī)體，使患者產(chǎn)生專門針對自己腫瘤的免疫反應(yīng)，殺死腫瘤細(xì)胞，而對其他細(xì)胞不構(gòu)成傷害呢？

混合熱休克蛋白/肽就是從腫瘤患者的腫瘤組織提取的、能夠特異性代表患者腫瘤的信息物質(zhì)，其臨床應(yīng)用實(shí)現(xiàn)了個(gè)體化腫瘤治療的理念。通過我們臨床應(yīng)用的病例，證實(shí)它確實(shí)是只針對腫瘤細(xì)胞起作用，而對正常細(xì)胞不傷害的“綠色治療”，全部病例未發(fā)現(xiàn)明顯的副作用或不適表現(xiàn)。

混合熱休克蛋白/肽提取和臨床應(yīng)用流程

接受本治療方法的前提是必須在患者接受腫瘤切除手術(shù)前和主管醫(yī)生聯(lián)系，因?yàn)槭中g(shù)后獲得新鮮的腫瘤組織是此治療的關(guān)鍵。具體包括以下流程。

1 收集患者的新鮮腫瘤組織（病理科固定后的標(biāo)本不能提取混合熱休克蛋白/肽）。

2 通過免疫組化檢查腫瘤組織，確定患者腫瘤組織的微觀信息情況，包括有無表達(dá)上述文中提及的4種（即HSP―70、Gp―96、HSP110、HSP―60）熱休克蛋白，以及其量的多少。

篇9

摘要：目的：研究右美沙芬（DM）對激活的小膠質(zhì)細(xì)胞的作用及熱休克蛋白60（HSP60）在DM神經(jīng)保護(hù)中的作用機(jī)制。方法：培養(yǎng)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞株，分為對照組，細(xì)菌脂多糖組，（LPS），實(shí)驗(yàn)組（DM）。Western-blot檢測DM對LPS激活的BV2細(xì)胞HSP60和Caspase 3的影響，ELISA檢測DM對HSP60釋放的作用。結(jié)果：LPS組中HSP60和Caspase 3的表達(dá)及釋放都比對照組顯著增加，加入DM后，這些因子的水平都明顯降低。結(jié)論：DM可能通過HSP60信號通路途徑阻止小膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：熱休克蛋白60；右美沙芬；Caspase 3；小膠質(zhì)細(xì)胞

中圖分類號：G642.423 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1674-9324（2017）18-0277-02

熱休克蛋白是機(jī)體的一類應(yīng)激蛋白，在生理狀態(tài)下對機(jī)體起著保護(hù)功能。但是有研究發(fā)現(xiàn)，在病理情況下，很多細(xì)胞會(huì)大量表達(dá)熱休克蛋白60（HSP60），并將其釋放到胞外，引起細(xì)胞凋亡[1]。右美沙芬（Dextromethorphan，DM）是一種右旋嗎啡喃化合物[2]，對動(dòng)物因低血糖或腦缺血引起的神經(jīng)損傷具有保護(hù)作用，DM被證明能有效抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化，并且可抑制細(xì)胞炎癥因子如TNF-α、IL-6，NO和超氧化自由基等[3]，但是右美沙芬的作用機(jī)制目前尚不清楚。

一、材料與方法

（一）材料

右美沙芬和LPS購自Sigma公司；HSP60抗體購自ENZO公司；Caspase 3及β-actin抗體購自Cell Signaling公司；蛋白定量BCA試劑盒購自Thermo公司；ELISA試劑盒購自欣博盛公司。

（二）方法

1.小膠質(zhì)細(xì)胞BV2的培B。BV2細(xì)胞培養(yǎng)在DEME培養(yǎng)基中，含10%胎牛血清。利用1μg/ml LPS處理30min后，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入DM溶液（10μM），作用24小時(shí)后收集細(xì)胞及上清。

2.Western blot檢測蛋白含量。藥物處理完畢，提取各實(shí)驗(yàn)組的蛋白并收集上清液，10% SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉膜2小時(shí)。然后加入一抗，置于4℃過夜。利用TBST洗滌膜三次，洗去未結(jié)合的一抗。最后用二抗室溫孵育1 h，利用ECL試劑顯色成像。

3.ELISA試劑盒檢測HSP60的釋放。按照HSP60 ELISA試劑盒操作說明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，最后酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀上，450nm處測定各孔光密度值（OD）。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用SPSS11.11進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用x±s表示，組間比較用方差分析，進(jìn)一步比較兩兩間差異采用Student-Neuman-Keuls Test方法。

二、結(jié)果

（一）DM顯著抑制LPS激活的小膠質(zhì)細(xì)胞HSP60的表達(dá)及釋放

LPS激活后的小膠質(zhì)細(xì)胞中HSP60的表達(dá)明顯高于對照組，差異具有顯著性。加入DM可顯著抑制LPS引起的HSP60的升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

（二）DM抑制Caspase 3的表達(dá)

Western blot結(jié)果表明，LPS激活的小膠質(zhì)細(xì)胞中Caspase 3的表達(dá)明顯高于對照組，在DM處理的實(shí)驗(yàn)組中，Caspase 3的表達(dá)顯著下降，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

三、討論

熱休克蛋白是一類應(yīng)激蛋白，對機(jī)體主要起著保護(hù)作用。但是HSP60對細(xì)胞凋亡具有雙重作用。我們先前的研究發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞中HSP60的表達(dá)和定位都發(fā)生了改變，導(dǎo)致心肌細(xì)胞的損傷或凋亡[4]。但是關(guān)于HSP60在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用的報(bào)道還很少見。

小膠質(zhì)細(xì)胞的激活參與了多種神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變?nèi)缋夏臧V呆癥、帕金森癥等的發(fā)生發(fā)展[5]。本研究假設(shè)HSP60在激活的小膠質(zhì)細(xì)胞中高度表達(dá)，并被釋放至胞外。胞外的HSP60激活凋亡因子Caspase 3，導(dǎo)致周圍其他神經(jīng)細(xì)胞的損傷或凋亡。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了在LPS激活的小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)HSP60的表達(dá)顯著增高，胞外也檢測到HSP60，并增強(qiáng)了Caspase 3的表達(dá)。這些結(jié)果與心肌細(xì)胞中關(guān)于HSP60的研究結(jié)果的報(bào)道一致，說明小膠質(zhì)細(xì)胞活化后釋放至胞外的HSP60可進(jìn)一步激活自身導(dǎo)致自身的凋亡。

右美沙芬可能是一種潛在的治療神經(jīng)系統(tǒng)炎性疾病的藥物[6]。本實(shí)驗(yàn)中，我們證實(shí)了DM能有效抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，為一些神經(jīng)退行性疾病的防治提供了潛在的藥物治療靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

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收稿日期：2016-11-30

基金項(xiàng)目：2016年國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201610752010）

作者簡介：王俊燕（1992-），女（漢族），寧夏銀川人，寧夏醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)專業(yè)本科生；李玲（1973-），女（漢族），寧夏銀川人，?？?，主治醫(yī)師，銀川市第一人民醫(yī)院高壓氧科，主要從事高壓氧神經(jīng)科學(xué)研究；張燕（1992-），女，寧夏銀川人，寧夏醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)專業(yè)本科生；

篇10

【關(guān)鍵詞】 甲醛；適應(yīng)性反應(yīng)；蛋白質(zhì)組

摘要： 目的 研究甲醛誘導(dǎo)真核細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)及其可能的機(jī)制。方法 建立甲醛刺激人胚肺成纖維細(xì)胞(MRC-5)適應(yīng)性反應(yīng)模型；采用AlamarBlue還原率檢測細(xì)胞增殖。雙向凝膠電泳分離細(xì)胞總蛋白，圖像分析后選取差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。結(jié)果 AlamarBlue檢測結(jié)果表明，低劑量甲醛預(yù)刺激可誘導(dǎo)細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)。雙向凝膠電泳結(jié)果顯示，甲醛刺激后19個(gè)蛋白斑點(diǎn)發(fā)生變化，肽指紋圖譜及肽序列標(biāo)簽鑒定了其中13個(gè)蛋白斑點(diǎn)，已鑒定的蛋白包括二磷酸核苷酸激酶、延長因子1-γ，磷酸丙糖異構(gòu)酶、60S酸性核糖體蛋白P0、75kDa熱休克蛋白、70kD熱休克蛋白樣結(jié)合蛋白、鈣依賴磷脂結(jié)合蛋白I、假想蛋白FLJ34423、微管-肌動(dòng)蛋白交叉連接因子1、核纖層蛋白B2、ATP合成酶α鏈、蛋白酶體α亞基6，這些蛋白功能涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、蛋白折疊、信號傳導(dǎo)、能量代謝、細(xì)胞骨架等各個(gè)方面。結(jié)論 低劑量甲醛可誘導(dǎo)MRC-5細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)，多種蛋白參與細(xì)胞的適應(yīng)性反應(yīng)調(diào)控。

關(guān)鍵詞： 甲醛；適應(yīng)性反應(yīng)；蛋白質(zhì)組

Proteomie analysis of adaptive response induced by low concentration of formaldehyde in human embryonic fibroblasts cells

Abstract： Objective To study the adaptive response induced by formaldehyde(FA) on eukaryocyte and its possible mechanism.Methods After FA treatment，AlamarBlue reducing rate was observed to determine the cell proliferation.The total cellular proteins were separated using two-dimensional gel electrophoresis and visualized by sliver staining.Gels from different batches of control and FA-treated MRC-5 cells were analyzed for quantitative spot comparisons with the ImageMaster 2D platinum 5.0 software.The differentially expressed prorein spots were picked and digested in gel then identified by tandem mass spectrum.Results The results of AlamarBlue reducing rate showed that low concentration of FA induced adaptive response on MRC-5 cells.Nineteen spots were changed significantly after FA treatment.Thirteen proteins were identified by peptide mass fingerprinting or peptide sequence analysis，including putative nucleoside diphosphate kinase，elongation factor 1-gamma，triosephosphate isomerase，60S acidic ribosomal protein P0，heat shock protein 75 kDa，similar to heat shock 70kD protein binding protein，annexin I，hypothetical protein FLJ34423，microtubule-actin crosslinking factor 1，lamin B2，ATP synthase alpha chain，mitochondrial precursor，proteasome subunit alpha type 6.These identified proteins involved in energy metabolism，translation and RNA processing，protein folding，redox regulation，cell structure and cell signaling.Conclusion Adaptive response can be induced by low concentration of FA on MRC-5 cells and cellular adaptation is a complex process involving in a modulation of perse cellular functions.

Key words： formaldehyde；adaptive response；proteomics

適應(yīng)性反應(yīng)（adaptive response）是機(jī)體受到低劑量環(huán)境因子預(yù)刺激后對后續(xù)高劑量的刺激產(chǎn)生耐受的現(xiàn)象。研究表明〔1〕，許多環(huán)境刺激因子低劑量接觸可誘導(dǎo)適應(yīng)性反應(yīng)。但適應(yīng)性反應(yīng)是否為自然界普遍存在的現(xiàn)象，適應(yīng)性反應(yīng)的機(jī)制還未闡明。甲醛(FA)是常見的環(huán)境化學(xué)污染物，早期研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體接觸低劑量甲醛可能誘導(dǎo)產(chǎn)生某種耐受與適應(yīng)現(xiàn)象，但尚未對其機(jī)制進(jìn)行探討〔2，3〕。本實(shí)驗(yàn)利用建立的甲醛適應(yīng)性反應(yīng)細(xì)胞模型，采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究了甲醛刺激后人胚肺成纖維細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)差異，并用串聯(lián)質(zhì)譜鑒定差異蛋白，為了解甲醛誘導(dǎo)細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)的分子機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

11 材料 甲醛(上海標(biāo)準(zhǔn)試劑）、硫脲(美國Sigma公司)；等電聚焦膠條(13cm pH4～7)、尿素、二巰基蘇糖醇(瑞典Amersham公司)；丙基磺酸鹽、碘乙酰氨(美國USP公司)；胰蛋白酶(測序級)、丙烯酰胺(美國Promega公司)；AlamarBlue染料(美國Biosource公司)；其余試劑采用國產(chǎn)分析純。

12 方法

121 細(xì)胞培養(yǎng) MRC-5細(xì)胞來源于成都腫瘤研究所，培養(yǎng)于改良的伊格培養(yǎng)基(DMEM)，含10％胎牛血清，100kU/L青霉素，100mg/L鏈霉素。FA臨用前用無血清DMEM配制。

122 AlamarBlue檢測細(xì)胞增殖 將細(xì)胞接種于96孔板，至對數(shù)生長期，按實(shí)驗(yàn)方案分別加入適應(yīng)性反應(yīng)劑量(10μmol/L)及攻擊劑量(500μmol/L)的甲醛，對照組分別加入相同體積的無血清DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)結(jié)束前4h每孔加入10μl染料，繼續(xù)培養(yǎng)4h用酶標(biāo)儀測吸光度值計(jì)算AlamarBlue還原率。

123 雙向凝膠電泳 參照Amersham公司技術(shù)手冊及本實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)的技術(shù)方法〔4〕，上樣量90μg，上樣體積250μl，等電聚焦42000～48000vhs，聚焦時(shí)間19～21h。樣品收集方案：FA染毒低劑量組為10μmol/L刺激12h，高劑量組為500μmol/L FA刺激5h，適應(yīng)組為10μmol/L FA預(yù)刺激12h后500μmol/L FA刺激5h，空白對照組加入相應(yīng)體積無血清DMEM，收集不同批次的細(xì)胞重復(fù)至少3次。

124 圖像采集和分析 染色后的雙向電泳凝膠用的圖像掃描儀掃描(瑞典Amersham公司)后采用ImageMaster 2D platinum 5.0軟件進(jìn)行圖像分析。分析過程包括蛋白質(zhì)斑點(diǎn)檢測及編輯、背景扣除、以全體點(diǎn)之和作歸一化處理后進(jìn)行斑點(diǎn)匹配。分析3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)所得二維電泳膠，結(jié)果以占總蛋白點(diǎn)灰度值的百分比表示。最大比值(Max ratio)為各組數(shù)值間最大值與最小值的比，如各組間有為0的數(shù)據(jù)，Max ratio計(jì)為100000。

125 質(zhì)譜檢測及數(shù)據(jù)庫搜索 切取在不同批次膠上重復(fù)性較好的差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)，膠內(nèi)酶解后用質(zhì)譜分析(ABI4700，美國ABI公司)檢測，激光強(qiáng)度355nm， 200Hz，選定5個(gè)最強(qiáng)峰做串聯(lián)質(zhì)譜，所得肽譜用搜索引擎(MASCOT)對人類蛋白組數(shù)據(jù)庫(IPI HUMAN)搜索。

13 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS110軟件進(jìn)行單因素方差分析；二維電泳圖像分析采用ImageMaster 2D Platinum5.0軟件分析。

2 結(jié)果

21 低劑量FA預(yù)刺激對MRC-5細(xì)胞增殖的影響 MRC-5細(xì)胞分別給予500μmol/L FA刺激5h，及10μmol/L FA預(yù)刺激12h后500μmol/L FA刺激5h，檢測AlamarBlue還原率。結(jié)果顯示，空白對照組AlamarBlue還原率為(0.5771±0.0238)，高劑量組下降至(0.4922±0.019)，適應(yīng)組細(xì)胞為(0.56911±0.03383)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

22 低劑量FA預(yù)刺激后MRC-5細(xì)胞雙向電泳圖譜差異 經(jīng)圖像分析發(fā)現(xiàn)，對照組MRC-5細(xì)胞檢測到(834±74)個(gè)蛋白點(diǎn)，低劑量組為(917±118)個(gè)，高劑量組為(820±116)個(gè)，適應(yīng)組為(874±107)個(gè)，凝膠匹配后發(fā)現(xiàn)，19個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)發(fā)生改變，變化量達(dá)2倍以上，見表1。表1 FA刺激后二維電泳差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)（略）

23 低劑量FA預(yù)刺激后MRC-5細(xì)胞差異蛋白質(zhì)譜分析及數(shù)據(jù)庫搜索 選擇19個(gè)差異表達(dá) 的蛋白點(diǎn)進(jìn)行鑒定，經(jīng)肽指紋圖譜(PMF)及肽序列標(biāo)簽(MS／MS)鑒定了其中13個(gè)蛋白點(diǎn)，其余因無法得到好的肽指紋圖譜或搜索數(shù)據(jù)庫時(shí)無法得到可信度較高的結(jié)果而未能鑒定。已鑒定的蛋白結(jié)果見表2。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，低劑量FA預(yù)刺激后細(xì)胞可耐受更大劑量FA的攻擊，提示FA可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)。磷酸丙糖異構(gòu)酶參與多種能量代謝途徑；二磷酸核苷酸激酶與三磷酸核苷合成有關(guān)，是癌基因c-Mye的激活因子；蛋白酶體參與泛素依賴的蛋白降解；60S酸性核糖體蛋白PO與E.Coli蛋白L10功能相似；75kDa熱休克蛋白及70kDa熱休克蛋白樣結(jié)合蛋白作為分子伴侶或分子伴侶結(jié)合蛋白發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)；微管-肌動(dòng)蛋白交叉連接因子1、核纖層蛋白B2與細(xì)胞骨架相關(guān)；鈣依賴磷脂結(jié)合蛋白I(ANX I)為鈣依賴的磷脂結(jié)合家族成員，具有多種生物學(xué)功能；延長因子1在蛋白翻譯過程中起重要作用：ATP合成酶α鏈與ATP合成有關(guān)，提示甲醛誘導(dǎo)的細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的過程，需要多種蛋白共同參與。本研究所鑒定的甲醛適應(yīng)性反應(yīng)相關(guān)蛋白中，熱休克蛋白和ANX I的誘導(dǎo)表達(dá)與氫醌誘導(dǎo)的適應(yīng)性反應(yīng)蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果有共同之處〔4〕。提示這2種蛋白可能在化學(xué)物誘導(dǎo)的適應(yīng)性反應(yīng)的共同機(jī)制中具有重要作用。已有研究表明，在應(yīng)激條件下熱休克蛋白的表達(dá)對細(xì)胞具有保護(hù)作用〔5〕。ANX I也可被熱應(yīng)激、過氧化氫、亞砷酸鹽等多種因素誘導(dǎo)，提示ANX I也可能是一種熱休克蛋白(HSPs)〔6〕。HSPs在化學(xué)物誘導(dǎo)的適應(yīng)性反應(yīng)中所起的作用是特異性的抑制或非特異性，其表達(dá)是適應(yīng)性反應(yīng)產(chǎn)生的因或果，以及HSPs與其他適應(yīng)性反應(yīng)相關(guān)蛋白之間的關(guān)系都有待進(jìn)一步研究。

表2 FA調(diào)節(jié)蛋白Mascot數(shù)據(jù)庫搜索結(jié)果（略）

注：a PMF鑒定結(jié)果；b MS/MS鑒定結(jié)果

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