胰蛋白酶范文
時間：2023-04-12 02:25:15
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篇1
【摘要】
目的認識蘇木素對胰蛋白酶作用活性的影響及蘇木素對胰蛋白酶作用的熒光性質。方法用酶活性法觀察蘇木素對胰蛋白酶活性的影響；用紫外光譜和熒光光譜研究蘇木素對胰蛋白酶作用的光譜性質。結果蘇木素對胰蛋白酶活性可產(chǎn)生競爭性抑制，抑制劑常數(shù)k1=6.13×10-5 mol/l；蘇木素對胰蛋白酶的熒光猝滅效應為靜態(tài)猝滅；蘇木素與胰蛋白酶之間的作用力主要表現(xiàn)為氫鍵和范德華力。結論蘇木素可使胰蛋白酶分子中的色氨酸所處環(huán)境的疏水性增強，使胰蛋白酶分子構象發(fā)生變化。
【關鍵詞】 蘇木素 胰蛋白酶 熒光光譜 紫外光譜 酶活性
中藥蘇木的主要成分蘇木素(haematorylin)是組織、病理實驗室中最常用的染色劑，可用于細胞核染色［1］。蘇木素具有收縮血管、中樞抑制及抗炎等作用，具有行血、破淤、消腫、止痛的功效［2］。胰蛋白酶(trypsin)是人和動物腸道中一種重要的蛋白水解酶，從該酶被發(fā)現(xiàn)以來，人們對其進行了一定的研究，如用胰蛋白酶為催化劑對蛋白質進行降解的研究［3～5］。藥物對胰蛋白酶作用的性質［6］及蘇木素與dna作用的性質的研究已引起重視［7］。本文主要通過紫外和熒光光譜法研究蘇木素與胰蛋白酶作用的性質，從而獲得蘇木素與胰蛋白酶作用時結構變化、所處微環(huán)境等信息，探討蘇木素與胰蛋白酶相互作用的機制，并對蘇木素與胰蛋白酶作用活性的影響也進行了研究。
1 器材
1.1 儀器熒光分光光度計，美國cary eclipse（瓦里安）產(chǎn)品；雙光束紫外可見分光光度計tu－1901，北京普析產(chǎn)品；ph－3c型酸度計，上海精密 科學 儀器有限公司產(chǎn)品。
1.2 藥品牛胰蛋白酶（生化試劑），上海海洋生物技術有限公司產(chǎn)品；蘇木素（生物染色劑bs），成都科龍化工試劑廠產(chǎn)品；硼酸（分析純 ），成都科龍化工試劑廠產(chǎn)品。
2 方法
2.1 蘇木素對胰蛋白酶活性影響在恒溫水浴箱中將酪蛋白、胰蛋白酶和蘇木素預熱，按酶活性的測定方法，在胰蛋白酶與酪蛋白的酶解反應體系中加入不同體積的蘇木素溶液，測定蘇木素對酶活性的影響。胰蛋白酶活性及抑制常數(shù)測定參照 文獻 ［8］方法操作。
2.2 蘇木素對胰蛋白酶紫外光譜的影響配制ph＝7.5的硼酸緩沖溶液（內含0.1 mol/l cacl2維持離子強度）；用硼酸緩沖溶液配制1.0×10-4mol/l的胰蛋白酶溶液，再用3次蒸餾水分別配制2.0×10-3mol/l和1.0×10-3mol/l的蘇木素溶液。
室溫條件下，在1 cm×1 cm的石英比色皿中準確加入1.0×10-4mol/l的胰蛋白酶溶液3.0 ml，掃描190～350 nm的吸收光譜。然后用微量注射往其中準確加入1.0×10-3mol/l的蘇木素溶液10 μl，混勻，靜置2 min后掃描190～350 nm的吸收光譜。掃描1.0×10-3 mol/l蘇木素溶液190～350 nm的吸收光譜。
2.3 蘇木素對胰蛋白酶熒光光譜影響在1 cm×1 cm的石英比色皿中準確加入 1.0×10-4mol/l的胰蛋白酶溶液3.0 ml，用微量注射器分別加入2.0×10-3mol/l的蘇木素溶液0，10，20，30，40，50，60，70 μl。每次加入后混勻，放置5 min，分別在20，25，30，35℃下，測定其熒光光譜，激發(fā)波長為280 nm，繪制288～450 nm的熒光光譜。
2.4 蘇木素對胰蛋白酶作用的同步熒光將“2.3”項下所配的溫度為298 k的溶液，固定激發(fā)和發(fā)射波長間隔λ分別為20 nm和60 nm，同時掃描激發(fā)和發(fā)射波長并記錄同步熒光光譜。
3 結果
3.1 蘇木素對胰蛋白酶活性的影響蘇木素對胰蛋白酶有抑制作用，當蘇木素濃度為4.5×10-4 mol/l時，蘇木素使胰蛋白酶的相對活性下降到70.2%，抑制率為29.8%。在不同的底物濃度（40，30，20，10 g/l酪蛋白溶液）下，按酶活性的測定方法測定酶的反應速度，其結果以1/v對抑制劑量用dixon作圖法求出ki=6.13×10-5mol/l，抑制類型為非競爭性抑制。
3.2 蘇木素對胰蛋白酶紫外吸收光譜影響圖1為t＝298k，ph＝7.4時的吸收光譜。蛋白質分子中的色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸殘基均有紫外吸收，蛋白質的吸收波長一般在280 nm附近。從圖1可以看出，當往胰蛋白酶中加入蘇木素后，混合溶液在280 nm附近的吸收峰均明顯增高，說明蘇木素與胰蛋白酶之間發(fā)生了作用，改變了胰蛋白酶的構象,而這種作用有利于胰蛋白酶分子中色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸殘基的π－π* 電子 躍遷。
3.3 熒光光譜以λex＝280 nm，胰蛋白酶在354 nm附近有很強的熒光峰；而以同樣激發(fā)波長激發(fā)蘇木素溶液，在354 nm附近則沒有熒光峰，證明蘇木素不會產(chǎn)生與胰蛋白酶干擾的熒光。固定胰蛋白酶的量，隨著體系中蘇木素濃度的增加，胰蛋白酶的內源熒光產(chǎn)生有 規(guī)律 的猝滅，其最大發(fā)射波長未發(fā)生明顯的變化（見圖2）。
3.4 熒光猝滅常數(shù)及猝滅機理
3.4.1 蘇木素對胰蛋白酶的猝滅效應一般情況下，可依據(jù)不同溫度下的結果區(qū)別是動態(tài)猝滅，還是靜態(tài)猝滅。對于動態(tài)猝滅，隨著溫度升高，將增加離子有效碰撞的數(shù)目，加劇 電子 的轉移，使熒光物質的猝滅常數(shù)隨溫度的升高而增大。而對于靜態(tài)猝滅則溫度升高將降低復合物的穩(wěn)定性，使猝滅常數(shù)減小。本文以相同的實驗條件，分別測定了在20，25℃ 下胰蛋白酶的熒光猝滅光譜，以［f0/f－1］對［c］作stern－volmer圖見圖3。從圖3可以看出蘇木素在溫度低于25℃時猝滅常數(shù)隨溫度的升高而降低，即符合靜態(tài)猝滅機理。
當猝滅體分子和熒光物質分子之間形成新的復合物而發(fā)生靜態(tài)猝滅時，服從lineweaver-burk方程。20，25℃時以（f0－f）－1對［c］－1擬合lineweaver-burk方程，由圖4可見該雙倒數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關系，再次確定在20，25℃時為靜態(tài)猝滅。
3.4.2 結合位點數(shù)n及結合常數(shù)ka的 計算 設蘇木素與胰蛋白酶形成n個結合點位的復合物則有：
lg［（f0－f）/f］＝lgka+nlg［c］
分別作不同溫度下lg［（f0－f）/f］－lg［c］的雙對數(shù)擬合，得到不同溫度下的ka和n見表1。表1 蘇木素與胰蛋白酶的結合常數(shù)，結合位點數(shù)及相應的相關系數(shù)（略）
3.4.3 作用力類型的確定猝滅體與生物大分子之間的相互作用力主要有氫鍵、范德華力、靜電引力和疏水作用力。根據(jù)以下公式計算。結果見表2。表2 蘇木素與胰蛋白酶作用的熱力學參數(shù)（略）
ln(k2/k1)=h(1/t1-1/t2)/r
g=-rtlnk
s=(h-g) /t
由上可知，h＜0和s＜0，可以說明蘇木素與胰蛋白酶之間的作用力主要表現(xiàn)為氫鍵和范德華力［9］。
3.4.4 蘇木素對胰蛋白酶構象的影響固定激發(fā)波長與發(fā)射波長的間距λ，掃描同步熒光光譜，這種光譜可用于蛋白質構象變化的分析,由(a)λ＝20 nm所得到的同步熒光光譜圖僅顯示的是酪氨酸殘基的熒光，(b)λ＝60 nm時僅表現(xiàn)出色氨酸殘基的熒光，由圖5可以看出在此實驗條件下，酪氨酸和色氨酸殘基熒光同時被猝滅，使其熒光強度下降，酪氨酸殘基的最大發(fā)射波長沒有發(fā)生改變，但色氨酸殘基的最大發(fā)射波長發(fā)生了藍移，表明色氨酸基所處環(huán)境的疏水性增強，引起了胰蛋白酶的構象變化。
4 結論
蘇木素對胰蛋白酶活性可產(chǎn)生非競爭性抑制，抑制劑常數(shù)ki=6.13×10-5mol/l；蘇木素對胰蛋白酶的熒光猝滅效應為靜態(tài)猝滅，說明蘇木素能與胰蛋白酶形成復合物；蘇木素與胰蛋白酶之間的作用力主要表現(xiàn)為氫鍵和范德華力；蘇木素與胰蛋白酶可發(fā)生作用，改變了胰蛋白酶的構象，而色氨酸所處環(huán)境的疏水性增強顯著。
【 參考 文獻 】
［1］鄭 偉.蘇木素染液中媒染劑用量的探討［j］.解剖學雜志，2006，29（1）：21.
［2］江蘇新醫(yī)學院. 中藥大辭典［s］．上海: 上海 科學 技術出版社，1988：1084．
［3］朱少娟，施用暉，樂國偉.超聲波對胰蛋白酶水解酪蛋白的影響［j］.食品與生物技術學報,2005，24（2）:50.
［4］ci ozer．kinetic analysis of enzyme inactivation under second-order conditions by use of substrate-to-product progress curves：application to inhibition of trypsin by α-1 protease inhibitor［j］．a(chǎn)nalytical biochemistry，1998，264：199.
［5］ai qing，shi gui-xin，bei jian-zhong，et a1．enzymatic degradation behavior and mechanism of poly(1actide-coglycolide) foams by trypsin［j］．biomaterials，2003，24：629.
［6］刁家志，陸 珊，趙 巍，等.葛根素與胰蛋白酶相互作用研究［j］.化學研究與應用，2006， 18（3）：280.
［7］王興明，黎泓波，胡亞敏，等.蘇木素與dna相互作用的光譜研究［j］.化學學報，2007，65（2）：140.
篇2
關鍵詞胰蛋白酶； 賴氨酸C端內切酶； 順序酶切； 蛋白質組學； 液相色譜串聯(lián)質譜； 遺漏酶切
1引 言
“鳥槍法”蛋白質組學（Shotgun proteomics）鑒定， 是基于高效液相色譜和質譜技術的“自下而上”（Bottomup）的蛋白質組學分析技術， 具有高靈敏度、高通量的特點[1]。該技術將蛋白質經(jīng)特定蛋白酶酶切消化成肽段， 采用液相色譜串聯(lián)質譜技術（LCMS/MS）進行分析[2]， 將檢測到的肽段圖譜與理論圖譜進行匹配， 對蛋白質進行定性與定量分析?；谫|譜的蛋白質組學研究， 已經(jīng)建立了幾乎完整的酵母蛋白質組表達譜[3]， 并于2014年繪制了第一張人類蛋白質組草圖[4]。目前， 臨床蛋白質組學項目已經(jīng)完成了人類結直腸癌、乳腺癌、卵巢癌等臨床組織的蛋白質組表達譜的分析[5～7]。
近十年來， “鳥槍法”蛋白質組學在細胞裂解、肽段分離、質譜碎裂方式、生物信息學分析手段等[8]方法學研究上取得了重大進展， 然而在蛋白質酶切中仍然多使用單一的蛋白酶―胰蛋白酶（Trypsin）。Trypsin可特異性識別并切割蛋白質/多肽鏈中賴氨酸（K）或精氨酸（R）羧基端， 具有極高的位點特異性， 酶切產(chǎn)生的肽段主要以賴氨酸殘基或精氨酸殘基結尾， 這些肽段在酸性條件下容易帶二價或更高價態(tài)正電荷而被質譜檢測， 因此Trypsin在Shotgun proteomics 研究中廣泛使用。然而， Trypsin也存在一些缺陷， 如酶切時切割蛋白質不完全[9]， 且切割K、R位點的效率不同， 尤其K酶切位點的遺漏酶切比例較高[10]。樣本制備體系中高濃度的鹽、表面活性劑等都可能抑制Trypsin的活性[9]。Trypsin的這些缺陷將直接影響蛋白質鑒定的效率、質譜分析的重現(xiàn)性和蛋白質定量的準確性。
賴氨酸C端內切酶（LysC）是特異性識別并切割賴氨酸羧基端的蛋白酶， 在強變性條件下仍然具有酶切活性[10]。LysC與Trypsin聯(lián)用， 能夠在一定程度上克服Trypsin的上述缺陷， 使得蛋白質酶切更充分。1999年， Link等[11]首次提出將LysC與Trypsin聯(lián)合用于分析大分子復合物； 隨后， McDonald等[12]提出LysC/trypsin順序酶切（蛋白先經(jīng)LysC酶切， 再用Trypsin進一步酶切）方法， 用于復雜的蛋白質組學研究。Wada等[13]比較了十二烷基硫酸c聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）膠內酶切時， LysC/trypsin順序酶切與Trypsin單獨酶切對蛋白鑒定結果的影響， 結果表明使用順序酶切得到的肽段長度適宜， 更易于從膠內提取出來， 而且更利于質譜鑒定。溶液內酶切（In solution digestion）由于具有操作簡便、快捷、樣本損失量少等優(yōu)點， 是蛋白質組學研究中最為常用的酶切體系[15]。雖然LysC/trypsin順序酶切已廣泛用于溶液內消化[16]， 但目前很少有對溶液酶切條件下LysC/trypsin順序酶切與Trypsin單獨酶切進行比較的研究報道。2012年， Wisniewski 等[14]使用FASP（Filter aided sample preparation）方法， 發(fā)現(xiàn)順序酶切得到的肽段總量增加了一倍， 且鑒定到的肽段數(shù)目、蛋白質數(shù)目均有顯著增加。但該方法先用LysC在超濾管中對蛋白樣本進行酶切， 之后離心收集酶切的肽段； 然后再向超濾管中加入Trypsin酶進行消化后， 離心收集酶切好的肽段， 最后合并兩次離心得到的肽段樣本。顯然第一次離心收集的肽段因為僅用LysC酶切， 得到的肽段中會含有較多的R位點漏切的肽段， 肽段也較長， 在一定程度上不利于質譜檢測。Glatter等[17]研究了溶液內LysC/trypsin順序酶切的優(yōu)勢， 認為利用LysC/trypsin順序酶切能得到較多的全酶切肽段， 從而提高可定量蛋白質的數(shù)目及定量結果的準確性， 但該研究并沒有深入分析和探討LysC/trypsin順序酶切在蛋白質組樣本鑒定方面的差異。目前， 對于LysC/trypsin順序酶切在蛋白質組學樣本制備中的應用仍然缺乏系統(tǒng)、全面的評估。
在順序酶切時， 蛋白質與酶的質量比不同也可能會影響酶切效果， 常用的LysC質量比和Trypsin質量比例分別有100∶1和50∶1兩種[18～21]。然而不同酶用量對實驗結果是否有影響， 合適的酶用量是多少， 尚無詳細和深入的研究報道。
本研究利用溶液內酶切方式， 從鑒定到的肽段數(shù)目、蛋白質數(shù)目、遺漏酶切位點數(shù)目、K/R遺漏酶切比例以及肽段長度和蛋白質覆蓋率等多個方面， 評估了LysC/trypsin順序酶切與Trypsin單獨酶切的特性， 并比較了不同酶用量下對最終蛋白質組學樣本檢測結果的影響， 優(yōu)化了酶切實驗方案， 不僅大大提高了酶切效率， 而且也顯著提高了蛋白質組學樣本的檢測效率和靈敏度。
2實驗部分
2.1儀器與試劑
Orbitrap Fusion三合一質譜儀， EASYnLC 1000納升級液相色譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）； DHP9052電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海善志儀器設備有限公司）。
293T人腎上皮細胞（ATCC細胞庫）； DMEM培養(yǎng)基（美國Introvigen公司）； 尿素（色譜純）、NH4HCO3、半胱氨酸（純度97%）、色譜純三氟乙酸（TFA）、質譜級甲酸（FA）（德國SigmaAldrich公司）； 蛋白酶抑制劑（瑞士Rocher公司）； 二硫蘇糖醇（DTT， 純度99%）、碘乙酰胺（IAA， 純度98%）（比利時Acros Organics公司）； 增強型BCA蛋白濃度測定試劑盒（江蘇碧云天生物技術公司）； 質譜純乙腈（美國Thermo Fisher公司）； 質譜純LysC、Trypsin（北京華利世科技有限公司）； 其它試劑均為色譜純。
2.2實驗方法
293T細胞在含10%胎牛血清（FBS）、1×105 U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中常規(guī)貼壁培養(yǎng)。生長至對數(shù)期后， 收集細胞， PBS緩沖溶液洗滌3次， 加入細胞裂解液（8 mol/L 尿素， 100 mmol/L NH4HCO3， 1×蛋白酶抑制劑， pH 8.0）， 冰上裂解30 min， 超聲波破碎， 20000 g離心5 min， BCA法測定上清液蛋白質濃度。加入5 mmol/L DTT， 56℃ 反應30 min； 再加入15 mmol/L IAA， 避光條件下室溫反應30 min； 最后加入30 mmol/L半胱氨酸， 室溫反應30 min， 終止烷基化反應。
酶切消化過程分析進行5組實驗， 第一組為Trypsin單獨酶切（Tryp50/tryp100）， 其余四組為不同酶用量組合的LysC/trypsin順序酶切（LysC50/tryp50， LysC50/tryp100， LysC100/tryp50， LysC100/tryp100）， 如圖1所示。Trypsin單獨酶切（Tryp50/tryp100）的方法為先將蛋白質溶液稀釋4倍， 再按照蛋白質與酶質量比50∶1加入Trypsin （tryp50）， 37℃反應16 h后， 按照蛋白質與酶質量比100∶1補加Trypsin （tryp100）， 37℃繼續(xù)反應3 h。順序酶切的實驗方法為： 蛋白質溶液不經(jīng)稀釋直接按預定比例（LysC50表示蛋白質與LysC的質量比為50∶1， LysC100表示蛋白質與LysC的質量比為100：1）加入LysC， 37℃反應3 h， 再將蛋白質溶液稀釋4倍， 并按預定比例加入Trypsin， 37℃繼續(xù)反應16 h。每組實驗重復3次。酶切后的肽段用C18脫鹽柱脫鹽， 轉干，
2.3高效液相色譜和質譜方法
液相色譜分離分析柱為自制毛細管柱（75 μm×15 cm）， 填充C18填料（3 μm粒徑， 100 Dikma Technologies）。流動相A： 甲酸乙腈水=0.1∶2∶98（V/V）； 流動相B： 甲酸乙腈水（0.1∶98∶2， V/V）。梯度洗脫： 0～20 min， 8%～13% B； 20～51 min， 13%～26% B； 51～56 min， 26%～45% B； 56～57 min， 45%～80% B； 57～60 min， 80% B。流速： 300 nL/min。
Orbitrap Fusion質譜儀， 正離子模式檢測， 離子傳輸毛細管的溫度為300℃， 歸一化碰撞能量為28%。采用數(shù)據(jù)依賴模式（Datadependent acquisition， DDA）進行采集， 包含一次MS全掃描（m/z 350～m/z 1300）， 分辨率R=120000（m/z 200）， 對其中強度最高的10個峰進行二級MS/MS掃描分析， 動態(tài)排除時間設置為60 s。
2.4數(shù)據(jù)處理
使用msconvert軟件將質譜原始raw文件格式轉化為mgf文件。使用Mascot 2.3.0搜索引擎搜索， 蛋白質數(shù)據(jù)庫為Uniprot Human（版本： 20130507）； 胰酶最大漏切位點數(shù)為2， 母離子質量容差為10 ppm， 碎片離子質量容差0.5 Da， 固定修飾為半胱氨酸的烷基化修飾， 甲硫氨酸的氧化和蛋白質N端的乙酰化為可變修飾。采用離子分數(shù)20分篩選（cutoff）的方式進行過濾， 控制蛋白水平的FDR（False discovery rate）為1%。
3結果與討論
3.1鑒定到的肽段數(shù)與蛋白數(shù)
首先對其鑒定到的肽段匹配譜圖數(shù)（Peptidespectrum match， PSM）、非冗余肽段數(shù)目、蛋白獨有肽段數(shù)目和蛋白質數(shù)目進行對比分析， 結果如圖2A和2B所示， LysC/trypsin順序酶切的肽段鑒定數(shù)目、蛋白質鑒定數(shù)目等均比Trypsin單獨酶切高， 其中LysC100/tryp50組鑒定到的肽段數(shù)目、蛋白數(shù)目均最高。對順序酶切相比單獨酶切鑒定到的蛋白質和肽段提升的比例進行分析（圖2C和圖2D）， 發(fā)現(xiàn)LysC100/tryp50組提高的比例為11%～14%， LysC50/tryp50組其次， 提高了4%～7%。表明采用順序酶切能夠使蛋白質酶切消化更充分， 從而提高蛋白質和肽段的鑒定水平。此外， 研究結果還顯示， 鑒定到的獨有肽段數(shù)目也顯著增加， 在進行蛋白質定量分析時可以進一步提高定量分析結果的準確性。
對比順序酶切不同組實驗的結果（LysC50/tryp50組與LysC50/tryp100M， LysC100/tryp50組與LysC100/tryp100 組， 圖2C和圖2D）， 發(fā)現(xiàn)當增加第二步中使用的Trypsin量時， PSM數(shù)目、肽段鑒定數(shù)目、蛋白質鑒定數(shù)目等都有顯著提升， 說明在酶解過程中使用足量的Trypsin， 能進一步確保蛋白質的酶切程度， 對于提高蛋白鑒定水平具有顯著意義。但是， 對比LysC50/tryp100組與LysC100/tryp100組、 LysC50/tryp50組與LysC100/tryp50組的結果發(fā)現(xiàn)， 增加第一步LysC酶的用量并不能提高最終的樣本檢測水平， 肽段、蛋白質等的鑒定水而有所降低。推測是由于隨著第一步LysC酶的用量增加， 導致在第二步加入Trypsin進行酶切時， LysC酶仍然保留有較強的酶切活性， 造成在該環(huán)節(jié)中LysC酶對Trypsin酶發(fā)生了一定的酶切反應， 從而降低了第二步Trypsin的酶切效率及程度。以上實驗結果表明， 在進行順序酶切時， 第二步Trypsin酶切環(huán)節(jié)應該使用足量的酶， 以保證蛋白質被充分消化； 同時第一步加入LysC酶的量不宜過多， 避免其對Trypsin酶的切割， 導致樣本最終的酶解不徹底。
3.2z漏酶切位點數(shù)目及比例
通過統(tǒng)計了各組實驗結果中遺漏酶切的位點數(shù)目及比例， 進一步分析LysC/trypsin順序酶切比Trypsin單獨酶切能更有效提高鑒定肽段、蛋白質數(shù)目的原因。如圖3所示， 使用Trypsin單獨酶切時， 遺漏酶切位點的比例約為27%， 其中近80%為K遺漏酶切位點， 這與文獻[13]報道的結果相符。而進行LysC/trypsin順序酶切時， K位點遺漏酶切的比例顯著降低。推測這不僅是由于LysC酶對賴氨酸具有高特異性酶切的特性， 而且在8 mol/L尿素的強變性條件下， 蛋白處于充分伸展狀態(tài)， 使LysC酶能更加充分的對蛋白質進行酶切。因此， LysC酶和Trypsin酶進行順序酶切能顯著降低遺漏酶切位點數(shù)目和K位點遺漏酶切的比例， 從而提高質譜鑒定的重現(xiàn)性和定量分析的準確性。
3.3肽段長度分布
利用質譜進行蛋白質組學肽段樣本檢測時， 肽段過長或過短都不利于質譜檢測與鑒定。對各組實驗鑒定到的肽段長度進行統(tǒng)計分析的結果如圖4所示。LysC50/tryp50與LysC100/tryp50兩組鑒定到肽段的長度集中在7～21氨基酸殘基（aa）， 且此長度區(qū)間的肽段數(shù)目明顯高于其它3組， 而長度大于32 aa的肽段數(shù)目明顯低于其余3組。對比LysC50/tryp50組與LysC50/tryp100組、LysC100/tryp50組與LysC100/tryp100組發(fā)現(xiàn)， 當?shù)诙絋rypsin酶使用量少時， 樣本中鑒定到的肽段長度普遍較長， 統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)主要是由于產(chǎn)生的遺漏酶切肽段較多導致的， 這與上文中當Trypsin酶的用量減少時導致的遺漏酶切比例升高的現(xiàn)象一致。
3.4蛋白質序列覆蓋度
在蛋白質組學數(shù)據(jù)分析中， 蛋白質鑒定和定量的準確性與蛋白質序列的鑒定覆蓋度密切相關。分別統(tǒng)計了各實驗組中蛋白序列覆蓋度在20～30%、30～40%、>40%區(qū)間的蛋白數(shù)目， 結果見圖5。第二步Trypsin使用量較高的兩組（LysC50/tryp50組與LysC100/tryp50組）， 在以上蛋白質序列覆蓋度區(qū)間的蛋白數(shù)均最高， 說明順序酶切時第二步使用足量的Trypsin能夠增加蛋白質的序列覆蓋度， 進一步證明其使得蛋白質被酶切的更加完全。此外， 序列覆蓋度較高（>30%）的蛋白質中， LysC50/tryp50組的蛋白質數(shù)目均低于LysC100/tryp50組的數(shù)目， 提示第一步LysC酶的用量增大會導致第二步Trypsin效率的降低， 從而使得鑒定到的蛋白序列覆蓋度低。
4結 論
本研究從鑒定蛋白質數(shù)目、肽段數(shù)目、遺漏酶切位點數(shù)目與比例、肽段長度和蛋白質序列覆蓋度等方面， 對蛋白質組學樣品溶液消化中的順序酶切與單獨酶切方法進行比較。結果表明， 順序酶切能夠使蛋白質被酶切的更完全， 從而降低遺漏酶切位點數(shù)目， 得到的肽段長度有利于進行質譜鑒定， 肽段數(shù)目、蛋白質數(shù)目以及蛋白質序列覆蓋度均有所增加。順序酶切時， 所用的酶量對實驗結果有顯著影響， 第二步使用足量的Trypsin能夠更充分酶切蛋白質， 而第一步使用過量的LysC反而會影響到隨后Trypsin的酶切效果， 使得蛋白質的酶切程度不徹底。本研究結果為蛋白質組學研究提供了實驗基礎， 對于提高蛋白組學樣本檢測的效率和靈敏度， 以及蛋白質組學的定量分析準確性具有參考意義。
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篇3
【摘要】 目的研究大豆胰蛋白酶抑制劑提取物對四氧嘧啶糖尿病模型小鼠的治療效果。方法以市售大豆為材料，經(jīng)酸浸、脫脂、硫酸銨沉淀、透析除鹽、葡聚糖凝膠G-75柱純化等方法進行大豆胰蛋白酶抑制劑的分離提純。然后，用大豆胰蛋白酶抑制劑提取物對四氧嘧啶糖尿病模型小鼠灌胃給藥。通過比較正常對照組、實驗對照組、大豆抑蛋白酶抑制劑高中低劑量組的多項血液指標（血糖、總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇）及各組小鼠病理切片等，研究大豆胰蛋白酶抑制劑的降糖活性。結果給予大豆胰蛋白酶抑制劑灌胃的糖尿病小鼠其血糖水平明顯下降，甘油三酯水平下降，總膽固醇水平和高密度脂蛋白膽固醇水平無明顯變化。結論大豆胰蛋白酶抑制劑提取物對糖尿病有較顯著的療效。
【關鍵詞】 大豆 胰蛋白酶抑制劑 分離提純 糖尿病 小鼠胰蛋白酶
抑制劑（soybean trypsin inhibitor，SBTI）是一類可以抑制胰蛋白酶水解活性的小分子多肽，普遍存在于植物的儲藏器官，如種子、塊根和塊莖中［1］。大豆胰蛋白酶抑制劑已在多種醫(yī)藥領域有所應用［2，3］，另有報道大豆中微量胰蛋白酶抑制劑對于糖尿病治療，調節(jié)胰島素失調可能有一定效果［4］，但未見SBTI對糖尿病治療效果的專項研究，本文就大豆胰蛋白酶抑制劑對四氧嘧啶糖尿病模型小鼠的治療作用進行研究和探索。
1 材料與儀器
1.1 試劑與藥品市售大豆，牛胰蛋白酶(1∶250，上海維編科貿有限公司），BAPNA·HCl(Na-苯甲酰-DL-精氨酸對硝基苯胺鹽酸鹽，上海維編科貿有限公司)，Tris(三羥甲基氨基甲烷，成都化學試劑廠生產(chǎn))，Sephadex G-75（葡萄糖凝膠G-75，上海化學試劑廠生產(chǎn)），Alloxan（四氧嘧啶，sigma公司），葡萄糖試劑盒-GLU(氧化酶法，液體，北京北化康泰臨床試劑有限公司)，高密度脂蛋白膽固醇試劑盒（酶比色法，通用型，中生北控生物科技股份有限公司），甘油三酯試劑盒（酶比色法，通用型，中生北控生物科技股份有限公司），總膽固醇試劑盒（酶比色法，通用型，中生北控生物科技股份有限公司），肝素鈉（江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司），硫酸銨，正己烷，磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉，36%乙酸等均為國產(chǎn)分析純。
1.2 儀器DS-1高速組織搗碎機（上海標本模型廠），DF206電熱鼓風干燥機（北京醫(yī)療設備二廠），F(xiàn)A1004電子天平（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司），KDC-1042低速離心機（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司），722分光光度儀（上海精密科學儀器有限公司），電熱恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療器械五廠），AE240電子天平（METTLER公司）。
2 方法與結果
2.1 胰蛋白酶抑制劑的分離純化
2.1.1 大豆胰蛋白酶抑制劑（SBTI）粗提物的制備用酸抽提法所得粗品蛋白和抑制劑總量高［1］，故本實驗采用酸性水溶液浸泡大豆粉末提取大豆胰蛋白酶抑制劑［5，6］。
2.1.2 大豆胰蛋白酶抑制劑粗提物的透析除鹽將抑制劑粗制備物置于透析袋中蒸餾水充分透析7 d，除去鹽分。
2.1.3 凝膠柱的制備及抑制劑粗提物的純化［5，7］參考文獻［5，7］中方法，吸出存留緩沖液，加入1 ml樣品，用緩沖液進行洗脫，控制流速在2 ml·h-1。流出10 ml后，用干凈的試管分部收集，檢測每管抑制劑的活性。
2.1.4 大豆胰蛋白酶抑制劑的活性測定［5，7］參考文獻［7］中方法，以BAPNA為底物測定胰蛋白酶和胰蛋白酶抑制劑的活性。計算其抑制百分率［5］。收集具有抑制活性的洗脫液（即大豆胰蛋白酶抑制劑的提取物）。
2.2 大豆胰蛋白酶抑制劑提取物對小鼠血糖、甘油三酯、總膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇水平的影響
2.2.1 實驗性四氧嘧啶糖尿病動物模型的建立隨機選取10只小鼠作為正常對照組(Control)。除正常對照組外，其它小鼠禁食12 h后，腹腔注射四氧嘧啶250 mg·kg-1。72 h后尾尖取血，用葡萄糖氧化酶法測定注射四氧嘧啶小鼠的血糖，以血糖值大于11.1 mmol·L-1［8］的小鼠作為四氧嘧啶糖尿病模型小鼠。將糖尿病模型小鼠隨機分為實驗對照組(Alloxan) 、大豆胰蛋白酶抑制劑低劑量組(Alloxan+ SBTIL) 、大豆胰蛋白酶抑制劑中劑量組(Alloxan +SBTIM) 和大豆胰蛋白酶抑制劑高劑量組(Alloxan+SBTIH)。
2.2.2 分組給藥及測定方法Alloxan+SBTIL組、Alloxan+SBTIM組和Alloxan+ SBTIH組的定時給藥劑量分別為每只每天0.1，0.3 ml和0.5 ml。但為了消除不同給藥劑量對實驗結果的影響，需將Alloxan+SBTIL組和Alloxan+SBTIM組的藥液用蒸餾水稀釋，使得稀釋后藥液的給藥量為每只每天0.5 ml。Control組和Alloxan組給予等容量生理鹽水（0.5 ml）。連續(xù)7 d經(jīng)口灌胃給藥。末次給藥后次日分別測定各組小鼠的血糖、甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇4項血液指標（均采用試劑盒法，其具體操作過程見試劑盒內說明書）。完成測定后，處死小鼠，取腎臟和肝臟制作病理切片。
2.2.3 大豆胰蛋白酶抑制劑對糖尿病模型小鼠血糖水平的影響結果見表1。表1 對糖尿病模型小鼠血糖水平的影響由表1可見，造模72 h后，四氧嘧啶誘導的糖尿病模型小鼠的血糖水平均顯著高于正常對照組（P＜0.01），并且糖尿病模型小鼠狀態(tài)較為萎靡，表明糖尿病模型制造成功。對照實驗后的各給藥組和糖尿病模型小鼠的血糖水平可見大豆胰蛋白酶抑制劑對糖尿病的降糖作用：由Alloxan組、Alloxan+SBTIL組、Alloxan+SBTIM組到Alloxan+ SBTIH組小鼠的血糖水平有逐漸降低的趨勢，即血糖降低程度與給藥劑量正相關。其中Alloxan+SBTIM組、Alloxan+SBTIH組與Alloxan組相比有明顯降低（P＜0.01），尤以Alloxan+SBTIH組更為明顯。結果表明，大豆胰蛋白酶抑制劑對糖尿病小鼠的血糖有較明顯的降低作用。
2.2.4 SBTI對糖尿病模型小鼠TG，CHO和HDL-C的影響結果見表2。表2 SBTI對糖尿病模型小鼠TG，CHO和HDL-C指標的影響與Control組比較，aP＜0.01，cP＜0.05；與Alloxan組比較，bP＜0.01
本實驗中，SBTI給藥組的血清甘油三酯水平有所降低，其中大豆胰蛋白酶抑制劑高、中劑量給藥組小鼠的甘油三酯水平與四氧嘧啶糖尿病模型組之間存在統(tǒng)計學差異（P＜0.01），可認為給藥組小鼠血清甘油三酯水平明顯降低。另一方面，SBTI對總膽固醇有一定的降低作用，對高密度脂蛋白膽固醇有一定的升高作用，但其差異不存在統(tǒng)計學差異（P＞0.05），即影響不顯著。該實驗結果在一定程度上補充說明了SBTI對糖尿病具有較好療效。
2.2.5 SBTI對糖尿病模型小鼠腎臟和肝臟細胞的病理切片顯微鏡觀察結果比較觀察圖1～3，Control組小鼠腎臟細胞的組織切片中可見，其細胞形態(tài)為飽滿，結構清晰，與周圍細胞的界限較明顯，細胞排列相對整齊；腎小球形態(tài)正常；近曲小管、遠曲小管形狀較規(guī)則，均勻排列。Alloxan組切片的細胞形態(tài)萎縮變形，輪廓不飽滿，界限不清晰，細胞排列紊亂；腎小球固縮較明顯，腎小球囊壁增厚；腎小管萎縮；間質組織細胞增生明顯，有炎細胞浸潤。Alloxan+SBTIH組細胞形態(tài)、界限、排列狀況均較高血糖對照組有改善；腎小球固縮程度減輕；腎小管的形態(tài)、排列狀況及間質增生情況也有改善。腎組織切片顯示，大豆胰蛋白酶抑制劑對糖尿病模型小鼠的腎組織有一定的保護作用。
比較觀察圖4～6，Control組小鼠肝臟切片中可見，肝小葉結構完整，形態(tài)飽滿，界限清晰；肝板排列規(guī)則整齊，且較為緊密。Alloxan組切片肝臟細胞體積變??；胞質嗜酸性增強，細胞核染色較深；肝板排列較為疏松，且不整齊。高劑量給藥組小鼠的肝小葉結構明顯，肝板細胞體積增大，排列較整齊、規(guī)則。
3 討論
血糖是糖尿病的主要表征，臨床上以血糖值作為糖尿病的主要診斷依據(jù)。因此，血糖水平的降低程度可直接反映糖尿病的治療效果。通過分析各組小鼠血糖水平的實驗數(shù)據(jù)可得出，大豆胰蛋白酶抑制劑對糖尿病具有較好的治療作用。
四氧嘧啶糖尿病小鼠較正常小鼠的血清甘油三酯，膽固醇水平均有升高［9］。本實驗中，SBTI給藥組的血清甘油三酯水平有所降低，其中，SBTI高、中劑量給藥組小鼠的甘油三酯水平與Alloxan組之間存在統(tǒng)計學差異（P＜0.01）。另一方面，SBTI對總膽固醇有一定的降低作用，對高密度脂蛋白膽固醇有一定的升高作用，但其差異不存在統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。該實驗結果在一定程度上補充說明了SBTI對糖尿病具有較好療效。
由于糖尿病小鼠胰島素的缺乏會引起肝糖原合成減弱和分解過程加強加速，引起糖尿病的肝細胞體積減小，胞質嗜酸性增強，即肝細胞發(fā)生病變；糖尿病腎組織中腎小管的重吸收作用降低，大量葡萄糖由腎臟排出，病理性滲透性利尿，即腎細胞發(fā)生病變。而且，蛋白質、脂肪、水和電解質的代謝紊亂等也對肝腎細胞造成相應的損傷。因而，通過其腎、肝臟器質病變程度也可反映出治療糖尿病藥物的療效。腎、肝的病理切片反映，給藥組糖尿病小鼠的病情有一定程度的好轉。
從實驗數(shù)據(jù)中可觀察到，各大豆胰蛋白酶抑制劑給藥組的CHO，HDL-C水平與Control組及Alloxan組之間均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。因此，擬定在下一步研究中，通過四氧嘧啶和高糖高脂飼料誘導大鼠的高糖高脂糖尿病，研究大豆胰蛋白酶抑制劑對糖尿病模型各項血脂指標的影響，進一步探索大豆胰蛋白酶抑制劑對糖尿病的療效。
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篇4
關鍵詞：尿胰蛋白酶抑制劑（UTI）；肝癌細胞HepG2；增殖；遷移
Effects of urinary trypsin inhibitor （UTI） on the migration and invasion of HEPG2 hepatocellular carcinoma cells in vitro.
Yang Chaowen Luo Jiaxing Luo Weimin
Abstract：Objective： To investigate effects of urinary trypsin inhibitor （UTI） on the proliferation and migration of HepG2 hepatocellular carcinoma cells in vitro. Methods：Effects of UTI on HepG2 cells proliferation was evaluated by MTT assaya； Effect on HepG2 cells migration by UTI was evaluated by Transwell assay. Results：The UTI do not effect the proliferation of HEPG2 cells （P>0.05）. UTI suppress the migration of HepG2 cells dose-dependantly（P
Key words： Urinary trypsin inhibitor （UTI）； Liver hepatocellular carcinoma HepG2 cells； Proliferation； Migration
【中圖分類號】Q51 【文獻標識碼】A 【文章編號】1674-7526（2012）12-0128-02
UTI是從尿液中提取的一種Ⅱ型Kunitz第二結構域的蛋白多糖，對絲氨酸蛋白酶（胰蛋白酶）、透明質酸酶和纖溶酶等多種酶具有抑制作用[1]，屬于蛋白酶抑制劑，臨床上常用于急慢性胰腺炎的治療。然而近年國內外研究表明，UTI還能抑制多種腫瘤的轉移，如卵巢癌、結腸癌、惡性間皮細胞瘤等，但其對肝癌細胞生物學的影響文獻報道較少。目前認為抑制肝癌的轉移已成為進一步提高肝癌術后生存率和治愈率的難點，在腫瘤轉移過程中，腫瘤細胞的增殖和遷移能力尤為重要。因此，本研究通過體外細胞實驗研究UTI對HepG2細胞的增殖、遷移的影響，初步探索UTI用于肝癌細胞活性的影響，為下一步研究內在機制奠定基礎。
1 材料和方法
1.1 材料與試劑：人肝癌細胞株HEPG2由南華大學醫(yī)學院病理實驗室保存；UTI（批號021004042）購自廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司；胎牛血清購自Hyclone公司；高糖DMEM培養(yǎng)液購自美國Invitrogen公司；MTT、二甲基亞砜（DMSO）均購自Sigma公司； Matrigel膠購自美國BD公司；PT-PCR試劑盒購自碧云天公司；Transwell小室購自美國Corning公司，膜孔徑8μm；UPA多克隆單克隆抗體購自美國SantaCruz公司。
1.2 細胞培養(yǎng)與UTI配置：HepG2細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37℃及5%CO 的濕化培養(yǎng)箱中。4-5d傳代一次。UTI用培養(yǎng)液配成濃度為10000U/ml的儲存液，過濾除菌，-20℃保存，使用時稀釋至所需濃度。
1.3 細胞增殖實驗：取對數(shù)生長期的HepG2細胞按1×104個/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中。24h后，更換含不同濃度UTI的培養(yǎng)液（600、900、1500U/ml），每組設3個復孔；對照組為空白對照組。培養(yǎng)板繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72h，每天更換相應濃度UTI培養(yǎng)液，以保證濃度相對恒定。移除培養(yǎng)液后，每孔分別加入20μlMTT，37℃孵育4h。棄去MTT溶液后加入100μl二甲基亞砜，晃動10min。酶標儀測定490nm波長處每孔的吸光度（A）值。按公式計算增殖抑制率。增殖抑制率（%）=（對照組A值-處理組A值）/對照組A值×100%。實驗重復3次。
1.4 細胞遷移實驗：取對數(shù)生長期HepG2細胞，消化后制成含無血清DMEM培養(yǎng)基的細胞懸液，調整細胞濃度為1×10 5/ml。在Transwell的上室中加入每孔150μl的細胞，加入含不同濃度UTI的培養(yǎng)液（600、900、1500U/ml），每組設3個復孔，對照組為空白對照組。在對應Transwell下室中加入600μl含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12h后取出Transwell小室，PBS輕輕沖洗2次，用棉簽小心擦凈小室底部微孔濾膜上層的細胞，然后將小室置于4%甲醇中固定10min，取出小室后結晶紫染色10min，PBS沖洗2次，于顯微鏡下觀察濾膜下層的細胞。計算方法為200倍光學顯微鏡下隨機計數(shù)5個視野的細胞，取平均值。
1.5 圖像處理：利用HPIAS21000高清晰度彩色病理圖像分析系統(tǒng)（南華大學醫(yī)學院醫(yī)研中心）分析細胞遷移圖片，200倍光鏡下隨機選擇5個視野拍照計數(shù)。
1.6 統(tǒng)計學處理：統(tǒng)計軟件為SPSS 13.0。One Way-ANOVA方差分析比較多組間的差異，兩組間則利用t檢驗；P
2 結果
2.1 UTI對HepG2細胞增殖無影響：試驗結果顯示，不同濃度UTI處理組分別在24、48、72小時的時間段，對HepG2細胞增殖的影響，與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05，表1）。
表1 UTI對SK-HEP-1細胞增殖的影響（A490，）
注：對照組與各實驗組比較，P>0.05
2.2 UTI顯著抑制HepG2細胞遷移：HepG2細胞經(jīng)過UTI處理12h后行transwell遷移試驗，與對照組（403.17±27.05）個相比，600U/ml組穿過濾膜的細胞數(shù)為（298.83±20.9）個，900U/ml組為（153.5±18.9）個，1500U/ml組為（127±15.17）個。結果表明，與對照組相比，UTI各劑量組均能顯著抑制HEPG2細胞的遷移且呈劑量效應關系，差異有統(tǒng)計學意義（P
3 討論
原發(fā)性肝癌是世界最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率逐年上升，其對放化療不敏感，病人5年生存率較低。目前臨床上對于肝癌的切除率己有很大提高，但術后5年轉移復發(fā)率仍然高達60%以上，因此，轉移復發(fā)是影響肝癌遠期療效的主要原因。
UTI是從人體尿液中提取的一種Ⅱ型Kunitz第二結構域的蛋白多糖，是一種對酸對熱較穩(wěn)定的絲氨酸蛋白酶抑制物，具有抑制糖、多種蛋白酶和脂類水解酶的活性，穩(wěn)定溶酶體酶，抑制炎性細胞因子的過度釋放，防止缺血-再灌注損傷的作用。近年來，國外學者研究發(fā)現(xiàn)，UTI可抑制腫瘤的侵襲和轉移[2，3，4]，但其對肝癌細胞的影響文獻報道較少。本研究通過細胞遷移實驗，證實UTI能在體外明顯降低肝癌細胞的遷移能力，而對肝癌細胞的增殖無影響，這與在其他腫瘤中的發(fā)現(xiàn)是相符的[3，4]。過去認為腫瘤細胞表面存在UTI（UTI receptor，UTIR）受體，UTI與UTIR結合，改變細胞表面的環(huán)境、調節(jié)血漿酶的活性來抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移。后來進一步的研究發(fā)現(xiàn)，UTI不能抑制腫瘤細胞的增殖，其抑制腫瘤的侵襲和轉移也不是與UTI受體結合產(chǎn)生的結果，而可能是通過抑制與腫瘤細胞表面受體相關的纖溶酶系統(tǒng)而發(fā)揮作用。Kobayashi等[9]對卵巢癌的研究中發(fā)現(xiàn)UTI的N-末端是UTI與腫瘤細胞結合的位點，其C-末端則是抑制腫瘤轉移的部位。然而，UTI抑制腫瘤細胞遷徙和轉移的機制及UTI作用的靶點卻仍不明確。
綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)UTI能在體外顯著抑制人肝癌細胞HEPG2的遷移能力，推測UTI對其UPA的mRNA及蛋白質表達抑制可能是其潛在機制。到目前為止，國內尚未見關于UTI抑制肝癌腫瘤侵襲和轉移機制研究的報導，在體外實驗中證實了UTI對肝癌細胞遷移能力的抑制作用。本研究為針對肝癌轉移的治療提供了新的思路，為下一步研究UTI影響肝癌細胞轉移的內在機制奠定了實驗基礎。
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篇5
【摘要】
目的：應用新型工藝制備阿霉素人血白蛋白微球(ADRHASMS)，并優(yōu)化其最佳制備工藝。方法：以阿霉素(ADR)、人血白蛋白(HAS)為材料，采用超聲霧化化學交聯(lián)技術制備ADRHASMS；并應用正交設計法確定其制備工藝。結果：所得微球光學顯微鏡觀測呈球型，圓整，粒徑分布范圍為2～5 μm，平均粒徑為2.165 μm，載藥量、包封率分別為(3.174±0.137)，(75.11±3.127)。結論：本法工藝可實現(xiàn)連續(xù)地、批量化生產(chǎn)，既能滿足工業(yè)化生產(chǎn)要求，又可保證產(chǎn)品批量間的穩(wěn)定性，具有良好應用前景。
【關鍵詞】 阿霉素人血白蛋白微球 制備工藝 正交設計
白蛋白微球(albumin microsphere)是由人或動物的白蛋白制成的粒徑為微米級的球狀物［1］。早期的白蛋白微球研究主要集中在放射醫(yī)學領域，用于檢查肺循環(huán)異常［2］。后來人們發(fā)現(xiàn)白蛋白微球不僅可生物降解，無毒性和抗原性，而且對親水性藥物有較高的負載能力，很適合用作藥物載體，于是將其應用于藥物制劑尤其是抗癌藥物制劑的研究中［34］。本實驗利用“白蛋白微球制備儀”，采用超聲霧化化學交聯(lián)劑法制備肝靶向制劑ADRHASMS，可通過控制粒徑實現(xiàn)靶向性。以粒徑及其分布、載藥量、包封率等為考察指標， 在單因素考察的基礎上，對影響ADRHASMS制備的各個因素采用正交設計多指標綜合評價法對微球的制備工藝進行優(yōu)化篩選，從而確定了其最佳處方工藝。
1 實驗材料
1.1 試劑 20%人血白蛋白(哈爾濱世亨生物工程藥業(yè)股份有限公司)；注射用鹽酸多柔比星(ADR)(浙江海正藥業(yè)股份有限公司);25%戊二醛(天津市光復精細化工研究所，分析純)；氫氧化鈉(北京化工廠)；磷酸二氫鉀(汕頭市西隴化工廠)；胰蛋白酶(1∶250，寶泰克)；十二烷基硫酸鈉(北京鼎國生物技術有限責任公司)；冰醋酸(北京化工廠，分析純)；色譜甲醇、色譜乙腈；其他試劑均為分析純。
1.2 儀器 501型超級恒溫器(上海實驗儀器廠有限公司);JR051型及JR031型超聲波投入式霧化器(北京東方金榮超聲電器有限公司)；HH1數(shù)顯恒溫水浴鍋、852恒溫定時磁力攪拌器(江蘇省金壇市江南儀器廠)；A3S水流抽氣機(上海愛朗儀器有限公司)；XSPBM生物顯微鏡(上海彼愛姆光學儀器制造有限公司)；LS13320MW激光粒度分析儀(BeckmanCoulter)；KQ100B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；TL5.0臺式離心機(上海市離心機械研究所)；Waters 2487600高效液相色譜儀。
2 實驗方法
2.1 ADRHASMS制備 超聲霧化法是一種制備ADRHASMS的新方法，在超級恒溫器中加入丙酮溶媒，在50 W的超聲霧化器中加入與阿霉素為一定質量比的某一濃度的白蛋白水溶液，超聲霧化后，采用在1 500轉磁力攪拌器下緩慢滴加一定濃度的戊二醛交聯(lián)劑，固化攪拌60 min后，用蒸餾水反復離心洗滌，即得紅色阿霉素白蛋白微球。
2.2 微球性質考察
2.2.1 形態(tài)、粒徑及分布測定 光學顯微鏡下觀察所制微球色澤、形態(tài)、圓整度、表面等；用激光粒度分析儀測定微球粒徑大小及粒徑分布。
2.2.2 濃度測定 利用計數(shù)板，采用白細胞計數(shù)法測定微球濃度。
2.2.3 載藥量測定
2.2.3.1 標準曲線的繪制 精密稱取干燥至恒重的阿霉素標準品適量，用流動相作溶劑，制成濃度為1 mg/mL的標準貯備液。將其制成濃度為20、40、60、80、100、120 μg/mL的標準品溶液。采用高效液相色譜法，在254 nm處測定峰面積(A)，與濃度(C)做線性回歸。
2.2.3.2 測定方法 酶解法降解ADRHASMS溶液，取阿霉素白蛋白微球混懸液加入酶解介質(內含0.1%胰蛋白酶的pH 7.4磷酸鹽緩沖液)，于37℃恒溫水浴中溫育，經(jīng)裸眼觀察混懸液完全轉變?yōu)橥该魅芤?，由顯微鏡驗證所有微球完全消失，降解液過濾，取40 μL進樣，記錄高效液相色譜儀測得的峰面積，帶入回歸方程得到阿霉素濃度。載藥量(%)=測得微球中藥物重量/微球重量×100%［6］。
2.2.4 包封率測定 處理同2.2.3.2項下操作，測定微球中和丙酮溶劑介質中的藥物含量［6］。
2.2.5 正交設計篩選最佳處方工藝 根據(jù)單因素考察結果(數(shù)據(jù)略)得出，化學固化劑戊二醛濃度(Glutaral)(A)、攪拌速率(Stir Rate簡化為S.R)(B)、阿霉素與白蛋白質量比(ADR:HSA)(C)及白蛋白濃度(HSA/%)(D)是影響ADRHASMS主要因素，按L9(34)進行正交設計，以粒徑(R1)、載藥量(R2)、包封率(R3)為考察指標，進一步篩選制備ADRHASMS最優(yōu)工藝［7］。
2.3 數(shù)據(jù)分析 用SPSS10.0進行綜合評分。
3 結果
3.1 微球形態(tài)、粒徑及分布結果 40倍光學顯微鏡下觀察，微球均勻圓整，表面較光滑，分散性好；用激光粒度分析儀測定微球粒徑分布范圍為2～5 μm，平均粒徑為2.165 μm，95%的微球粒徑落在5 μm內。
3.2 微球濃度測定結果 3個批次微球數(shù)目，計算得微球濃度為(1.2～1.5)×1015個/L，即(1.2～1.5)×1012個/mL(n=3)。
3.3 載藥量測定結果
3.3.1 ADR線性回歸方程 根據(jù)實驗數(shù)據(jù)及線性回歸，得到CA標準回歸方程為C=25318A-3030.3(R2=0.9999，r=0.9999)，結果表明在20～120 μg/mL 范圍內濃度與吸收度線性關系良好。
3.3.2 ADR回收率、精密度 經(jīng)方法學考察，高、中、低3個濃度的平均回收率為99.57%，日內變異、日間變異系數(shù)均小于1%。
3.4 正交設計結果
3.4.1 正交設計因素水平表 見表1。
表1 正交設計因素水平表（略）
3.4.2 正交試驗結果 見表2。
表2 正交試驗結果（略）
3.5 Z值綜合評價法分析結果 對實驗結果進行直觀分析，極差分析，確定影響因素的大小順序是:C>D>B>A；最優(yōu)處方：白蛋白濃度為5%，與阿霉素質量比為12.5∶1；化學交聯(lián)劑戊二醛的濃度為0.25%，攪拌速率為1 500轉。
4 小結
在微球的制備中，需要同時考察微球的粒徑、載藥量、包封率及外形等指標，以往的文獻報道多是針對其中一個指標進行考察，往往單靠一個指標不能優(yōu)選出兼顧多者的最佳工藝，本實驗采用多指標綜合評分法，不僅得到阿霉素白蛋白微球的最佳工藝，同時為其可能的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。
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篇6
[關鍵詞] 磷酸酶張力蛋白樣同源物；腫瘤抑制因子；細胞增殖；蛋白印跡法；選擇性剪接體
[中圖分類號] R73 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2016）09-0001-04
[Abstract] Objective To identify a new phosphatase and tensin homolog（PTEN） subtype and explore its potential role in tumor suppression. Methods Western blotting， immunoprecipitation were used to detect the expression of PTEN subtype（upper PTEN，UPP） and PTEN in different cell lines. PTEN， UPP and mock-vehicle were transfected to HepG2 and PC3 cell lines， then tested PTEN and UPP's effection on tumor suppression by cell proliferation bioassay. Results The expression of UPP closely depended on the existence of PTEN. UPP was not a post-translational modification product by PTEN， rather than its alternative splicing variant. Compared to cells transfected with empty vector alone， HepG2 and PC3 cells transfected with UPP or PTEN inhibited cell proliferation， and there was statistical significance（P
[Key words] Phosphatase and tensin homolog； Tumor suppressor； Cell proliferation； Western blot；Alternative splicing variant
磷酸酶張力蛋白樣同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）又被稱為多種晚期癌突變基因（mutated in multiple advanced cancers，MMAC1），是繼p53之后又一個重要的腫瘤抑制因子[1-4]。我們通常所指的PTEN是一個含403個氨基酸的蛋白質，具有蛋白磷酸酶和脂質磷酸酶活性[5，6]。自從1997年PTEN被作為腫瘤抑制因子提出以來，人們發(fā)現(xiàn)在多種人類腫瘤中存在PTEN的缺失或突變[1-4，7]。目前針對PTEN的癌癥治療和其他疾病的治療抱有很高期望。
我們和其他實驗室發(fā)現(xiàn)在各種不同的組織和細胞中存在一個比PTEN大約大15kDa的同源蛋白[8，9]。此蛋白的存在嚴格依賴于PTEN的表達，且表達豐度和PTEN成正比，我們命其名為UPP（upper PTEN）。研究PTEN基因5'-UTR全序列發(fā)現(xiàn)在第513位核糖核苷酸存在一個非常規(guī)翻譯起始位點CTG，且UPP在N端比PTEN多173氨基酸[8-10]。本實驗擬鑒定UPP與PTEN關系，以及UPP潛在腫瘤抑制作用。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及細胞株
DMEM高糖細胞培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶、雙抗（100 U/mL青霉素，100U/mL鏈霉素）均購自美國Gibico公司；Anti-Human PTEN（clone 6H2.1）抗體購自美國CASCADE生物公司；α-Actin羊單克隆抗體、GAPDH小鼠單克隆抗體、兔抗人IgG、猴抗羊IgG及羊抗鼠IgG二抗均購自美國Santa Cruz公司；Lipofectamine 2000 轉染試劑盒購自美國Invitrogen公司。A431、Cos-1、LNCaP、NIH3T3、PC3、293T、U2OS、HCT116、MDA-468、HepG2細胞株均購自上海中科院細胞庫。MEF（PTEN+/+）、MEF（PTEN-/-）細胞株以及pcDNA3.1-PTEN、pcDNA3.1-UPP、空載體質粒由美國紐約斯隆癌癥中心贈送。
1.2 細胞培養(yǎng)及轉染
A431、Cos-1、LNCaP、PC3、293T、U2OS、HCT116、NIH3T3、MDA-468、HepG2、MEF（PTEN+/+）、MEF（PTEN-/-）細胞株用含10%FBS，雙抗（100 U/mL青霉素，100 U/mL鏈霉素）的高糖 DM EM培養(yǎng)基，在37℃、CO2體積分數(shù)為5%及飽和濕度條件下培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。2×105細胞/3 mL接種于100 mm培養(yǎng)皿中，等其貼壁長到全皿的80%～90%時收蛋白。
按照Lipofectamine 2000轉染試劑盒說明書將UPP、PTEN質粒和空載體分別轉染進入HepG2細胞。轉染前1 d，細胞鋪板于100 mm培養(yǎng)皿中，使其轉染日密度為90%。轉染試劑用Opti-MEM無血清培養(yǎng)基稀釋，細胞也用Opti-MEM無血清培養(yǎng)基孵育。轉染6 h后，轉染培養(yǎng)基換成完全培養(yǎng)基包含10%FBS和抗生素。細胞轉染48 h后，提取蛋白。
1.3 蛋白印跡法（Western blot）檢測
收集對數(shù)生長期的各細胞株，分別用含蛋白酶抑制劑的RIPA細胞裂解液裂解，提取蛋白并定量。取50 μg總蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜后以5%脫脂牛奶封閉30 min，在1∶1000濃度的Anti-Human PTEN （clone 6H2.1） 抗體及1∶400濃度 α-Actin、GAPDH抗體中室溫孵育2 h，TBST洗滌3次以后，1∶2000濃度的兔抗人IgG以及1∶1000猴抗羊IgG、羊抗鼠IgG二抗室溫孵育1.5 h，TBST洗滌3次，通過加入BeyoECL Plus顯色液于凝膠成像儀器曝光。
1.4 免疫共沉淀（Immunoprecipitation）檢測
收集對數(shù)生長期的細胞株，同上述細胞裂解后，加入3 μg PTEN抗體，4℃孵育過夜。將預處理的20 μL protein A 瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過夜的細胞裂解液中，4℃孵育2 h。免疫沉淀反應后，瓊脂糖珠用裂解液清洗3次，PBS清洗1次，SDS-PAGE分離，western blot分析。
1.5 細胞增殖檢測
UPP、PTEN和空載體轉染 HepG2、PC3細胞，G418篩選數(shù)周后獲得穩(wěn)定表達細胞。將2×105個穩(wěn)定表達細胞種在細胞培養(yǎng)皿中，每種表達細胞各種15個培養(yǎng)皿。從第2天開始每天取3個培養(yǎng)皿用胰蛋白酶消化收集細胞、計數(shù)取平均值，連續(xù)5 d。所得平均值以天為橫坐標制作生長曲線，通過比較各種相應質粒轉染的細胞生長曲線判斷UPP、PTEN對細胞生長的影響。
1.6 統(tǒng)計學方法
采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P
2 結果
2.1 UPP是一種緊密依賴于PTEN而存在的蛋白
利用PTEN特異性抗體并借助免疫共沉淀和蛋白免疫印跡法，結果顯示在A431、Cos-1、NIH3T3、293T、U2OS、HCT116、MEF（PTEN+/+）細胞中存在一個比PTEN約大15kDa的同源蛋白，此蛋白的存在嚴格依賴于PTEN的表達，且表達豐度和PTEN成正比。其中U2OS細胞存在UPP蛋白，但是表達量低。而LNCaP、PC3、MEF（PTEN-/-）細胞中UPP和PTEN均不表達（圖1）。
2.2 UPP不是PTEN蛋白翻譯后修飾產(chǎn)物
根據(jù)UPP分子量的大小，我們猜測了幾種可能的翻譯后修飾，如單泛素化、SUMO修飾、Nedd8修飾、ISG15修飾，并加以驗證。在293T細胞中應用免疫沉淀法結果顯示UPP不表達，提示UPP不是PTEN基因翻譯后修飾產(chǎn)物（圖2）。
2.3 UPP可能是PTEN蛋白選擇性剪接產(chǎn)物
為了進一步確認UPP與PTEN的關系，我們轉染C-末端HA-，和N-末端 GFP-的PTEN cDNA于COS-1細胞，使COS-1細胞過度表達PTEN，western blot結果顯示PTEN表達量增多，但是不能檢測到UPP（圖3）。
0.1 μg/mL多西環(huán)素誘導PTEN缺失的MDA-468細胞，使其PTEN過表達，western blot結果顯示，PTEN隨著誘導時間表達量增多，但是仍無法檢測到UPP表達（圖4），以上結果說明UPP很可能是PTEN基因選擇性剪接產(chǎn)物。
2.4 UPP可抑制癌細胞的生長
UPP、PTEN和空載體轉染 HepG2細胞，檢測細胞增殖數(shù)。結果顯示，轉染后第1天，UPP、PTEN、空載體組細胞增殖數(shù)分別為（2.97±0.36）×105、（3.03±0.31）×105、（2.97±0.12）×105，各組間差異無統(tǒng)計學意義（F=0.17，P=0.85）。轉染后第2天，UPP、PTEN、空載體組細胞增殖數(shù)分別為（4.03±0.57）×105、（4.27±0.68）×105、（6.33±1.03）×105，各組間差異有統(tǒng)計學意義（F=7.84，P=0.02）；轉染后第3天，UPP、PTEN、空載體組細胞增殖數(shù)分別為（7.23±0.96）×105、（6.57±0.68）×105、（11.03±1.80）×105，各組間差異有統(tǒng)計學意義（F=11.29，P=0.01）；轉染后第4天，UPP、PTEN、空載體組細胞增殖數(shù)分別為（12.07±1.77）×105、（11.27±1.68）×105、（18.07±2.52）×105，各組間差異有統(tǒng)計學意義（F=10.13，P=0.01）（圖5）。
UPP、PTEN和空載體轉染PC3細胞，檢測細胞增殖數(shù)，結果顯示，轉染后第1天，UPP、PTEN、空載體組細胞增殖數(shù)分別為（2.99±0.30）×105、（2.75±0.42）×105、（4.18±0.67）×105，各組間差異有統(tǒng)計學意義（F=7.52，P=0.02）。轉染后第2天，UPP、PTEN、空載體組細胞增殖數(shù)分別為（3.97±0.60）×105、（4.11±0.66）×105、（6.53±0.55）×105，各組間差異有統(tǒng)計學意義（F=17.06，P
3 討論
PTEN作為繼p53之后又一個重要的腫瘤抑制因子，學者針對其癌癥治療和其他疾病的治療抱有很高期望。在針對PTEN的抗癌藥物開發(fā)過程中，PTEN的調控是國內外研究的一個熱點。已知的PTEN調控方式包括氧化、乙?；?、磷酸化、泛素化等[11-14]。其中磷酸化被研究得最多。普遍存在的蛋白激酶CK2能磷酸化PTEN蛋白的C端Ser/Thr殘基[15]。PTEN去磷酸化后，其羥基端C2結構域外露，有助于PTEN實現(xiàn)膜轉移，進而發(fā)揮其脂質磷酸酶的功能，抑制PI3K-AKT信號通路[16-18]。去磷酸化后的PTEN相對不穩(wěn)定，在執(zhí)行完功能后通常通過泛素-蛋白酶體途徑被降解掉，但是CK2磷酸化的對象廣泛，雖然通過抑制CK2能夠激活PTEN，但因為其他CK2底物也受影響，副作用大[19]。
PTEN另一個被重點研究的翻譯后修飾是泛素化，泛素化后的PTEN經(jīng)由蛋白酶體降解[20，21]。臨床顯示很多癌癥樣本中的PTEN泛素化酶水平偏高，說明泛素化介導的PTEN降解可能是癌癥發(fā)生的一個重要原因[20-22]。有趣的是，PTEN泛素化不僅導致它的降解。除了常見的多泛素化修飾PTEN還可被單泛素化修飾。Pier Paolo Pandolfi 實驗室報道PTEN的單泛素化幫助PTEN實現(xiàn)細胞核轉運[22]。臨床上，從Cowden syndrome患者中發(fā)現(xiàn)的PTEN突變體K13E和K289E（兩個重要的泛素化位點）雖然保留完整的脂質磷酸酶活性，卻因為不能被單泛素化，無法轉運入核行使抑癌功能[23]。這種單泛素化和多泛素化的矛盾給以PTEN泛素化酶為靶點開發(fā)癌癥新藥物帶來困惑。
利用多種PTEN特異性抗體并借助蛋白免疫印跡法，我們研究顯示在各種不同的組織和細胞中存在一個比PTEN大約大15kDa的同源蛋白――UPP。根據(jù)UPP分子量的大小，我們猜測了幾種可能的翻譯后修飾，如單泛素化、SUMO修飾、Nedd8修飾、ISG15修飾，并加以驗證。這幾種可能都被一一排除。用PTEN的cDNA轉染細胞瞬間表達或在PTEN缺失細胞中長時間誘導PTEN的表達不能產(chǎn)生UPP，說明UPP很可能是PTEN基因轉錄選擇性剪接產(chǎn)生的同源蛋白。
Hopkins等[9]是最早報道關于PTEN的亞基，他們將其命名為PTEN-Long，其具有膜脂質磷酸酶滲透性，由細胞分泌，并能進入其他細胞[9]。PTEN-Long的變異翻譯起始于上游519bp位點的CUG，N端比PTEN多173個氨基酸，與我們實驗室發(fā)現(xiàn)的UPP一樣。研究顯示PTEN-Long與PTEN一樣可以通過調控PI3K-AKT途徑誘導腫瘤細胞凋亡。之后Liang等[24]又發(fā)現(xiàn)一個PTEN亞基，命名為PTENα，其位于線粒體，與PTEN一起調控線粒體能量代謝。PTENα也是另一種翻譯剪接體，但是其翻譯也起源于上游一個非常規(guī)翻譯密碼CUG，其N段比PTEN多了一個173氨基酸（人類）或者169個氨基酸（小家鼠類）。但是PTEN-Long和PTENα調控的是兩個不同的生物學途徑，故他們可能是兩個不同的PTEN亞基。
轉染UPP于HepG2肝癌細胞可抑制其增殖，說明UPP抑制癌細胞生長。通常認為通過腺病毒將PTEN的cDNA重新引入有PTEN基因缺陷的患者體內，可以抑制因PI3K-AKT通路過于活躍導致的癌癥[25]。但是，越來越多的臨床報道顯示腺病毒介導的基因治療存在安全隱患，接受基因治療的患者并沒有像所期望的那樣從癌癥中康復，有相當一部分患者出現(xiàn)了由腺病毒導致的各類副作用包括新的癌癥。新發(fā)現(xiàn)的UPP蛋白可能可以規(guī)避以PTEN基因治療帶來的副作用，為針對UPP設計治療癌癥和其他PTEN相關疾病的新方法提供依據(jù)。
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篇7
【關鍵詞】益氣活血方；心肌細胞；蛋白激酶C；缺血缺氧
文章編號：1009-5519（2007）18-2689-02 中圖分類號：R26 文獻標識碼：A
益氣活血方是中藥黃芪、川芎、黃精、赤芍、紅花、三七等藥物組成的中藥復方，在防治缺血性心腦血管疾病有較好的療效。它能夠降低血中脂質過氧化物形成，改善缺血后血流灌注，降低血液黏滯度，調節(jié)環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）和環(huán)磷酸腺苷（cAMP）的動態(tài)平衡，促進血管新生[1，2]。但益氣活血方如何在細胞水平上發(fā)揮其作用尚不清楚。近來的研究表明PKC在心血管的舒縮功能有重要的作用，本實驗旨在通過體外培養(yǎng)的大鼠心肌細胞缺氧缺血模型，觀察益氣活血方對心肌細胞缺血缺氧條件下PKC活性的影響，以探討益氣活血方治療缺血性心腦血管疾病的機制。
1 材料與方法
1.1 大鼠心肌細胞的培養(yǎng)：出生2~4日齡的大鼠幼鼠，75%酒精消毒皮膚。無菌操作取出心臟，用D-Hanks液或無血清培養(yǎng)基洗去血液。去外膜后用眼科剪將其剪碎。然后加入0.06%胰蛋白酶, 35~37℃消化10分鐘，棄上清液。再加0.06%胰蛋白酶消化2~3次，每次10分鐘。收集每次消化后的上清液，加血清終止消化。最后1 000 r/min，離心5分鐘，細胞沉淀用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基懸浮， 以5×105/ml接種到培養(yǎng)瓶中。 置5%CO2 37℃ 細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～ 2小時后再輕輕吸出細胞上清, 接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。隔天換液，待細胞快融合時進行實驗[3,4]。
1.2 益氣活血方含藥血清的制備：將益氣活血方復方制成水煎液，濃縮成每ml含1.25 g生藥，4℃保存于冰箱中。取清潔級SD成年大鼠，體重180~220 g，雌雄不拘，隨機分成兩組，一組為灌服益氣活血方組，一組為灌服生理鹽水對照組。益氣活血方的灌服劑量按成人與大鼠的體表面積換算成大鼠的用藥劑量，每日灌服2次，每次2 ml，連續(xù)灌服7天，末次灌服1小時后經(jīng)腹主動脈無菌取血，離心后得大鼠含藥血清，過濾除菌后-20℃保存。生理鹽水對照組的灌服和取血方法同益氣活血方灌服組[5]。
1.3 心肌細胞缺血缺氧模型的復制：用自制的有機玻璃小盒，充入95%N2＋5%CO2，同時在培養(yǎng)瓶中加入低糖的培養(yǎng)基，作用4小時制成缺血缺氧模型[6]。
1.4 PKC的提取和測量：取原代心肌細胞，在冰上收集細胞，然后用低滲緩沖液孵育15分鐘，超聲粉碎儀粉碎細胞。4 ℃下18 000 r/min，1小時，上清液為細胞漿PKC的提取物。沉淀加入0.5% Triton X-100的緩沖液，同樣在冰凍狀態(tài)下孵育30分鐘，4℃,10 000 r/m，10分鐘，所得上清液為胞膜PKC的提取物，將所得的提取物通過層析柱DE-52過濾，然后收集通過紫外分析儀波峰時的洗脫液，即為比較純的PKC提取物。
將提取的PKC加入到含有組蛋白、磷脂酰絲胺酸和γ-32P ATP的緩沖液中，置于30℃溫浴30分鐘，然后用γ-閃爍計數(shù)儀檢測放射性，通過放射性計算PKC的活性。PKC的活性單位以fmol/mg?min-1計算。
1.5 實驗分組：實驗分為正常組（不做任何處理8小時后收集細胞測定PKC活性），治療組（缺血缺氧4小時后加含藥血清作用4小時再收集細胞，含藥血清終濃度為20%），對照組（缺血缺氧4小時后加等量的生理鹽水灌服組的大鼠血清，血清終濃度同治療組，4小時后再收集細胞），每組重復3次。
1.6 統(tǒng)計方法：應用SPSS10.0電腦統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標準差（x±s）表示，用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，P
2 結果(見表1)
胞漿PKC假治療組與正常組相比，P
3 討論
PKC是一類Ca2+、磷脂依賴性的蛋白激酶，在跨膜信號傳遞過程中起著重要作用。PKC通過催化多種蛋白質上Ser/Thr磷酸化，調節(jié)多種細胞的代謝、生長、增殖和分化。
PKC廣泛分布于多種組織、器官和細胞， 靜止細胞中PKC主要存在于胞漿中，當細胞受到刺激后，PKC以Ca2+依賴的形式從胞漿中移位到細胞膜上， 此過程稱之為轉位。一般將PKC的轉位作為PKC激活的標志。
心肌細胞對于缺血缺氧等損傷較敏感，在體實驗研究顯示，心肌短暫缺血缺氧后，可引起心肌收縮力明顯降低、心律失常和心肌頓抑等明顯改變，其機理可能與心肌細胞鈣超載、氧自由基大量產(chǎn)生等有關。而PKC在心肌缺血及缺血預處理中作用已日益引起重視。研究認為PKC在缺血缺氧中可能起到保護作用[7]。缺血缺氧過程中，PKC和ATP敏感K＋通道（K＋ATP）、腺苷受體、α-腎上腺素能受體、緩激肽、Ca2+以及Na+/H+交換蛋白等多種因素相互作用以調節(jié)心肌細胞的功能。PKC參與了K＋ATP通道的激活，K＋ATP的激活可以縮短動作電位時程和減少Ca2+的內流，從而發(fā)揮保護作用[8，9]。缺血缺氧過程中，細胞漿內Ca2+濃度升高以至鈣超載是導致心肌細胞受損的主要和不可逆的因素。
PKC的激活可以減少心肌細胞對Ca2+攝取并降低游離鈣的濃度，降低肌鈣蛋白復合體對Ca2+的親合力，從而抑制Ca2+濃度過高引起的心肌強直收縮；另外，PKC還可促使肌漿網(wǎng)磷酸化，鈣泵活性增強，肌漿網(wǎng)攝取鈣能力加強，有助于收縮心臟的快速舒張，保護心肌細胞功能。腺苷受體、緩激肽和α－腎上腺素能受體激活可以協(xié)同刺激PLC，PLC可以水解胞膜上的磷脂產(chǎn)生DAG，從而激活PKC，使其發(fā)揮保護作用。PKC還可以調節(jié)Na+/H +交換，Na+/H+交換對細胞內的pH值有重要的調節(jié)作用，細胞在缺血缺氧時酸化是一個重要的損害原因。PKC可以調節(jié)空泡質子ATP酶，抑制細胞酸化，從而發(fā)揮保護作用。在這些因素中，Ca2+和腺苷受體是PKC激活后從胞漿向胞膜轉位的重要物質，若這種物質的濃度減低或者活化受阻，則PKC的轉位也將發(fā)生障礙，但其具體的機制還不清楚。
在本實驗中，益氣活血方血清使正常的心肌細胞胞漿PKC的活性下降，而胞膜PKC的活性升高，表明益氣活血方血清可能激活了PKC，促使其從胞漿轉位到胞膜，但總的活性并沒有明顯變化，提示這可能只是一種低水平的激活和轉位，這種激活作用可能調節(jié)了心肌細胞內［Ca2+］i，使其穩(wěn)定在正常的水平，保護心肌細胞的功能。在缺血缺氧時，PKC的活性下降，而且沒有發(fā)生胞漿向胞膜的轉位，這可能是缺血缺氧導致了PKC活性下降，而且轉位也發(fā)生了障礙，從而使PKC不能發(fā)生保護作用，導致心肌細胞受損。經(jīng)益氣活血方血清作用后，胞漿胞膜PKC活性顯著恢復，而治療對照組沒有太大變化。由此我們認為，益氣活血方血清可能是通過影響PKC的活性，從而發(fā)揮對心肌細胞保護作用，進而增強心肌的收縮和舒張功能，出現(xiàn)比多巴胺等藥物還好的強心作用[10]。PKC也可能與其它信號通路相互作用來調節(jié)心肌細胞的功能，如絲裂原活化蛋白激酶通路[11]，或者cAMP通路[8]，但這些信號通路之間相互作用的機制不清。
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篇8
【關鍵詞】 Eppin； ； 男性； 不育癥； 避孕； 無癥
進入21世紀，人們逐漸發(fā)現(xiàn)人類的繁衍生育能力正在逐漸下降，不孕不育已成為繼心腦血管疾病、腫瘤之后威脅全人類生存的三大疾病之一。WHO指出，排除女方的因素，婚后有規(guī)律性生活、未采取任何避孕措施的夫妻生活達到一年以上者，女方仍未能懷孕，可診斷為男性不育癥。據(jù)WHO最新的統(tǒng)計結果顯示，全球的不孕不育患者占世界人口的15%，并且這個數(shù)字還在飛速增加。我國的發(fā)病率約在12.5%左右，這些患者中約40%是由于男性因素導致的[1]。
質量是決定男性生育力最主要的方面，男性質量的下降是導致男性不育癥的最重要原因，主要有少癥、弱癥以及畸形癥[2]；另一方面，現(xiàn)代社會女性意外懷孕后的流產(chǎn)比例越來越高，目前針對男性的避孕措施僅僅局限于、體外、輸精管結扎等[3]，并沒有針對男性的可逆性藥物，所以針對男性的避孕措施相對較少。大量研究表明Eppin（epididymal peptidase inhibitor）與生殖和免疫性避孕關系密切。本文對Eppin基因及蛋白的發(fā)現(xiàn)、特征及其在男性生殖等方面的作用做一綜述。
1Eppin的發(fā)現(xiàn)及特征
研究發(fā)現(xiàn)部分人的精漿中存在一種蛋白質抗體，這種抗體會阻礙的液化和的運動，進而導致男性不育，后來人們將其命名為Eppin蛋白，由Eppin基因編碼[4-6]。
人類Eppin表達的三種mRNA實際上只編碼兩種蛋白亞型（1、3的蛋白質序列一樣），分別為Eppin 1和Eppin 2，它們的區(qū)別在于N端的氨基酸序列不同。Eppin 1是最主要的，它的mRNA編碼133個氨基酸殘基，1～21是信號肽，22～133是成熟蛋白，所以是一種分泌蛋白；Eppin蛋白理論上的等電點是8.52，相對分子質量（Mr）為15283[7]。這類蛋白質在和附睪中被檢測到，可能在靈長類動物的繁衍中發(fā)揮重要的作用。
2Eppin對活動力的影響
O′Rand等[8，9]研究證實，重組Eppin免疫的雄猴無法使雌猴自然受孕，經(jīng)過檢測這些雄猴的血清發(fā)現(xiàn)其Eppin抗體陽性率非常高。王增軍等[10]采用嚴謹?shù)膶嶒灧椒ㄗC明了存在于精漿中和表面的Eppin蛋白能夠與精囊的凝固蛋白酶（Semenogelin）結合，同時讓重組Eppin和重組Semenogelin的不同氨基酸片段自由結合，發(fā)現(xiàn)C端Eppin75-133氨基酸片段能夠與Sg164-283氨基酸片段相結合，而且人類Semenogelin中唯一的胱氨酸殘基（Cys239）就存在于Semenogelin片段中，這項研究證實了Eppin能夠通過影響Semenogelin而發(fā)揮其作用，因此推測Eppin可能干擾了Eppin-Semenogelin結合，使形成團塊影響了活動力。
ELISA法檢測25例抗抗體陽性的不育患者中有7例Eppin（28%）陽性。然后使用Western blot方法進一步檢測7例陽性患者的標本，發(fā)現(xiàn)有5例Eppin陽性表達。另外對25例可以正常生育的男性患者的進行檢測，發(fā)現(xiàn)抗Eppin抗體均為陰性表達。這說明抗抗體陽性的不育患者的中含有抗Eppin抗體?？笶ppin抗體能夠通過干擾正常Eppin和Semenogelin的相互作用，影響的成熟過程和液化情況，致使運動能力下降，進而導致患者不育。
丁新良等[11]通過對Eppin基因SNPS（單核苷酸多態(tài)性）的研究發(fā)現(xiàn)，位點rs2231829與數(shù)量之間以及位點rs6124715、rs11594與運動能力之間均存在顯著相關性。在SNPS與發(fā)病風險的分析中，發(fā)現(xiàn)多態(tài)性位點rs2231829和rs11594的存在顯著改變男性原發(fā)性不育癥的發(fā)病風險，并且這種風險在質量異常的病例中非常明顯。然而，這些SNPS各基因型對應的血清睪酮水平?jīng)]有顯著性差異。生物信息學分析表明，位點rs2231829影響轉錄因子的結合，而位點rs11594影響mRNA結構。因此可以推測Eppin基因多態(tài)性可能通過影響轉錄因子的結合以及mRNA的結構而影響該基因的生物學功能，進而干擾成熟過程，影響生育結局，但是這一假設還有待進一步研究證實。此外，以小鼠為研究對象，采用整體動物RNA干擾結合顯微注射與膜片鉗技術，發(fā)現(xiàn)Eppin基因低表達會引起小鼠運動能力明顯下降，主要表現(xiàn)為平均路徑速度、活力、直線速度和曲線速度的顯著下降。進一步研究表明與運動能力變化相一致的是，小鼠生精細胞的T型鈣電流也隨之顯著下降，T型鈣通道的mRNA水平亦顯著降低。因此可以得出以下結論：Eppin基因低表達導致生精細胞T型鈣通道m(xù)RNA水平的降低和T型鈣電流的下降，進而引起運動能力的下降。
3Eppin在OA和NOA診斷中的應用
基于Eppin基因在附睪和異性表達，Liu B等[18]采用Western blot的方法檢測40例正常人和46例無癥患者中Eppin蛋白的表達，將精漿中Eppin蛋白有表達的無癥患者診斷為非梗阻性無癥（NOA，Non obstructive azoospermia），而精漿中Eppin蛋白無表達的無癥患者診斷為梗阻性無癥（OA，Obstructive azoospermia），并且進一步通過經(jīng)皮附睪穿刺術/經(jīng)皮穿刺術（PESA/TESA）確診無癥的類別。對比發(fā)現(xiàn)，通過Western blot檢測Eppin蛋白的表達得到的診斷結果與PESA/TESA的診斷結果非常類似。因此，Eppin蛋白檢測或許是一種新的、有效的、無創(chuàng)的診斷OA和NOA的方法，將來有望在臨床中得到廣泛的應用。
4Eppin在男性避孕方面的應用
目前在避孕領域，男性避孕疫苗是研究的熱點之一。Eppin蛋白是由和附睪特異性分泌，廣泛存在于后的人類頭部和尾部表面，進入附睪輸出管后，表面與附睪頭部和尾部所分泌的Eppin蛋白會發(fā)生特異性結合；另一方面，膜蛋白在發(fā)生和成熟過程中、受精過程中和胚胎早期發(fā)育過程中有著至關重要的作用，可能涉及到獲能、頂體反應、穿透卵子透明帶、精卵結合和受精卵的分裂等方面，機體可能對一些膜蛋白發(fā)生免疫反應，導致免疫性不孕癥。頂體赤道區(qū)及頂體內膜含有頂體膜蛋白17（Sp17），Sp17會在頂體反應后大量表達，有促進受精的作用，其機制可能是Sp17能夠與透明帶上的糖基結合引起。因此Sp17和Eppin都可作為潛在的避孕疫苗靶點。
房磊臣等[19]采用基因重組及抗原抗體反應等方法，將人Sp17和Eppin作為靶抗原，成功構建了酵母Sp17-Eppin融合蛋白表達系統(tǒng)，獲得了高純度Sp17-Eppin融合蛋白，并且進一步在大量動物實驗中發(fā)現(xiàn)這種融合蛋白疫苗組的避孕效應顯著強于單一重組的Sp17蛋白疫苗組，大大增加了避孕效應。盡管其避孕效應具有可逆性，但同時也會造成縮小，因此對的生精功能會有一定程度的影響。然而這仍是對融合蛋白避孕疫苗構建的大膽嘗試，為探索開發(fā)安全、高效、可逆的男性免疫性避孕疫苗新途徑打下了堅實的實驗基礎。
5Eppin與糖尿病、肥胖癥的關系
糖尿病、肥胖癥等對男性生育力的影響正越來越受到大家的關注，它們造成的激素改變和新陳代謝紊亂會對男性生育力構成一定的危害，而且現(xiàn)在糖尿病和肥胖癥的發(fā)病年齡越來越小，因此越來越多的人的生育力在生育年齡之前已經(jīng)受到負面的影響。最近一項研究表明體重指數(shù)（BMI）對男性生育力的影響僅次于年齡。采用差異凝膠電泳方法對糖尿病患者、肥胖人群和正常人群的Eppin蛋白質組進行分析識別，對數(shù)據(jù)結果進行對比分析，證實了糖尿病患者和肥胖人群與正常人群之間的Eppin蛋白質組在表達程度上存在顯著性差異[12～17]。
6結語
綜上所述，Eppin基因和蛋白對質量有重要的影響，進而影響男性生育，但對其具體的分子機制報道的較少，下一步應著重對其機制方面進行研究。中抗Eppin抗體的檢測或許能成為一種研究男性免疫性不育機制的無創(chuàng)的方法，不僅改善了不育癥患者的特異性診療，拓寬了患者的輔助診斷指標，同時也為男性免疫性避孕疫苗的研發(fā)提供了一定的實驗和臨床研究基礎。
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篇9
【關鍵詞】肝硬化;單胺氧化酶;前白蛋白
【中圖分類號】R446.11 【文獻標識碼】A 【文章編號】1006-1959(2009)09-0018-01
病毒性肝炎后肝硬化已成為我國的常見病,對肝硬化的早期診斷與適宜治療,對于穩(wěn)定病情,延長患者的生命年限具有積極的意義。常用肝功能檢查指標特異性不高;放免法檢測透明質酸、Ⅲ型膠原、Ⅳ型膠原等指標條件要求高,檢測時間長,不易普及。目前PA、MAO檢測試劑盒已商品化,測定方法簡便易行,可上全自動生化分析儀,與其它指標聯(lián)合應用和動態(tài)測定有助于肝硬化的輔助診斷和病情判斷。
1 對象與方法
1.1 對象:85例門診及住院病人(男56例,女29例,平均年齡47±9歲),其中肝硬化代償期患者56例(男34例,女22例,平均年齡46±6歲),失代償期患者29例(男22例,女7例,平均年齡(52±11歲)均經(jīng)臨床確診為肝硬化,檢測其血清PA含量及MAO活力。健康對照系獻血員血清50份,男38,女12例,平均年齡(34±11)歲。
1.2 方法:PA測定用免疫比濁法,MAO測定用連續(xù)監(jiān)測法統(tǒng)計方法:數(shù)據(jù)均以(x±s)表示,采用方差分析(F檢驗)和相關分析,P
2 結果
肝硬化患者血清PA、MAO水平與對照組比較,見表1。
3 討論
血清前白蛋白是肝細胞合成的蛋白質之一,由于在pH8.6電泳中移動速度比白蛋白快而命名為前白蛋白[1]。前白蛋白的半衰期僅為1.9d,與白蛋白(17~23d)相比,更是觀測肝功能受損及營養(yǎng)缺乏的早期診斷指標[2]。肝硬化患者由于營養(yǎng)缺乏,同時有功能的肝細胞數(shù)目減少,前白蛋白合成下降,導致前白蛋白水平在代償期即有顯著意義的下降(P
MAO(Monoamine oxidase,EC1.4.3.4)為一組作用于不同單胺類化合物如腎上腺素、五羥色氨等氧化脫氨的水溶性酶,是由黃素蛋白和輔酶黃素蛋白腺嘌呤二核苷酸組成的含銅蛋白質,在膠原形成過程中,參與膠原成熟最后階段的架橋形成,使膠原和彈性硬蛋白結合,形成纖維后MAO逸脫,導致血清中MAO活性升高,正常情況下膠原蛋白的合成和分解處于動態(tài)平衡,人體受到肝炎病毒感染后,引起肝內慢性炎癥性刺激而產(chǎn)生纖維組織增生,肝纖維化時膠原合成增多,其總量的增加與肝纖維化程度呈正相關。MAO廣泛存在于肝、腎、腦等器官的結締增生,導致肝臟纖維化。在此過程中膠原合成增多,結果分析表明肝硬化時,MAO的活性明顯增高,故MAO活性測定能反應肝纖維化的生化過程,對肝硬化的早期診斷和肝硬化的分級有重要診斷價值,肝硬化Child-PlughA、B、C各級之間MAO水平差異顯著,對亞急性重型肝炎和慢性重型肝炎患者肝纖維化狀況和監(jiān)測有重要臨床意義[3,4]。
綜上所述,血清PA、MAO測定對肝硬化早期診斷具有重要的價值,PA、MAO測定有利于肝硬化的診斷、病程、療效觀察和隨訪。在實驗室診斷中,我們應該利用MAO檢測對肝硬化做出早期、準確的臨床診斷。
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篇10
【關鍵詞】 脂蛋白(A)； 平滑肌細胞； 血管； 蛋白激酶類； 細胞外調節(jié)蛋白激酶
［Abstract］ Objective: To study the effect of extracellular regulated protein kinases (ERK) in cytoskeleton reorganization and migration of human vascular smooth muscle cells (VSMCs) stimulated by lipoprotein a [Lp(a)]. Methods: The VSMCs treated with different concentrations of ERK kinase inhibitor PD98059 were， then， stimulated by Lp(a) for 20 minutes. The expression of protein ERK (P-ERK ) in VSMCs was detected with Western blotting. The cytoskeletons of these VSMCs were observed with confocal laser scanning microscope， and the number of cells migrated was determined with migration assays. Results: No change of P-ERK expression was detected in VSMCs when treated by PD98059 with the final concentration of 10 μmol/L（P>0.05）. Within the range of final PD98059 concentrations of 20 μmol/L to 40 μmol/L， the P-ERK expression in treated VSMCc decreased along with the increasing of the PD98059 concentrations（P
［Key words］ lipoprotein(a)； smooth muscle cells; blood vessels; protein kinases; extracellular regulated protein kinases
目前已知血漿脂蛋白(a)[Lp(a)]濃度的升高是各種動脈硬化性疾病的危險因素，Lp(a)不僅與其發(fā)病有關，還與其嚴重程度、術后血管再狹窄及閉塞有很大的相關性。Lp(a)的血漿濃度對生活方式改變和藥物的調控不敏感，故目前對Lp(a)致病機制的研究已成為研究的熱點?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)Lp(a)可促進血管平滑肌細胞(VSMC)的遷移，但其具體機制仍不明確。用ERK激酶抑制劑PD98059抑制人VSMC內的細胞外調節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)活化，探討ERK在Lp(a)促VSMC遷移中的作用。
1 材料與方法
1.1 材料
Lp(a)，F(xiàn)ITC標記的Phalloidin，鼠抗人平滑肌α-肌動蛋白（α-actin）單克隆抗體，DAPI購自美國Sigma公司；免疫組織化學染色（SABC）試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；Costar TranswellTM培養(yǎng)板購自美國Corning公司；兔抗人ERK抗體、兔抗人P-ERK抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；PD98059購自Calbiochem公司。
1.2 方法
1.2.1 人臍動脈VSMC的原代培養(yǎng)、純化、傳代及鑒定
取剖宮產(chǎn)胎兒的新鮮臍帶，分離出臍動脈，剝除臍動脈外膜，刮去內膜，將動脈中膜剪成約1 mm×1 mm×1 mm的組織塊進行培養(yǎng)。傳代過程中采用差速貼壁法進一步純化細胞，第5~10代細胞用于實驗［1］。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，進行形態(tài)學鑒定。SABC法檢測VSMC胞漿內的α-actin。
1.2.2 抑制劑阻斷Lp(a)誘導的ERK活化
1.2.2.1 實驗分組 取第5~10代細胞，用不含或含Lp(a)[即為1、2組，Lp(a)終濃度為320 mg/L]培養(yǎng)液誘導6 h；用含PD98059（終濃度分別為10、20、30、40及50 μmol/L，依次為3~7組）的培養(yǎng)液預處理1 h后，再用含Lp(a)(終濃度為320 mg/L)培養(yǎng)液誘導6 h。
1.2.2.2 Westernblot印記檢測ERK及P-ERK蛋白表達 0.25 %胰酶消化收集上述處理好的細胞后提取總蛋白并用BCA檢測法進行蛋白濃度的測定。將蛋白電泳后轉膜，用5％脫脂奶粉TBST液浸泡過夜，以封閉PVDF膜。按說明書與一抗及二抗結合后行ECL發(fā)光檢測，對膠片進行掃描，用Totallab軟件分析。
1.2.3 抑制劑阻斷ERK的活化后Lp(a)誘導的細胞骨架的標記及觀察 實驗分2組，分別為對照組及PD98059處理組，向馴化至同一代謝水平的VSMC加入不含或含PD98059（終濃度為40 μmol/L）培養(yǎng)液孵育1 h后，予Lp(a)誘導20 min，免疫熒光標記細胞骨架，激光共聚焦顯微鏡觀察細胞骨架構建。
1.2.4 抑制劑阻斷ERK的活化后Lp(a)誘導的VSMC遷移試驗 實驗分2組，分別為對照組及PD98059處理組，ERK抑制劑預處理人血管平滑肌細胞后予Lp(a)誘導，Transwell小室檢測VSMC遷移。細胞以DAPI染色30 min，每組隨機取5個視野，200倍視野免疫熒光顯微鏡下計數(shù)細胞數(shù)，取平均值。上述遷移實驗重復3次。
1.3 統(tǒng)計學分析
采用SPSS10.0軟件對上述結果進行分析，統(tǒng)計數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差來顯示，組間比較采用單因素方差分析，兩組比較用t檢驗，P
2 結果
2.1 平滑肌細胞的鑒定
倒置相差顯微鏡觀察可見平滑肌細胞呈長梭形，呈現(xiàn)典型的“波峰”與“浪谷”狀。免疫組織化學進行平滑肌細胞表型標志物α-actin染色，可見細胞胞漿呈棕黃色， 胞核呈淡藍色，證明培養(yǎng)的細胞是平滑肌細胞。
2.2 抑制劑對Lp(a)誘導的P-ERK蛋白表達的影響
Western blot檢測顯示各組VSMC內的ERK蛋白表達量之間無明顯差異（P>0.05），故以ERK的蛋白表達量作為內參照。第2組較第1組P-ERK/ERK比值明顯升高（P0.05）外，其余3~6組P-ERK/ERK比值兩兩之間均有顯著性差異（P
2.3 抑制劑阻斷ERK的活化后Lp(a)誘導的細胞骨架構建狀況
PD98059處理組與對照組相比，細胞內未見明顯的張力纖維、絲狀偽足（圖2及圖3）以及粘著斑形成（圖4及圖5）。注：(1)：與前1組相比，P0.05
2.4 抑制劑阻斷ERK的活化后Lp(a)誘導的VSMC遷移
VSMC遷移試驗顯示，正常對照組VSMC遷移細胞數(shù)為（78.87±7.43）個，PD98059處理組為（49.20±6.47）個， PD98059處理組較正常對照組明顯減少（P
3 討論
Lp(a)是1963年由挪威遺傳學家Berg［2］首先從血漿中分離出來并命名的。此后經(jīng)一系列研究證明人Lp(a)與動脈粥樣硬化有關的各類疾病有密切關系，是動脈粥樣硬化、動脈再狹窄、卒中、冠心病及心肌梗死發(fā)生的一個主要危險因素，并與其它血脂水平無相關性，是一個獨立的危險因素［3］。血液中Lp(a)的濃度是一個穩(wěn)定的遺傳標志，不受性別、年齡、飲食、理化因素及多種降脂藥物影響。Lp(a)的致動脈粥樣硬化作用機制有以下幾個方面：Lp(a)能破壞受體介導的血管內皮舒張功能，導致內皮功能失調；Lp(a)可能通過清道夫受體途徑、LDL受體途徑及非受體途徑等穿過血管內皮，參與泡沫細胞形成；Lp(a)和純化的Apo(a)可促進VSMC遷移和增值；Lp(a)有促血栓形成作用。一系列研究證實了VSMC從中層向內膜的遷移是動脈粥樣硬化和血管再狹窄共同的病理基礎［4］。但Lp(a)促VSMC遷移的機制目前仍不明確。
細胞骨架是細胞質內由蛋白質組成的三維網(wǎng)架狀結構， 分為微管、微絲、中等纖維和微梁網(wǎng)格等，是參與介導細胞變形、細胞運動及細胞遷移等重要活動的蛋白質體系［5］。該體系由肌動蛋白、肌球蛋白和肌動蛋白結合蛋白組成。其中肌動蛋白是最豐富的蛋白，是構成微絲的基本成分，故微絲又稱為肌動蛋白細胞骨架系統(tǒng)，其基本結構單位是纖維狀肌動蛋白(F-actin)。張力纖維及絲狀偽足即是顯微鏡下的F-actin呈現(xiàn)出的形態(tài)。本實驗中采用免疫熒光標記F-actin來觀察這些結構的構建。
ERK包括ERK1和ERK2，統(tǒng)稱為ERK1/2，主要被各種生長因子、離子射線、過氧化氫、血清及佛波酯等外界刺激而激活。ERK1/2是由Boulton等［6，7］于上世紀90年代初期分離鑒定的，相對分子量分別為44 kD和42 kD，它們有90％的同源性。ERK1/2的活化是將信號從細胞膜表面受體轉導至核的關鍵，ERK1/2信號通路(RasRafMEK1/2ERK1/2)是經(jīng)典的MAPK信號轉導途徑，是由1個小GTP蛋白連接活化的受體酪氨酸激酶和胞漿蛋白組成的級聯(lián)反應。平時ERK1/2位于胞漿內，一旦被激活，ERK1/2迅速穿過核膜，活化的ERK1/2可磷酸化多種核轉錄因子如Elk-1、Ets-1、c-Myc、Sapla、Tal、STAT、Fos 、ATF2、Max、c-jun及ATF2等，這些轉錄因子進一步調節(jié)它們各自靶基因的轉錄，引起特定蛋白的表達或活性改變，最終調節(jié)細胞代謝和功能，影響細胞產(chǎn)生特定的生物學效應［8］。有研究表明，氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)誘導的VSMC增殖作用可能與調節(jié)G蛋白偶聯(lián)受體，啟動RasRaf MEK1/2ERK1/2通路有關。Yang等［9，10］等研究發(fā)現(xiàn)，Ox-LDL在導致培養(yǎng)VSMC增殖的同時，伴隨MAPK的活化，并可誘導ERK1/2的活化，同時ERK1/2的特異阻斷劑U0126可完全抑制Ox-LDL誘導的VSMC的增殖。Ox-LDL對ERK1/2活性的影響，提示Ox-LDL誘導VSMC的增殖極有可能是通過活化ERK1/2這一信號通路而實現(xiàn)的。Hu等［11］研究發(fā)現(xiàn)，球囊損傷后早期血管組織ERK1/2活性升高，同時伴有c-fos和c-jun的mRNA的升高；在損傷后7～14 d，內膜的ERK1/2仍然升高，并且內膜高于中膜，提示ERK1/2活性和2種癌基因表達的增加可能參與了再狹窄過程。最近Fisher等［12］觀察到了ERK1/2反義寡核苷酸(ODNs)對VSMC增殖和(或)遷移的抑制作用，因而認為在細胞外基質(ECM)所誘導的VSMC遷移和增殖過程中，ERK1/2是發(fā)揮了重要作用的關鍵信號分子。PD98059是MEK的一種藥理學抑制劑，PD98059通過選擇性抑制MEK1/2的激酶活性，阻止Raf對ERK1/2的磷酸化和激活。
本實驗結果顯示，各組的總ERK蛋白表達量之間無明顯差異（P>0.05），提示Lp(a)是通過ERK的磷酸化而不是使ERK的表達增加來發(fā)揮作用的。VSMC經(jīng)不同濃度的PD98059預處理后，Western blot檢測顯示PD98059的終濃度在10 μmol/L時對ERK激酶無明顯抑制作用，從20 μmol/L開始，隨其終濃度的逐漸升高，其對ERK激酶的抑制作用逐漸增強，但達到40 μmol/L后，其抑制作用達到高峰，40 μmol/L和50 μmol/L對ERK激酶的抑制作用無明顯差異，這一結果與Dario等［13］的發(fā)現(xiàn)一致。PD98059的終濃度為40 μmol/L時P-ERK的蛋白表達量減少了71.7%，顯示了PD98059對Lp(a)誘導的P-ERK蛋白的表達有顯著的抑制作用。
激光共聚焦顯微鏡觀察PD98059抑制ERK磷酸化后Lp(a)誘導的細胞骨架構建的變化，顯示Lp(a)誘導VSMC 20 min后，細胞內未見明顯的張力纖維、絲狀偽足以及粘著斑形成。說明P-ERK參與了Lp(a)所誘導的張力纖維、絲狀偽足以及粘著斑的形成，MAPK是Lp(a)誘導細胞骨架構建的信號通路中的重要一環(huán)。VSMC遷移試驗顯示抑制ERK的磷酸化可明顯抑制Lp(a)所誘導的VSMC遷移。但Lp(a)促VSMC遷移信號通路中的其它具體環(huán)節(jié)仍有待進一步研究。
參考文獻
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