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2表觀遺傳學(xué)概述每個(gè)細(xì)胞都具有全套基因，這全能性的基因如何表達(dá)出如此多樣性的細(xì)胞、組織 這一復(fù)雜有序表達(dá)調(diào)控過(guò)程被稱(chēng)為表觀遺傳學(xué)[4]?；虻腄NA序列只是一個(gè)模板 ，高等生 物的每個(gè)細(xì)胞必須通過(guò)表觀遺傳信息的調(diào)控，有序地指令其遺傳信息的開(kāi)啟或關(guān)閉。使全能 性基因表達(dá)出多樣性細(xì)胞、組織。它不僅對(duì)基因的表達(dá)、調(diào)控、遺傳有重要作用，而且在腫 瘤、免疫包括高血壓等許多慢性疾病的發(fā)生和防治中，也具有十分重要是意義。表觀遺傳變 量則是聯(lián)系基因組、環(huán)境和疾病的重要環(huán)節(jié)。表觀遺傳學(xué)的分子機(jī)制包括DNA甲基化、組蛋 白修飾、染色質(zhì)重塑和RNA干擾等，其中最重要的是DNA甲基化和通過(guò)組蛋白修飾的染色質(zhì)重 塑。這些調(diào)控機(jī)制有二個(gè)特征：一是它們可以受后天環(huán)境影響，具有可獲得性；二是它們可 遺傳性。在“全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）”發(fā)現(xiàn)了一些血壓 、高血壓的遺傳易感位點(diǎn)，但這些位點(diǎn)對(duì)人群血壓水平影響很?。ā?mmHg）[2]，這 一現(xiàn)象在其它復(fù)雜性狀疾病GWAS研究中普遍存在，稱(chēng)為：遺傳性缺失（missing heritabilit y）[5]。而重視表觀遺傳學(xué)的研究也是對(duì)類(lèi)似高血壓這樣的復(fù)雜性狀疾病，呈現(xiàn)環(huán) 境和基因相關(guān)所致“遺傳性缺失”的揭示。

3表觀遺傳調(diào)控與線(xiàn)粒體代謝[6] 表觀遺傳學(xué)可提供環(huán)境與核DNA（nDNA）二者之間的相互關(guān)系。環(huán)境的關(guān)鍵要素是 對(duì)機(jī)體的能源給予可利用的熱量（calories）。通過(guò)細(xì)胞生物產(chǎn)能系統(tǒng)，經(jīng)由糖酵介和線(xiàn)粒體 氧化磷酸化（OXPHOS）產(chǎn)生能量。有成千生物能源基因（Bioenergetic genes），彌散越過(guò)染色 質(zhì)和線(xiàn)粒體DNA（mDNA），并需有mDNA順式（cis）和反式（trans）二者的調(diào)節(jié)。生物產(chǎn)能系統(tǒng)轉(zhuǎn)化 環(huán)境中的熱能為ATP，乙酰輔酶A，S_腺苷甲硫氨酸（SAM）以及還原性NAD+。當(dāng)能源充沛時(shí)， AT P和乙酰輔酶A磷酸化和乙?；旧|(zhì)，開(kāi)放nDNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。當(dāng)能源受限時(shí)，染色質(zhì)的磷酸 化和乙?；瘑适В种苹虮磉_(dá)。經(jīng)由SAM使DNA甲基化，也可由線(xiàn)粒體功能所修飾。磷酸化 和乙?；彩钦{(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)傳遞的關(guān)鍵。所以，生物能源學(xué)提供環(huán)境與表觀遺傳二者相互作 用，最終組成表觀遺傳調(diào)控疾患的臨床表型（phenotype）。類(lèi)似表觀遺傳疾病的有Angelma n，Rett，F(xiàn)ragile X綜合癥，和癌癥等，常伴有線(xiàn)粒體功能失調(diào)?！吧锬茉磳W(xué)-表觀遺傳學(xué) ” 的假設(shè)，也可更廣泛適用于如高血壓、糖尿病等一般常見(jiàn)的由環(huán)境-基因相互作用的疾病， 用來(lái)探索其病因、病理生理和指導(dǎo)其治療。

4表觀遺傳與高血壓的發(fā)生

41DNA甲基化與原發(fā)性高血壓：高血壓的發(fā)生和發(fā)展與DNA甲基化密切相關(guān)。11β_類(lèi)固 醇脫氫酶_2（11β_hydroxysteroid dehydrogenase_2 11β_HSD_2） 、內(nèi)皮素轉(zhuǎn)換酶1（endothelin converting enzyme_1，ECE_1）和AT1b等基因發(fā)生甲基化和去 甲基化，會(huì)影響代謝酶和受體的表達(dá)；從而通過(guò)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活，以及腎 性水鈉潴留等途徑引起高血壓的發(fā)生[7]。

411血管緊張素Ⅱ受體1型b（AT1b）：基因可通過(guò)甲基化調(diào)控，參與高血壓的發(fā)生和 發(fā)展。AT1b受體主要分布于腎上腺、垂體腎臟等部位，有實(shí)驗(yàn)在妊娠期的小鼠，喂以低蛋白 飲食，其子代腎上腺AT1b受體基因啟動(dòng)子發(fā)生顯著去甲基化，AT1b受體基因表達(dá)上調(diào)；引起 子代對(duì)血管緊張素的反應(yīng)性升高，收縮壓、舒張壓均高于正常。表明AT1b受體的低甲基化（ 或去甲基化）可能是高血壓的潛在病因之一[8]。

41211β_HSD_2：11β_HSD_2活性減低，通過(guò)皮質(zhì)醇作用，導(dǎo)致鹽皮質(zhì)激素受體（mine ralcorticoireceptor MR）過(guò)表達(dá)，并且有腎臟鈉離子的潴留，低鉀血癥和鹽敏感性 高血壓。這種情況發(fā)生在糖皮質(zhì)激素治療，導(dǎo)致11β_HSD_2基因啟動(dòng)子高甲基化，活性降 低，同時(shí)伴有尿中THF（四氫皮質(zhì)醇）/THE（四氫可的松）比率增高[9]。

413甲基化CpG結(jié)合蛋白增強(qiáng)自主神經(jīng)反應(yīng)性：甲基化CpG結(jié)合蛋白_2（MECP_2） 是MECP基因的產(chǎn)物。有報(bào)道[10]通過(guò)MECP_2致去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)體基因沉默。去甲 腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)體是一種膜蛋白，通過(guò)此轉(zhuǎn)運(yùn)體可將兒茶酚胺神經(jīng)介質(zhì)如去甲腎上腺素和多巴 胺轉(zhuǎn)運(yùn)回突觸前（presynaptic）神經(jīng)元而釋放。在腦力應(yīng)激下，苯乙醇胺N_甲基轉(zhuǎn)移酶（PNM T）（將去甲腎上腺素轉(zhuǎn)換為腎上腺素，源于腎上腺髓質(zhì)嗜酪細(xì)胞）釋放，如同DNA甲基化酶 ，具有MECP_2基因沉默作用；因而可以減少神經(jīng)元再攝取去甲腎上腺素，而產(chǎn)生突觸與周 圍兒茶酚胺水平增加，自主神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)增高，引起血壓升高和驚恐狀態(tài)。

414高同型半胱氨酸所致基因組DNA低甲基化與原發(fā)性高血壓：Kim等[11]對(duì) 同型半胱氨酸（Homocystine Hcy）和血壓水平調(diào)查，二者呈獨(dú)立正相關(guān)。具有高Hcy的高 血壓稱(chēng)H型高血壓。對(duì)高Hcy引發(fā)的高血壓有多種解釋?zhuān)鳫cy在機(jī)體內(nèi)的功能是比較復(fù)雜的 ，機(jī)體內(nèi)Hcy含量主要受遺傳和環(huán)境營(yíng)養(yǎng)二種因素調(diào)控。環(huán)境營(yíng)養(yǎng)因素主要指代謝輔助因 子：如葉酸，維生素B6、維生素B12等，如果葉酸、維生素B12不足，就會(huì)造成獲得性Hcy代 謝障 礙。維生素B12是5_甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)甲基酶的輔酶，而5_甲基四氫葉酸是體內(nèi)甲基的間接供 體，二者的缺乏使甲基不能轉(zhuǎn)移，阻礙甲硫氨酸的再生成，同時(shí)造成Hcy的蓄積。Hcy水平升 高時(shí)，肝臟中S_腺苷同型半胱氨酸（SAH）水平升高；而甲基供體S_腺苷甲硫氨酸（SAM）下降， 導(dǎo)致DNA低甲基化[12]。由高Hcy和高SAH水平所致的基因組低甲基化，容易誘發(fā)AT1 b，ECE_1等基因去甲基化，使這些受體和代謝酶基因表達(dá)上調(diào)，并通過(guò)RAS激活和腎性水鈉 潴留等途徑引起高血壓的發(fā)生。由此可見(jiàn)不同細(xì)胞類(lèi)型有特殊甲基化模式，反映它們的多樣性和特殊性。甲基化模式遺傳（M ethylation Pattern Inheritance）可以經(jīng)過(guò)一代至另一代，相應(yīng)于環(huán)境對(duì)細(xì)胞的發(fā)展和功 能的改變。

42組蛋白乙?；c高血壓：染色質(zhì)的基本單位為核小體，后者是由四種組蛋白（H2A，H 2B，H3，H4）各二個(gè)分子構(gòu)成的八聚體核心，N端尾部為單一的H1。組蛋白乙酰化與基 因活化和DNA復(fù)制相關(guān)，組蛋白的去乙?；突蚴Щ钕嚓P(guān)。有報(bào)道[13]在用C172 NSC系列細(xì)胞給予生理劑量褪黑激素（Melatonin MLT）24h 后，顯示組蛋白H3乙?；黾?，軸突樣伸展，和標(biāo)志神經(jīng)干細(xì)胞nestin mRNA表達(dá)增加；M LT也對(duì)不同的其它組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶亞型表達(dá)增加。MLT對(duì)富含MLT受體最后區(qū)（area postrm a AP）神經(jīng)元的調(diào)控，提供輸出至嘴側(cè)延髓腹外側(cè)區(qū)（Rostral Ventrolateral Medulla RVML ）血管運(yùn)動(dòng)中樞興奮增加。RVML是腦干交感性輸出至血管的主要調(diào)節(jié)者。因而當(dāng)RVML功能失 調(diào)時(shí)，也是人類(lèi)原發(fā)性高血壓發(fā)生的一種重要機(jī)制[14]。

43SiRNA對(duì)NADPH氧化酶、氧化應(yīng)激和RAS（腎素-血管緊張素）的升壓抑制作用：20世紀(jì) 90年現(xiàn)了小干擾RNA（SiRNA），RNA已成為重要的遺傳學(xué)信息的決定者和調(diào)控基因的表達(dá) 。RNA干擾（RNAi）是由雙鏈RNA（dSRNA）使靶基因的mRNA降介或阻止其翻譯，最終導(dǎo)致特異性 靶基因表達(dá)阻斷。SiRNA通常來(lái)源于mRNA、轉(zhuǎn)座子、病毒或異染色質(zhì)DNA。經(jīng)過(guò)Dicer酶切割 形成長(zhǎng)20～25bp的小片段，并與靶基因mRNA互補(bǔ)鏈結(jié)合，產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄后基因沉默（PTGS）。對(duì)于 SiRNA已成為近年來(lái)在腫瘤及一些復(fù)雜性狀的慢性疾患研究的熱點(diǎn)[15]。有報(bào)道 [16]用SiRNA靶向p22phox（sip22phox），使其RNA沉默，抑制NADPH氧化酶_AngⅡ 誘導(dǎo)的 平滑肌細(xì)胞收縮反應(yīng)。RNA沉默，減輕NADPH氧化酶活性和產(chǎn)生氧化應(yīng)激；并在清醒小鼠給予 AngⅡ的第二周顯示減輕其進(jìn)行性的升壓反應(yīng)。

5展望近年來(lái)表觀遺傳調(diào)控高血壓、血管重構(gòu)，以及有關(guān)高血壓的并發(fā)癥等，有較多的報(bào)道[ 17，18]。成為推動(dòng)闡明高血壓這樣一種遺傳和環(huán)境因素相互作用所導(dǎo)致的復(fù)雜性狀的疾 病，拓展了新的領(lǐng)域，并引起極大的關(guān)注。然而，表觀遺傳領(lǐng)域的最大難題是清理出致病徑 路[19]。例如，表觀遺傳的DNA修飾能引起疾病，而有些致病因素又能誘發(fā)DNA修 飾，或染色體的重構(gòu)。已知有些表觀遺傳修飾是后天獲得的，有些是遺傳的；但它不同于單 基因遺傳所致的特殊類(lèi)型的高血壓，可以經(jīng)過(guò)傳代后發(fā)生血壓升高，也可以逆轉(zhuǎn)。要系統(tǒng)地清理表觀遺傳調(diào)控高血壓的徑路及其發(fā)病機(jī)制，還需做大量工件。目前表觀遺傳學(xué) 對(duì)腫瘤的研究最為活躍，有些已轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用，取得了可喜的成果。表觀遺傳被假設(shè)為環(huán) 境與基因表達(dá)二者之間的調(diào)節(jié)者；而環(huán)境對(duì)機(jī)體最重要的因素是熱量的利用以及其調(diào)控機(jī)制 ；其次是隨齡的氧化損傷。這二者與線(xiàn)粒體的代謝密切相關(guān)。因此，在清理表觀遺傳致病徑 路，將表觀遺傳調(diào)控與線(xiàn)粒體代謝二者結(jié)合探討，可能更有利于闡明如高血壓這類(lèi)復(fù)雜性狀 的疾病。表觀遺傳學(xué)在高血壓發(fā)生中的作用，及其在某種程度上的可逆性，這就為高血壓的防治提供 了新的靶點(diǎn)，為個(gè)體化藥物治療提供依據(jù)。更重要的是能確立高血壓是多基因和環(huán)境因素參 與的一種復(fù)雜性狀的病癥的概念，將高血壓的防治前移[20]，倡導(dǎo)更合理、健康、 優(yōu)化的營(yíng)養(yǎng)和生存環(huán)境。

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篇2

關(guān)鍵詞：表觀遺傳學(xué)；染色體失活；DNA甲基化；組蛋白修飾；基因組印記

遺傳學(xué)是指基于基因序列改變所致基因表達(dá)水平變化，如基因突變、基因雜合丟失和微衛(wèi)星不穩(wěn)定等；而表觀遺傳學(xué)則是指基于非基因序列改變所致基因表達(dá)水平變化，如DNA甲基化和染色質(zhì)構(gòu)象變化等；表觀基因組學(xué)則是在基因組水平上對(duì)表觀遺傳學(xué)改變的研究。

通俗的講，表觀遺傳學(xué)是研究在沒(méi)有細(xì)胞核DNA序列改變的情況時(shí)，基因功能的可逆的、可遺傳的改變。也指生物發(fā)育過(guò)程中包含的程序的研究。在這兩種情況下，研究的對(duì)象都包括在DNA序列中未包含的基因調(diào)控信息如何傳遞到（細(xì)胞或生物體的）下一代這個(gè)問(wèn)題。在分子水平上，表觀遺傳學(xué)解釋了DNA序列所不能解釋的諸多奇怪的現(xiàn)象。如：同一等位基因可因親源性別不同而產(chǎn)生不同的基因印記疾病，疾病嚴(yán)重程度也可因親源性別而異。表觀遺傳的現(xiàn)象很多，主要包括：染色體失活、DNA甲基化、組蛋白修飾、基因組印記等。

1 染色體失活

在哺乳動(dòng)物中，雌雄性個(gè)體X 染色體的數(shù)目不同，這類(lèi)動(dòng)物需要以一種方式來(lái)解決X 染色體劑量的差異。在雌性哺乳動(dòng)物中，兩條X 染色體有一個(gè)是失活的，稱(chēng)為X染色體的劑量補(bǔ)償。人類(lèi)存在相同的現(xiàn)象，女性有兩條X染色體，而男性只有一條X染色體，為了保持平衡，女性的一條X染色體被永久失活。X染色體失活的選擇和起始發(fā)生在胚胎發(fā)育的早期，這個(gè)過(guò)程被X 失活中心(X - inactivation center) 所控制。這個(gè)失活中心存在著X染色體失活特異性轉(zhuǎn)錄基因Xist (X - inactive - specifictranscript) ，當(dāng)失活的命令下達(dá)時(shí)，這個(gè)基因就會(huì)產(chǎn)生一個(gè)17 kb 不翻譯的RNA 與X 染色體結(jié)合，引發(fā)失活。Xist基因編碼Xist RNA，Xist RNA包裹在合成它的X染色體上，引發(fā)X染色體失活；隨著Xist RNA在X染色體上的擴(kuò)展，DNA甲基化和組蛋白的修飾馬上發(fā)生，這對(duì)X染色體失活的建立和維持有重要的作用。X 染色體失活是表觀遺傳學(xué)最典型的例子，它可以通過(guò)有絲分裂或減數(shù)分裂遺傳給后代。人們可以通過(guò)了解染色體失活的原理來(lái)解釋遺傳規(guī)律。

2 DNA 甲基化

所謂DNA甲基化是指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下，在基因組CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳位共價(jià)鍵結(jié)合一個(gè)甲基基團(tuán)。它是基因組DNA 的一種主要表觀遺傳修飾形式，是調(diào)節(jié)基因組功能的重要手段。CpG常成簇存在，人們將基因組中富含CpG的一段DNA 稱(chēng)為CpG島，通常長(zhǎng)度在1～2 kb 左右。人類(lèi)基因組中大小為100～1 000 bp左右且富含CpG二核苷酸的CpG島總是處于未甲基化狀態(tài)，并且與56%的人類(lèi)基因組編碼基因相關(guān)。CpG島常位于轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)附近，在DNA 甲基化過(guò)程中胞嘧啶突出于DNA 雙螺旋并進(jìn)入與胞嘧啶甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)合部位的裂隙中，該酶將S-腺苷甲硫氨酸(SAM) 的甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶的5′位，形成5 - 甲基胞嘧啶。由于DNA甲基化與人類(lèi)發(fā)育和腫瘤疾病的密切關(guān)系，特別是CpG島甲基化所致抑癌基因轉(zhuǎn)錄失活問(wèn)題，DNA甲基化已經(jīng)成為表觀遺傳學(xué)和表觀基因組學(xué)的重要研究?jī)?nèi)容。體內(nèi)甲基化狀態(tài)有3種：持續(xù)的低甲基化狀態(tài)、誘導(dǎo)的去甲基化狀態(tài)和高度甲基化狀態(tài)。DNA 甲基化主要是通過(guò)DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶家族來(lái)催化。DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶分兩種：維持甲基化酶和重新甲基化酶。在細(xì)胞分化的過(guò)程中，基因的甲基化狀態(tài)將遺傳給后代細(xì)胞。但在哺乳動(dòng)物的生殖細(xì)胞發(fā)育時(shí)期和植入前胚胎期，其基因組范圍內(nèi)的甲基化模式通過(guò)大規(guī)模的去甲基化和接下來(lái)的再甲基化過(guò)程發(fā)生重編程，從而產(chǎn)生具有發(fā)育潛能的細(xì)胞。

3 組蛋白修飾

組蛋白是真核生物染色體的基本結(jié)構(gòu)蛋白，是一類(lèi)小分子堿性蛋白質(zhì)。組蛋白有兩個(gè)活性末端：羧基端和氨基端。染色體的多級(jí)折疊過(guò)程中，需要DNA 同組蛋白結(jié)合在一起。這種常見(jiàn)的組蛋白外在修飾作用包括乙?；⒓谆?、磷酸化、泛素化、糖基化、ADP 核糖基化、羰基化等，它們都是組蛋白密碼的基本元素。與DNA 密碼不同的是，組蛋白密碼和它的解碼機(jī)制在動(dòng)物、植物和真菌類(lèi)中是不同的。我們從植物細(xì)胞保留有發(fā)育成整個(gè)植株的全能性和去分化的特性中，就可以看出它們?cè)诮⒑捅３直碛^遺傳信息方面與動(dòng)物是不同的。乙?；揎棿蠖嘣诮M蛋白H3 的Lys9 、14 、18 、23 和H4 的Lys5 、8、12 、16 等位點(diǎn)。甲基化修飾主要在組蛋白H3 和H4 的賴(lài)氨酸和精氨酸兩類(lèi)殘基上。研究也顯示，在進(jìn)化過(guò)程中組蛋白甲基化和DNA甲基化兩者在機(jī)能上被聯(lián)系在一起。在引起基因沉默的過(guò)程中，沉默信號(hào)(DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重新裝配)是如何進(jìn)行的目前仍處于研究階段。當(dāng)DNA量增加時(shí)，阻抑作用可消除，轉(zhuǎn)錄便開(kāi)始進(jìn)行。這說(shuō)明組蛋白的阻抑作用不是抑制RNA聚合酶，而是組蛋白與DNA相結(jié)合后，將DNA束縛住使其不能轉(zhuǎn)錄。

4 基因組印記

篇3

【關(guān)鍵詞】 目標(biāo)教學(xué)法；初中數(shù)學(xué)；課堂教學(xué)

每一節(jié)課都必須有教學(xué)目標(biāo)，在設(shè)計(jì)教案的時(shí)候最初就應(yīng)該明確一節(jié)課的教學(xué)目標(biāo). 教學(xué)中各個(gè)環(huán)節(jié)和內(nèi)容的設(shè)計(jì)都應(yīng)該是圍繞著教學(xué)目標(biāo)而進(jìn)行的. 教學(xué)目標(biāo)是整堂課的出發(fā)點(diǎn)，也是課堂的最終歸宿點(diǎn). 有了明確的目標(biāo)才能更好地保障每節(jié)課的課堂效率，讓學(xué)生們?cè)谀繕?biāo)的指引下，真正掌握一節(jié)課所要掌握的內(nèi)容. 現(xiàn)在我將結(jié)合自身的教學(xué)實(shí)踐，談?wù)勗诮虒W(xué)的過(guò)程中，如何去落實(shí)讓目標(biāo)貫穿課堂的每一個(gè)環(huán)節(jié).

一、明確教學(xué)目標(biāo)，體現(xiàn)出對(duì)教學(xué)過(guò)程的引導(dǎo)

制定教學(xué)目標(biāo)是設(shè)計(jì)一堂課的開(kāi)始，教學(xué)目標(biāo)的制定關(guān)系著一節(jié)課的課堂效率. 總的來(lái)說(shuō)，教學(xué)目標(biāo)的制定要盡量的具體詳細(xì). 這樣不但可以更加具體地體現(xiàn)一節(jié)課的目標(biāo)，教師在備課的時(shí)候也可以根據(jù)教學(xué)目標(biāo)來(lái)安排更加適當(dāng)?shù)慕虒W(xué)內(nèi)容. 如果教學(xué)目標(biāo)太籠統(tǒng)，教師則比較難很難組織教學(xué)內(nèi)容，并且要判斷學(xué)生們是否已經(jīng)掌握所要學(xué)習(xí)的內(nèi)容，是否達(dá)成了學(xué)習(xí)目標(biāo)也比較難有具體的判斷依據(jù). 因此，在制定教學(xué)目標(biāo)的時(shí)候，要盡量詳細(xì)具體.

比如，在學(xué)習(xí)七年級(jí)的數(shù)軸這一節(jié)課時(shí)，大部分老師給的教學(xué)目標(biāo)就是：一、能根據(jù)構(gòu)成數(shù)軸的三個(gè)要素正確畫(huà)出數(shù)軸；二、學(xué)會(huì)由數(shù)軸上的已知點(diǎn)說(shuō)出它所表示的數(shù)，能將有理數(shù)用數(shù)軸上的點(diǎn)表示出來(lái). 我認(rèn)為這節(jié)課的教學(xué)目標(biāo)可以這樣去具體化，如一、明確什么是數(shù)軸；二、數(shù)軸的三要素是什么；三、畫(huà)數(shù)軸的方法是什么；四、數(shù)軸上的點(diǎn)與有理數(shù)之間的關(guān)系是什么；這樣把課堂目標(biāo)具體化之后，學(xué)生們?nèi)绻梢曰卮疬@幾個(gè)問(wèn)題，那么這節(jié)課的內(nèi)容就算是掌握了. 要判斷學(xué)生們是否達(dá)成了課堂的學(xué)習(xí)目標(biāo)，就按照這樣的依據(jù)來(lái)檢驗(yàn)就可以了. 因此，教師在制定課堂教學(xué)目標(biāo)的時(shí)候，要保證目標(biāo)內(nèi)容的具體性和目標(biāo)的可操作性，盡量不要設(shè)計(jì)一些抽象的，范圍籠統(tǒng)的目標(biāo).

二、授課的過(guò)程應(yīng)以課程目標(biāo)為向?qū)?/p>

在制定了具體的教學(xué)目標(biāo)之后，課堂的展開(kāi)就應(yīng)該是以教學(xué)目標(biāo)為導(dǎo)向和線(xiàn)索，一步步進(jìn)行教學(xué). 這樣不但有利于教學(xué)的有序展開(kāi)，還可以使課堂的邏輯更加合理. 在導(dǎo)入新課之后，教師可以直接把本堂課的教學(xué)目標(biāo)告訴學(xué)生，如要讓學(xué)生們明確本節(jié)課要學(xué)習(xí)的內(nèi)容是什么，我們要掌握哪幾點(diǎn)，哪些內(nèi)容是重點(diǎn)，哪些內(nèi)容是難點(diǎn)，不同的內(nèi)容對(duì)學(xué)生們的不同要求. 讓學(xué)生明確這節(jié)課要達(dá)成的目標(biāo)有哪些，學(xué)習(xí)的內(nèi)容難度有多大. 在這樣的明確目標(biāo)的指引下，無(wú)形中就可以促使學(xué)生們?cè)谀繕?biāo)和任務(wù)的驅(qū)動(dòng)下學(xué)習(xí). 因?yàn)橛袑W(xué)習(xí)任務(wù)和目標(biāo)的提示和指引，在學(xué)習(xí)的過(guò)程中就可以對(duì)學(xué)生們形成有利的刺激，讓學(xué)生們的學(xué)習(xí)變得有目的，避免學(xué)習(xí)的盲目性.

學(xué)生們?cè)谀繕?biāo)的指引下學(xué)習(xí)，也能更好地理解教師的授課內(nèi)容安排，可以更加連貫地理解內(nèi)容之間的銜接和過(guò)渡. 現(xiàn)實(shí)的教學(xué)中，很多教師在上課開(kāi)始之后，直接就說(shuō)我們今天學(xué)習(xí)什么內(nèi)容，比如說(shuō)我們今天學(xué)習(xí)數(shù)軸，數(shù)軸是這節(jié)課的標(biāo)題，但這一節(jié)具體講了些什么內(nèi)容，如果教師不先宣布教學(xué)目標(biāo)的話(huà)，接下來(lái)就開(kāi)始講課，可能到下課，也有很多學(xué)生不知道這節(jié)課的重點(diǎn)是什么，到底要掌握一些什么內(nèi)容才算過(guò)關(guān)，這樣給學(xué)生的感覺(jué)是會(huì)很籠統(tǒng)的，也會(huì)覺(jué)得比較盲目. 因此，教師在上課之間要詳細(xì)說(shuō)明這節(jié)課具體要學(xué)習(xí)的是哪些內(nèi)容，那將會(huì)大大提高課堂的效率.

三、教學(xué)方法要適應(yīng)目標(biāo)教學(xué)的過(guò)程

目標(biāo)教學(xué)的過(guò)程是以目標(biāo)為導(dǎo)向的，但也還需要依賴(lài)一定的教學(xué)方法. 教學(xué)方法并不能隨便用，要達(dá)到好的教學(xué)效果，就要采取適當(dāng)?shù)慕虒W(xué)方法. 教學(xué)方法受特定的課程內(nèi)容所制約的，教學(xué)方法是一種引導(dǎo)和調(diào)節(jié)教學(xué)過(guò)程的規(guī)范體系. 它不但是一種教法，還是一種學(xué)法. 在目標(biāo)教學(xué)的引導(dǎo)下，圍繞教學(xué)目標(biāo)，教師可以選擇講授的方法，還可以選擇讓學(xué)生們自主學(xué)習(xí)的方法，目標(biāo)教學(xué)法是一種比較容易選擇教學(xué)方法的學(xué)習(xí)方式. 教師可以根據(jù)教學(xué)目標(biāo)把每一個(gè)知識(shí)點(diǎn)講清楚，學(xué)生也可以根據(jù)教學(xué)目標(biāo)進(jìn)行學(xué)習(xí)和探究性的自主學(xué)習(xí). 課堂中教師調(diào)配得好，就可以實(shí)現(xiàn)講授和學(xué)生探究相結(jié)合的理想的授課方式. 不但能把知識(shí)傳達(dá)清楚，還可以培養(yǎng)學(xué)生們自學(xué)的能力.

比如在學(xué)習(xí)數(shù)軸的時(shí)候，因?yàn)檫@節(jié)課的內(nèi)容比較簡(jiǎn)單，可以讓學(xué)生們先看書(shū)，讓他們來(lái)回答什么是數(shù)軸，數(shù)軸的三要素是什么. 也可以教師先講授什么是數(shù)軸，然后讓學(xué)生們自主學(xué)習(xí)探究后來(lái)回答數(shù)軸的三要素. 老師的講授和學(xué)生的自主學(xué)習(xí)可以很自由地結(jié)合. 無(wú)論用什么樣的方法，都是圍繞教學(xué)目標(biāo)而進(jìn)行的，達(dá)到目標(biāo)就可以說(shuō)這節(jié)課有效率.

四、以課堂目標(biāo)來(lái)檢測(cè)學(xué)生們對(duì)知識(shí)的掌握程度

上完一節(jié)課，學(xué)生們對(duì)知識(shí)的掌握程度一般來(lái)說(shuō)可以通過(guò)練習(xí)的形式來(lái)反饋，但其實(shí)也可以用一種更加直接的方式，就是根據(jù)教學(xué)目標(biāo)來(lái)檢測(cè)學(xué)生們對(duì)是否已經(jīng)掌握本節(jié)課所學(xué)習(xí)的知識(shí). 比如可以通過(guò)提問(wèn)的方式，用教學(xué)目標(biāo)中具體的內(nèi)容來(lái)進(jìn)行提問(wèn)，學(xué)生們可以答出來(lái)的話(huà)，那么這節(jié)課的目標(biāo)就算是達(dá)成了. 如果有些學(xué)生沒(méi)有很好地完成學(xué)習(xí)的任務(wù)，那么對(duì)照著教學(xué)目標(biāo)，他也可以很清楚地知道自己還有哪一點(diǎn)是不明白的，這樣也方便學(xué)生進(jìn)行復(fù)習(xí)或?qū)で笃渌瑢W(xué)的幫助. 學(xué)生對(duì)自己的學(xué)習(xí)效果和學(xué)習(xí)情況也可以有個(gè)清楚的了解. 這些都是通過(guò)教學(xué)目標(biāo)才能體現(xiàn)出來(lái)的.

綜上所述，讓目標(biāo)貫穿課堂的全部，有了具體的課堂教學(xué)目標(biāo)可以更好地組織上課內(nèi)容和上課過(guò)程. 這樣無(wú)論是教師還是學(xué)生，在教與學(xué)的過(guò)程中都有了明確的方向，師生們有了共同的目標(biāo)，課堂也將更加和諧順利地進(jìn)行，真正提高課堂的效率.

【參考文獻(xiàn)】

[1]康霞.科學(xué)合理地設(shè)計(jì)初中數(shù)學(xué)課時(shí)教學(xué)目標(biāo)，云南教育，2012.5.

篇4

據(jù)介紹，黃瓜源自喜馬拉雅山脈南麓，本是印度境內(nèi)土生土長(zhǎng)的植物。野生黃瓜果實(shí)和植株都比較矮小，果實(shí)極苦，原本在印度被作為草藥使用。經(jīng)過(guò)人類(lèi)的馴化，黃瓜果實(shí)和葉片都變大了，果實(shí)也失去了苦味，由一種草藥變成了品種多樣的可口蔬菜，如今在世界范圍內(nèi)廣泛種植。在科研上，黃瓜常被用來(lái)作為研究植物性別決定、維管束形成的重要模式系統(tǒng)。

科研團(tuán)隊(duì)通過(guò)對(duì)115 個(gè)黃瓜品系重測(cè)序和1 個(gè)野生黃瓜從頭（de novo）測(cè)序共發(fā)現(xiàn)了330多萬(wàn)個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（SNPs）、33萬(wàn)多個(gè)小插入和刪除（small insertion and deletions）和594 個(gè)獲得/缺失變異（PAVs）?；谶@些數(shù)據(jù)，研究人員構(gòu)建了1 個(gè)單核苷酸分辨率的黃瓜遺傳變異圖譜。

所挑選的115 個(gè)黃瓜品系分為印度類(lèi)群、歐亞類(lèi)群、東亞類(lèi)群和西雙版納類(lèi)群等4大類(lèi)，其中印度類(lèi)群主要來(lái)自于野生變種，而其余3 個(gè)品種均來(lái)自栽培變種。通過(guò)比較分析發(fā)現(xiàn)，印度類(lèi)群遺傳多樣性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其它3 個(gè)類(lèi)群。這一結(jié)果證實(shí)了印度是黃瓜的發(fā)源地，也意味著野生資源中尚有很多待挖掘的基因資源。

科研團(tuán)隊(duì)還對(duì)3 種果蔬（黃瓜、西瓜和番茄）和3 種谷物（大米、玉米和大豆）的馴化過(guò)程進(jìn)行了比較研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在馴化過(guò)程中，果蔬比谷物的遺傳多樣性下降趨勢(shì)更大，這就解釋了為何經(jīng)馴化的黃瓜群體比谷物要小得多。研究人員推斷果蔬在進(jìn)化過(guò)程中的“瓶頸期”相對(duì)要更窄些。

研究發(fā)現(xiàn)，黃瓜基因組中有100多個(gè)區(qū)域受到了馴化選擇，包含2000多個(gè)基因。其中7 個(gè)區(qū)域包括控制葉片和果實(shí)大小的基因，果實(shí)失去苦味的關(guān)鍵基因已經(jīng)明確地定位在染色體5上包含67 個(gè)基因的一個(gè)區(qū)域里，為下一步克隆這一重要蔬菜馴化基因打下了基礎(chǔ)。

篇5

關(guān)鍵詞 硒 表觀遺傳修飾 表觀標(biāo)志物抑制劑 抗癌藥 開(kāi)發(fā)

中圖分類(lèi)號(hào)：R979.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2017）03-0075-04

Selenium compounds ― looking forward to be developed as epigenetic targeting selenium-containing anti-tumor drugs*

ZHU Huiqiu1**， HUA Yan1， WANG Mingli2***

（1. Anhui Huaxin Pharmaceutical Co. Ltd.， Hefei 230000， China； 2. Anhui Medical University， HeFei 230032， China）

ABSTRACT Selenium compounds can produce an intervention effect on the abnormality of epigenetic modification and then repress the occurrence and metastasis of tumor. They can be used as the inhibitors of some tumor specific epigenetic markers and expected to be developed as a new type of epigenetic targeting selenium-containing anti-tumor drugs.

KEy WORDS selenium； epigenetic modification； inhibitors of epigenetic markers； anti-cancer drugs； development

硒最重要的生物學(xué)功能是抗癌，并以多種機(jī)制發(fā)揮其抗癌作用。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，硒又可對(duì)表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制異化產(chǎn)生干預(yù)影響，特別是對(duì)在腫瘤發(fā)生機(jī)制中的特異性靶點(diǎn)進(jìn)行干預(yù)，進(jìn)而阻抑腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移。硒化物是某些腫瘤特異性表觀標(biāo)志物有效的抑制劑。硒的這個(gè)功能不僅對(duì)臨床腫瘤診斷、治療、預(yù)防具有現(xiàn)實(shí)意義，更為“含硒表觀靶向抗癌藥物”開(kāi)發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。“含硒表觀靶向抗癌藥物”是期待開(kāi)發(fā)的新型抗癌藥?，F(xiàn)就近些年在這些方面的相關(guān)研究作一簡(jiǎn)要介紹。

1 表觀遺傳學(xué)

什么是表觀遺傳學(xué)？從孟德?tīng)栠z傳規(guī)律講，親代（一代）把遺傳信息傳遞給子代（二代），主要由攜帶遺傳信息的脫氧核糖核酸（DNA）分子中堿基的排列順序（即堿基序列）來(lái)決定，并在細(xì)胞核內(nèi)遺傳。但人們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，在DNA堿基序列以外還有一套調(diào)控機(jī)制，包括 DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑以及非編碼RNA等，它們?cè)诓簧婕案淖僁NA堿基序列的情況下，影響轉(zhuǎn)錄活性并調(diào)控基因的表達(dá)，改變機(jī)體的性狀，并且是一種可以預(yù)和逆轉(zhuǎn)的遺傳機(jī)制。這種非孟德?tīng)栠z傳現(xiàn)象，稱(chēng)作表觀遺傳學(xué)[1-2]。

2 硒對(duì)表觀遺傳修飾異常產(chǎn)生干預(yù)及逆D作用

腫瘤發(fā)生發(fā)展的主要生物學(xué)原因是原癌基因活化和抑癌基因失活[3]。研究顯示，DNA甲基化水平同這些基因的表達(dá)密切相關(guān)。通常情況下，甲基化水平同基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，甲基化程度越高，基因表達(dá)活性越低，甲基化程度越低，基因表達(dá)越活躍[4]。

DNA甲基化主要表現(xiàn)為基因組整體甲基化水平降低和局部CpG島[在哺乳動(dòng)物中富含胞嘧啶-磷酸-鳥(niǎo)嘌呤（CpG）二核苷酸的一段DNA稱(chēng)為CpG島]甲基化程度的異常升高，人類(lèi)基因組的甲基化主要發(fā)生在CpG島[5]。

研究表明，實(shí)體瘤普遍存在基因組廣泛低甲基化現(xiàn)象，低甲基化使原癌基因活化，癌細(xì)胞異常增殖；低甲基化還使腫瘤轉(zhuǎn)移增加，例如胃癌的甲基化水平越低，癌細(xì)胞浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的傾向越明顯[6]。

CpG島的甲基化程度異常升高，會(huì)導(dǎo)致某些抑癌基因表達(dá)沉默，進(jìn)而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在正常情況下，CpG島為非甲基化。當(dāng)腫瘤抑癌基因的啟動(dòng)子區(qū)域（CpG島）過(guò)度甲基化，就會(huì)使抑癌基因的表達(dá)沉默。其間DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）家族中的DNMT1發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，它的高表達(dá)導(dǎo)致抑癌基因在CpG島失活。所以，CpG島高甲基化成了多種腫瘤特異性表觀標(biāo)志物，已成為臨床多種腫瘤早期診斷的依據(jù)和指標(biāo)[7]。

近年來(lái)，作為表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制之一的組蛋白修飾在腫瘤研究領(lǐng)域受到越來(lái)越多的關(guān)注。組蛋白乙?；山M蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（HAT）和組蛋白去乙酰化酶（HDACs）共同調(diào)控，而編碼HAT或HDAC的基因如果發(fā)生染色體易位、擴(kuò)增等突變會(huì)導(dǎo)致某些腫瘤的發(fā)生。

可見(jiàn)，DNA甲基化和組蛋白乙酰化等表觀遺傳修飾異常是腫瘤發(fā)生的另外一個(gè)機(jī)制。而近年研究發(fā)現(xiàn)，硒通過(guò)靶向干預(yù)可逆轉(zhuǎn)甲基化和乙?；惓５倪^(guò)程，從而抑制腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移。硒化物成了潛在的治癌新藥物，是亟待開(kāi)發(fā)、臨床應(yīng)用前景可觀的“含硒表觀靶向抗癌藥物”。

2.1 硒對(duì)DNA甲基化產(chǎn)生干預(yù)作用

研究表明，膳食硒通過(guò)干預(yù)表觀遺傳過(guò)程顯示出其抗癌潛力，膳食缺硒時(shí)組織呈現(xiàn)整體低甲基化[8]。Davis等[9]早些時(shí)候研究發(fā)現(xiàn)，給大鼠喂食缺硒膳食，其肝臟和結(jié)腸都出現(xiàn)顯著DNA低甲基化，而經(jīng)硒處理的人結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2 DNA甲基化水平顯著高于未經(jīng)硒處理的對(duì)照組，據(jù)此研究者認(rèn)為，膳食缺硒會(huì)增加肝臟和結(jié)腸腫瘤的發(fā)生。Remely等[8]研究表明，膳食硒營(yíng)養(yǎng)缺乏會(huì)引起動(dòng)物組織和人體結(jié)腸癌DNA低甲基化。我國(guó)學(xué)者徐世文等[4]通過(guò)實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，飼料硒缺乏可導(dǎo)致雞肌肉組織 DNA甲基化水平降低。硒對(duì)DNMT有抑制作用，缺硒會(huì)導(dǎo)致DNMT活性增加，使原癌基因活化，引起結(jié)腸癌等多種腫瘤發(fā)生。保持硒等營(yíng)養(yǎng)素均衡攝入，有利于維持DNA甲基化正常水平及抑制DNMT活性[6]。

CpG島DNMT1的高表達(dá)是使抑癌基因失活的重要機(jī)制。抑制DNMT1靶酶活性，使失活的抑癌基因復(fù)活，是腫瘤治療中探索的新途徑。硒在多種腫瘤中有去甲基化的生物學(xué)功能，能誘導(dǎo)失活的抑癌基因重新活化和表達(dá)[3]。研究發(fā)現(xiàn)，硒可以直接干預(yù)DNA甲基化，抑制腺癌細(xì)胞株DNMT的高表達(dá)[8]。膳食硒干預(yù)DNA甲基化的方式之一是通過(guò)去甲基化過(guò)程來(lái)調(diào)節(jié)DNMT1活性的；研究還證實(shí)，亞硒酸鈉和苯甲基氰酸硒（BSC）、1，4-苯雙（亞甲基）氰酸硒（p-XSC）兩種合成硒化物對(duì)人大腸癌細(xì)胞核提取物中DNMT的活性都有抑制作用[10]。

各方面的研究驗(yàn)證，硒對(duì)DNA甲基化產(chǎn)生干預(yù)影響，是靶酶DNMT有效的抑制劑。

2.2 硒干預(yù)影響組蛋白的乙?；?/p>

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白去乙酰化酶與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。HDACs家族中的HDAC1高表達(dá)可明顯增加腫瘤細(xì)胞的增殖能力。在食管鱗癌、前列腺癌等多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)HDAC的高表達(dá)，靶酶HDAC已成為首選的攻擊靶點(diǎn)。

目前，人們通過(guò)體內(nèi)、體外的研究鑒定出了硒、丁酸鹽、曲古抑菌素A（TSA）等一些HDAC的抑制劑，這些抑制劑可在體外誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)停滯、分化或凋亡[2]。Somech等[11]通過(guò)臨床試驗(yàn)表明，HDAC抑制劑對(duì)人體白血病及實(shí)體瘤進(jìn)行治療，表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤增殖效果，研究者認(rèn)為，各類(lèi)HDAC抑制劑是另一類(lèi)新型抗癌藥物、“癌癥治療的新工具”。

Xiang等[12]的研究證明，硒可以通過(guò)下調(diào)DNMT和抑制HDAC活性，活化人前列腺癌LNCaP細(xì)胞系中因高甲基化沉默的基因GSTP1， APC和CSR1。這些基因是具有保護(hù)免受氧化損傷的抗癌活性物質(zhì)、化學(xué)致癌物解毒劑或腫瘤抑制劑。

甲基硒酸（MSA）是近年來(lái)新研制成的一種人工低分子量有機(jī)硒化合物，是很具潛力的抗癌制劑。Kassam等[13]通過(guò)對(duì)彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系（DLBCL）w外研究首次發(fā)現(xiàn)，MSA可以抑制該細(xì)胞系HDAC的活性。研究者認(rèn)為，有關(guān)MSA抑制HDAC活性的作用以前從未報(bào)道過(guò)，從而為人們提供了硒元素一種新的機(jī)制，MSA是日后臨床試驗(yàn)中可以使用的硒化物。

我國(guó)科研人員胡琛霏[2]通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡的方法，檢測(cè)到MSA可抑制食管鱗癌細(xì)胞系HDAC的活性，降低HDACl和HDAC2的蛋白表達(dá)，引起細(xì)胞內(nèi)組蛋白乙?；斤@著升高；同時(shí)，還檢測(cè)到硒甲硫氨酸（SLM）對(duì)食管鱗癌細(xì)胞系KYSEl50細(xì)胞和MCF7細(xì)胞的作用，在SLM處理細(xì)胞24 h后，細(xì)胞中組蛋白去乙?；傅幕钚砸诧@著降低。

這些年，越來(lái)越多的含硒組蛋白去乙?；敢种苿┍话l(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證。亞硒酸鈉、酮C甲基硒丁酸鹽（KMSB）、甲基硒代半胱氨酸（MSC）、甲基硒丙酮酸（MSP）等硒化物都可以抑制HDAC活性，提高組蛋白乙?；?，作為潛在的HDAC抑制劑，發(fā)揮其抗腫瘤的作用[14]。Fernandes 等[15]介紹，KMSB 和 MSP在體外作為HDAC的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑發(fā)揮抗癌作用；還報(bào)道，合成的SAHA含硒類(lèi)似物（5-苯甲酰戊氰硒）二硒醚和5-苯甲酰戊氰硒對(duì)不同肺癌細(xì)胞株HDAC抑制效果比SAHA更好。SAHA是氧肟酸類(lèi)HDAC抑制劑，是目前在臨床上以皮膚T淋巴細(xì)胞瘤（CTCL）為適應(yīng)癥而廣泛應(yīng)用的表觀靶向抗癌藥物。這也提示，含硒類(lèi)抑制劑對(duì)靶酶HDAC抑制效果優(yōu)于無(wú)硒類(lèi)抑制劑。

為何上述各種硒化物都可靶向抑制DNMT和HDAC活性，研究發(fā)現(xiàn)不管其結(jié)構(gòu)如何改變，硒都是這些化合物生物活性的中心元素，發(fā)揮著關(guān)鍵作用，硒的這一生物學(xué)功能對(duì)含硒抗癌藥物的開(kāi)發(fā)具有重要的指導(dǎo)意義[16]。

2.3 硒對(duì)非編碼RNA調(diào)控機(jī)制產(chǎn)生干預(yù)效應(yīng)

表觀遺傳學(xué)的一個(gè)重要調(diào)控機(jī)制是非編碼RNA。非編碼RNA是指不能翻譯為蛋白質(zhì)的RNA分子。近年來(lái)，非編碼RNA一族中的微小RNA-200（miR-200）受到人們的高度關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，miR-200家族中的成員微小RNA-200a（miR-200a）與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，miR-200a在腫瘤組織中呈現(xiàn)明顯低表達(dá)。因此，miR-200a的表達(dá)下調(diào)是腫瘤發(fā)生的重要因素之一，miR-200a也成了腫瘤特異性表觀標(biāo)志物[17]。

胡琛霏[2]通過(guò)TaqMan芯片，檢測(cè)了MSA處理食管鱗癌細(xì)胞后細(xì)胞中微小RNA（miRNA）的變化情況，發(fā)現(xiàn)MSA可以上調(diào)細(xì)胞中miR-200a 的表達(dá)水平，miR-200a 表達(dá)升高后，負(fù)性調(diào)控Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1（Keap1）的表達(dá)，使Keap1蛋白水平下降，上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2（Nrf2）蛋白水平并提高其轉(zhuǎn)錄活性（Nrf2活性受其細(xì)胞質(zhì)接頭蛋白Keap1的調(diào)控），從而活化Keap1-Nrf2信號(hào)通路。而Keap1-Nrf2信號(hào)通路在抗氧化、預(yù)防腫瘤發(fā)生等諸多方面有重要作用[18]。

體外研究顯示[19] ，人腦膜瘤組織中miR-200a表達(dá)明顯低于正常組織，β-循環(huán)蛋白（β-catenin）和其下游靶基因細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)顯著增高，二者和miR-200a呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，上調(diào)miR-200a可降低β-catenin的表達(dá)，進(jìn)而阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路來(lái)抑制腦膜瘤的生長(zhǎng)。胡琛霏課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)MSA可以抑制食管鱗癌細(xì)胞系中β-catenin的表達(dá)[2] 。研究已證實(shí)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活和高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡[20]。

由此可見(jiàn)，MSA可能介導(dǎo)、調(diào)控著miR-200a表達(dá)及參與復(fù)雜的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而抑制腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移。

3 展望

加強(qiáng)硒與表觀遺傳學(xué)之間關(guān)聯(lián)的研究，有著重要的生物醫(yī)學(xué)意義。它有可能解釋硒化學(xué)抗腫瘤的新機(jī)制，從理論上證明硒元素可能具有表觀遺傳學(xué)的效應(yīng)[21] 。綜上所述，硒在腫瘤形成中對(duì)表觀遺傳修飾異常產(chǎn)生干預(yù)影響，靶向抑制腫瘤特異性表觀標(biāo)志物，逆轉(zhuǎn)表觀遺傳修飾發(fā)生異化過(guò)程，使我們認(rèn)識(shí)了硒化學(xué)抗癌的新機(jī)制、新作用，硒化物是潛在開(kāi)發(fā)的新型靶向抗癌藥物。Fernandes 等[15]指出，硒化物都是癌癥治療藥。目前，非表觀類(lèi)含硒靶向抗癌藥如硒唑呋喃、依布硒啉、乙烷硒啉等早已進(jìn)入臨床研究[16]，展示出很有希望的臨床應(yīng)用前景。而含硒表觀靶向抗癌藥物是亟待開(kāi)發(fā)的抗癌藥“富礦”，加快開(kāi)發(fā)含硒表觀靶向抗癌藥物，可為臨床腫瘤治療增加一種“新的工具”，為癌癥患者戰(zhàn)勝病魔增添一份新的希望。人們熱切期盼“含硒表觀分子靶向抗癌藥物”早日問(wèn)世。

致謝：本課題研究得到華中科技大學(xué)徐輝碧、黃開(kāi)勛兩位教授和安徽醫(yī)科大學(xué)張文昌碩士的支持，在此表示衷心感謝。

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篇6

    心肌缺血時(shí),有氧代謝發(fā)生障礙,葡萄糖利用減少,脂肪酸利用增多,使氧利用率下降,心臟供能不足;同時(shí),無(wú)氧代謝導(dǎo)致的酸性代謝產(chǎn)物增加,引起細(xì)胞內(nèi)酸中毒。此外,心肌缺血還能引起氧自由基及鈣離子超載,誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致嚴(yán)重的臨床癥狀。因此,改善能量代謝,清除自由基,減輕鈣超載,抵抗細(xì)胞凋亡,實(shí)現(xiàn)心肌保護(hù)作用成為改善心肌缺血的重要途徑[10]。研究表明,針灸在實(shí)現(xiàn)心肌保護(hù)方面具有自身的優(yōu)勢(shì)。一方面,針灸可通過(guò)改善能量代謝,實(shí)現(xiàn)心肌保護(hù)。心肌缺血時(shí),能量代謝相關(guān)酶發(fā)生改變,電針能提高心肌組織糖原、琥珀酸脫氫酶和三磷酸腺苷酶的活性,糾正心肌相關(guān)酶的異常,增強(qiáng)能量代謝,改善心肌缺血。另一方面,針灸可減少自由基,緩解心肌缺血癥狀。熱休克蛋白(HSP)屬應(yīng)激蛋白,能減少氧自由基釋放,減輕心肌缺血損傷,從而保護(hù)機(jī)體[11]。研究證明電針“內(nèi)關(guān)”穴可以增強(qiáng)缺血心肌細(xì)胞HSP90和HSP70mRNA表達(dá),以減少氧自由基的釋放,從而緩解家兔心肌缺血癥狀[12-13];而且,針刺“內(nèi)關(guān)”穴能抑制細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載,實(shí)現(xiàn)心肌細(xì)胞保護(hù),電針“內(nèi)關(guān)”通過(guò)上調(diào)心肌鈣泵和鈉泵基因表達(dá),增強(qiáng)鈣泵和鈉泵活性,降低心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量,從而達(dá)到抑制鈣超載,實(shí)現(xiàn)對(duì)心肌組織的保護(hù)作用,表現(xiàn)為促進(jìn)心電活動(dòng)、改善心肌組織形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)[14]。大量研究表明,針刺可以調(diào)控凋亡基因的表達(dá)水平,延長(zhǎng)細(xì)胞周期,減少細(xì)胞凋亡,保護(hù)缺血心肌細(xì)胞。有研究指出電針可以調(diào)節(jié)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡因子Bax和抗凋亡因子Bcl-2在家兔缺血心肌中的表達(dá),即抑制凋亡基因Bax和促進(jìn)抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá),抑制心肌細(xì)胞凋亡,從而達(dá)到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用[15]。c-fos基因是一種原癌基因,參與調(diào)節(jié)體內(nèi)許多過(guò)程,如細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、腫瘤轉(zhuǎn)化及細(xì)胞凋亡等,正常情況下細(xì)胞內(nèi)c-fos表達(dá)呈低水平狀態(tài),心肌缺血可激活c-fos基因的表達(dá)從而啟動(dòng)心肌細(xì)胞凋亡。研究表明,電針可降低c-fos基因表達(dá),改善急性心肌缺血的過(guò)程[16-17]。所以不難看出,針灸能通過(guò)多種途徑實(shí)現(xiàn)心肌細(xì)胞保護(hù)?？傊?針灸干預(yù)心肌缺血的療效和機(jī)制已初步得到證實(shí)和揭示,但尚未完全闡明,在一定程度影響了針灸治療心肌缺血在臨床的應(yīng)用和推廣。因此,需要引進(jìn)新的理念、新的方法技術(shù)進(jìn)行深入探索。

    2表觀遺傳調(diào)控在針灸治療心肌缺血的機(jī)制研究中的應(yīng)用

    目前主要涉及的表觀遺傳調(diào)控包括CG輔酶甲基化、組蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾、RNA干擾等,具體可分為DNA甲基化、蛋白質(zhì)共價(jià)修飾、染色質(zhì)重塑、微小RNA調(diào)控4個(gè)方面[18-19]。越來(lái)越多的研究表明,表觀遺傳調(diào)控在心肌缺血過(guò)程中扮演重要角色,參與了疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的全部過(guò)程,因此,我們探討從該角度開(kāi)展針灸治療心肌缺血機(jī)制研究的新方向。2.1表觀遺傳調(diào)控與心肌缺血的相關(guān)性以動(dòng)物和人為載體的研究都表明,心肌缺血與表觀遺傳調(diào)控密切相關(guān)。表觀遺傳標(biāo)記物在心肌缺血發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的變化,反映出DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑及微小RNA是調(diào)控心肌缺血的關(guān)鍵因素。大鼠神經(jīng)甲基化系統(tǒng)在心肌缺血中受到抑制,可導(dǎo)致缺血部位的兒茶酚胺濃度升高,作用于心臟,使心率加快,收縮力增強(qiáng),心輸出量增加;懷孕期間的營(yíng)養(yǎng)不良會(huì)改變DNA甲基化,增加成年后患心血管病的風(fēng)險(xiǎn),且DNA甲基化在6個(gè)特殊位點(diǎn)對(duì)產(chǎn)前環(huán)境很敏感,可能提高婦女患心肌缺血的風(fēng)險(xiǎn)[20-22]。同時(shí),有研究認(rèn)為,組蛋白H3賴(lài)氨酸4甲基化(H3K4me)轉(zhuǎn)移酶和它們的輔助因子是調(diào)控胚胎發(fā)育及細(xì)胞特異性的重要因素[23];而Smyd2作為一種組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶,介導(dǎo)H3K4甲基化,改變心肌細(xì)胞組蛋白甲基化修飾和心肌細(xì)胞靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,促進(jìn)心肌細(xì)胞分化和發(fā)育[24-25]。最新研究報(bào)道組蛋白H3賴(lài)氨酸27去甲基化酶賴(lài)氨酸K特異性脫甲基6A(UTX)可以促進(jìn)心肌細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育,UTX基因敲除小鼠因心臟發(fā)育障礙死于胚胎發(fā)育早期[26]。除甲基化之外,組蛋白的乙?；谛募∪毖械淖饔檬艿綇V泛關(guān)注。發(fā)生心肌缺血后,心肌細(xì)胞蛋白發(fā)生了去乙?；?抑制去乙?；瘎t能減少其損傷,組蛋白去乙?；?HDAC)抑制劑通過(guò)組蛋白去乙?；窼irt1介導(dǎo),后者含量增加,能有效促進(jìn)心肌缺血耐受,誘導(dǎo)心肌保護(hù)[27-29]。HDAC-7抑制劑可與缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)結(jié)合影響基因轉(zhuǎn)錄,增強(qiáng)HIF活性,從而促進(jìn)心臟血管新生[30-31]。同時(shí),HDAC抑制劑曲古柳菌素A可降低缺血心肌凋亡基因Caspase3表達(dá),抑制心肌細(xì)胞凋亡,也可促進(jìn)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化,介導(dǎo)心肌細(xì)胞再生[32-33]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),組蛋白H3賴(lài)氨酸9乙?；?H3K9ace)與缺血心肌保護(hù)密切相關(guān),通過(guò)調(diào)節(jié)血管再生因子、細(xì)胞凋亡因子和HSP基因表達(dá)達(dá)到抗缺血性損傷效果。其中VEGF、Sirt1與組蛋白賴(lài)氨酸乙?；P(guān)系最為密切[34-39]。除組蛋白修飾之外,microRNA上調(diào)或下調(diào)通過(guò)作用于靶基因激活相應(yīng)的分子信號(hào)通路參與心肌保護(hù),調(diào)控心肌缺血損傷。染色體重塑也被證明與心肌細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)[40-41]。

    總之,DNA甲基化、組蛋白修飾、微小RNA等表觀遺傳調(diào)控在心肌缺血過(guò)程中具有重要意義。2.2表觀遺傳調(diào)控與針灸防治心肌缺血機(jī)制研究從上述表觀遺傳調(diào)控與心肌缺血的相關(guān)研究成果可知,表觀遺傳調(diào)控介導(dǎo)細(xì)胞凋亡、心肌細(xì)胞保護(hù)和心臟血管再生,在心肌缺血發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有特殊地位,是目前醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。從該角度切入進(jìn)行針灸防治心肌缺血研究,必然是今后研究的一個(gè)新方向。同時(shí),結(jié)合表觀遺傳調(diào)控自身特性,即強(qiáng)調(diào)除了DNA和RNA序列以外,還有許多調(diào)控基因信息,雖然本身不改變基因的序列,但其通過(guò)基因修飾、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、DNA和其它分子的相互作用,多層次、多途徑影響和調(diào)節(jié)遺傳基因的功能和特性,這些調(diào)節(jié)同時(shí)存在可逆性。這與針灸作用整體性、綜合性、雙向性、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)具有一定的相似性。因此,將表觀遺傳學(xué)的理念和技術(shù)引入針灸抗心肌缺血機(jī)制研究,乃至整個(gè)針灸研究領(lǐng)域,都具有較強(qiáng)的可行性。結(jié)合針灸自身優(yōu)勢(shì)特點(diǎn),以及其抗心肌缺血研究現(xiàn)狀,融合上述表觀遺傳調(diào)控在心肌缺血發(fā)生發(fā)展過(guò)程的作用特點(diǎn),我們認(rèn)為,今后的研究可從兩個(gè)方面進(jìn)行,一是針灸對(duì)心肌缺血疾病的預(yù)防。治未病思想歷來(lái)是中醫(yī)理論的核心,早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中就強(qiáng)調(diào)“不治已病治未病”?，F(xiàn)代研究證實(shí),針刺具有提高機(jī)體機(jī)能的作用,如實(shí)施心肌缺血再灌注手術(shù)前針灸“內(nèi)關(guān)”穴,能提高心肌細(xì)胞耐缺血能力,延長(zhǎng)動(dòng)物生存期,這無(wú)疑為心肌缺血患者贏得了寶貴的搶救時(shí)間[42]。而表觀遺傳調(diào)控與之密切相關(guān),HDAC直接參與耐缺血,如果以此進(jìn)行深入研究,一旦得以證實(shí),將為臨床進(jìn)行再通手術(shù)前實(shí)施針灸干預(yù)的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)[43]。另一方面,則是在現(xiàn)有的研究基礎(chǔ)上,繼續(xù)深入探討針灸抗心臟缺血機(jī)制研究。根據(jù)心肌缺血的不同階段,有重點(diǎn)地開(kāi)展相應(yīng)研究。如急性期、亞急性期,主要圍繞針灸促心肌細(xì)胞存活、抑制細(xì)胞凋亡,以及改善能量代謝,從而實(shí)現(xiàn)心肌細(xì)胞保護(hù)進(jìn)行研究。針灸能有效調(diào)控心肌組織中Sirt1、HSP70、Caspase3、c-fos、Bcl-2等物質(zhì)的表達(dá),實(shí)現(xiàn)保護(hù)心肌目的,但其背后的調(diào)控機(jī)制如何,尚未得到證明。研究表明,HDAC能有效調(diào)控Caspase3表達(dá),H3K9ace能影響HSP70水平等,從這些角度深入揭示針灸促心肌保護(hù)機(jī)制,將為針灸的更廣泛應(yīng)用提供基礎(chǔ)。在慢性期,則主要圍繞促進(jìn)血管新生開(kāi)展。已有的研究證實(shí)針灸能促缺血區(qū)域的血管新生,且與VEGF密切相關(guān),但調(diào)控VEGF表達(dá)發(fā)生改變的機(jī)制并未得到證明。腫瘤存在大量的新生血管,研究中發(fā)現(xiàn),H3K9ace在此過(guò)程中扮演重要角色,我們可以推測(cè),在針灸促VEGF表達(dá),介導(dǎo)血管新生過(guò)程中,H3K9ace可能具有重要意義。同時(shí),也可以充分結(jié)合針灸抗心肌缺血機(jī)制研究成果,著重篩選出相應(yīng)優(yōu)勢(shì)靶點(diǎn),進(jìn)行新藥開(kāi)發(fā),或許可能成為新藥開(kāi)發(fā)的新靶點(diǎn)。除此之外,還可進(jìn)行相應(yīng)的拓展。研究表明,心臟中存在心肌干細(xì)胞,在某些影響因素干預(yù)下,能不斷增殖、分化形成新的心肌干細(xì)胞。這個(gè)過(guò)程中表觀遺傳調(diào)控發(fā)揮重要作用[44]。針灸有促體內(nèi)干細(xì)胞增殖、分化的能力,比如促腦內(nèi)神經(jīng)發(fā)生,實(shí)現(xiàn)腦保護(hù)[44-45]。那么針灸是否也能促進(jìn)心臟干細(xì)胞增殖、分化,實(shí)現(xiàn)心肌保護(hù)?從表觀遺傳學(xué)的角度研究,也將成為我們關(guān)注的方向。

篇7

【關(guān)鍵詞】 輔助生殖技術(shù)；妊娠早期；染色體異常

DOI：10.14163/ki.11-5547/r.2017.04.042

近年來(lái)， 助生殖技術(shù)（assisted reproductive technology， ART）V泛用于治療不孕問(wèn)題， 相關(guān)研究顯示[1]， 發(fā)達(dá)國(guó)家每年有≥3%的輔助生殖技術(shù)出生兒， 輔助生殖技術(shù)為不孕家庭帶來(lái)了福音。自然流產(chǎn)是一種人類(lèi)優(yōu)勝劣汰的自然選擇結(jié)果， 發(fā)生自然流產(chǎn)的幾率為15%， 在全部流產(chǎn)中占75%的比例， 導(dǎo)致自然流產(chǎn)的主要原因是染色體異常（夫妻染色體異常與胚胎染色體異常）。近30年來(lái)， 輔助生殖技術(shù)得到了高速發(fā)展， 但有相關(guān)報(bào)道指出[2， 3]， 輔助生殖技術(shù)致早期妊娠流產(chǎn)率較高， 為此， 本院對(duì)400例流產(chǎn)患者進(jìn)行了絨毛細(xì)胞分離和染色體分析， 現(xiàn)做如下報(bào)告。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取2015年1月～2016年1月本院收治的孕早期流產(chǎn)患者400例， 將其中320例自然妊娠孕早期自然流產(chǎn)患者作為對(duì)照組， 80例因輔助生殖技術(shù)致妊娠的孕早期自然流產(chǎn)患者作為觀察組。觀察組患者年齡22～43歲， 平均年齡（33.6±3.3）歲， 孕周7～12周；對(duì)照組患者年齡25～44歲， 平均年齡（31.2±5.2）歲， 孕周7～12周。兩組患者一般資料比較， 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）， 具有可比性。在告知兩組患者實(shí)驗(yàn)過(guò)程及目的后， 均表示愿意參加實(shí)驗(yàn)并簽署知情同意書(shū)， 實(shí)驗(yàn)獲得了醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1. 2 方法 先提取絨毛細(xì)胞， 對(duì)流產(chǎn)的患者進(jìn)行子宮清宮術(shù)， 備好負(fù)壓吸引管， 清宮時(shí)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)程， 采用負(fù)壓吸引管利用負(fù)壓原理， 吸附絨毛組織5～20 mg。將這5～20 mg絨毛組織作為標(biāo)本， 放入生理鹽水中浸泡， 并立即送入中心實(shí)驗(yàn)室備檢。標(biāo)本送達(dá)后， 立對(duì)絨毛組織標(biāo)本進(jìn)行分離培養(yǎng)， 采用雙抗清洗法清洗標(biāo)本， 去污物（血塊、蛻膜組織）， 保留典型的絨毛組織約10 mg， 將清洗后的標(biāo)本放入離心管置入離心機(jī)進(jìn)行離心操作， 離心結(jié)束后觀察管內(nèi)分層， 去除上層的液體， 在下層滴入生物酶（膠原酶、胰酶）， 將標(biāo)本放入保溫箱， 仔細(xì)觀察并記錄， 待出現(xiàn)絨毛散開(kāi)現(xiàn)象時(shí)， 立即滴入母牛血清， 采用電子顯微鏡觀察絨毛細(xì)胞形態(tài)。當(dāng)視野中出現(xiàn)成片狀細(xì)胞， 將標(biāo)本放入新鮮的培養(yǎng)液中并滴入生物堿（秋水仙素）， 再次放置在保溫箱內(nèi)， 放置時(shí)間為4 h， 然后去掉上層清夜， 將標(biāo)本置入水浴箱， 2 h后取出， 將標(biāo)本放入離心機(jī)再次離心， 將離心后的標(biāo)本去上清液制成懸液， 通過(guò)萊卡顯微鏡進(jìn)行觀察， 選擇兩名醫(yī)生同時(shí)讀標(biāo)本玻片， 每例計(jì)算20個(gè)分裂象， 分析2個(gè)核型（嵌合體加倍計(jì)數(shù)）。

1. 3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗(yàn)。P

2 結(jié)果

觀察組患者中

3 討論

輔助生殖技術(shù)是治療不孕不育的一種手段， 有體外受精-胚胎移植（IVF-ET）、卵子體外成熟（IVM）、人工受精（AI） 等形式[4]。根據(jù)WTO的相關(guān)數(shù)據(jù)顯示[5-9]， 我國(guó)的不孕癥發(fā)病率高達(dá)15%， 傳統(tǒng)的治療遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足日益增長(zhǎng)的不孕不育患者的治療需要。

自然流產(chǎn)是妊娠過(guò)程中常見(jiàn)的并發(fā)癥， 而染色體異常則是自然流產(chǎn)的主要原因之一， 包括夫妻染色體異常和胚胎染色體異常[10-12]。夫婦染色體異常常見(jiàn)的有平衡易位和羅伯遜易位， 胚胎染色體異常常見(jiàn)的有三倍體、多倍體及染色體平衡易位、嵌合體等。與自然流產(chǎn)相比， 輔助生殖技術(shù)妊娠不增加妊娠早期流產(chǎn)率， 但是與流產(chǎn)孕婦的年齡存在著一定的關(guān)系。本研究通過(guò)對(duì)流產(chǎn)的患者進(jìn)行子宮清宮術(shù)， 清宮時(shí)采用負(fù)壓吸引管利用負(fù)壓原理， 取出絨毛組織5～20 mg作為實(shí)驗(yàn)標(biāo)本， 將其放入生理鹽水中浸泡， 然后對(duì)絨毛組織標(biāo)本進(jìn)行分離培養(yǎng)， 采用雙抗清洗法清洗標(biāo)本， 去除血塊及蛻膜組織， 保留典型的絨毛組織， 進(jìn)行離心操作， 觀察標(biāo)本現(xiàn)象。發(fā)現(xiàn)自然妊娠孕早期自然流產(chǎn)患者的絨毛細(xì)胞染色體異常率與輔助生殖技術(shù)致妊娠早期自然流產(chǎn)患者的絨毛細(xì)胞染色體異常率無(wú)明顯差異（P>0.05）， 但是不同年齡間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

相關(guān)研究顯示[2]， 輔助生殖技術(shù)能影響表觀遺傳（印記基因）的調(diào)控， 影響胚胎植入和胎兒生長(zhǎng)等， 表觀遺傳學(xué)方面的異常能使胚胎停育， 基因印記缺陷會(huì)導(dǎo)致早期妊娠的不穩(wěn)定易發(fā)生流產(chǎn)[1]。控制性招促排卵過(guò)程中， 大劑量促性腺激素的使用， 可能是引起配子及胚

胎印記異常， 輔助生殖技術(shù)實(shí)施時(shí)間正處于印跡重建的窗口期， 運(yùn)用于當(dāng)中的操作會(huì)對(duì)配子及胚胎的甲基化狀態(tài)發(fā)生一定的影響。

本文研究結(jié)果顯示， 觀察組患者中

綜上所述， 輔助生殖技術(shù)并不增加妊娠早期流產(chǎn)胚胎染色體異常的發(fā)生率， 但絨毛細(xì)胞染色體異常與育齡婦女的年齡有明顯的關(guān)系， 年紀(jì)≥40歲的患者采用輔助生殖技術(shù)妊娠更容易導(dǎo)致妊娠早期流產(chǎn)。

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篇8

【關(guān)鍵詞】 丙戊酸鈉 性粒細(xì)胞白血病 K562細(xì)胞 增殖 凋亡

of sodium valproate（VPA） on the proliferation of chronic myeloid leukemia cell line K562，and to explore possible mechanisms． 【Methods】 K562 cells were treated with VPA． Cell proliferation was determined by CCK-8 assay． Cell apoptosis and cell cycle were analyzed by flow cytometry （FCM）． 【Results】 VPA inhibited the proliferation of K562 cells in concentration- and time-dependent manners． The apoptosis rate was significantly higher in the cells treated with VPA than in untreated cells［（11．47％±0．25％）vs（4．77％±0．40％）， P ＜ 0．05］． After treatment of VPA， cell cycle was arrested obviously at G0／G1 phase （P ＜ 0．05）． 【Conclusions】 VPA could induce G0／G1 phase arrest， inhibit the proliferation and induce the apoptosis of K562 cells in vitro．

Key words： sodium valproate； chronic myeloid leukemia； K562 cell； proliferation； apoptosis

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)組蛋白去乙酰化酶抑制劑（histone deacetylase inhibitors，HDACI）可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)阻滯、分化及凋亡［1-3］。丙戊酸鈉（sodium valproate，VPA）是一種傳統(tǒng)的抗癲癇藥物，其在抗癲癇有效治療濃度時(shí)也表現(xiàn)出很強(qiáng)的HDACI活性［4］；慢性粒細(xì)胞白血病是臨床上一種比較常見(jiàn)的惡性血液病，t（9；22）形成Ph染色體是其特征性細(xì)胞遺傳學(xué)改變，由此形成的Bcr／Abl融合基因是其發(fā)病的分子機(jī)制和新藥物（如格列衛(wèi)）作用靶點(diǎn)。盡管格列衛(wèi)取得了極好的療效，但臨床仍然觀察到耐藥的情況［5］。所以為了克服耐藥，臨床上迫切需要開(kāi)發(fā)新一代作用于Bcr／Abl融合基因的靶向藥物或其他不同機(jī)制的抗腫瘤藥物。本實(shí)驗(yàn)探討了VPA對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病急變期細(xì)胞株K562細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響。

1 材料和方法

1．1 主要試劑

VPA購(gòu)自法國(guó)賽諾菲安萬(wàn)特公司。1640培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品，胎牛血清（fetal calf serium， FCS） 購(gòu)自杭州四季青生物公司。CCK-8試劑盒為碧云天公司產(chǎn)品，AnnexinV-FITC 凋亡和細(xì)胞周期分析試劑盒為Becton Dickinson 公司產(chǎn)品。K562細(xì)胞株由中山大學(xué)腫瘤研究所提供。

1．2 方 法

1．2．1 細(xì)胞培養(yǎng)

K562細(xì)胞用含100 g／L滅活FCS的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸后，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5％ CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 ～ 3天換液1次。

1．2．2 CCK-8方法分析細(xì)胞增殖活性

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞終密度為1 × 105／mL 接種于96 孔板，分別加入0．5、1、2、5、10 和25 mmol／L的VPA，每孔總體積為200 μL，另設(shè)空白孔和對(duì)照孔，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，于加藥后72 h檢測(cè)，每孔避光加入20 ?滋L CCK-8，繼續(xù)孵育2 h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)A值，波長(zhǎng)450 nm。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。以藥物濃度為橫坐標(biāo)，生長(zhǎng)抑制率為縱坐標(biāo)，繪制濃度-生長(zhǎng)抑制率曲線(xiàn)。生長(zhǎng)抑制率＝［（A對(duì)照－A空白）－（A實(shí)驗(yàn)－A空白）］／（A對(duì)照－A空白） ×100％。另外，通過(guò)上述試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算出IC50值，然后以接近IC50值的濃度的VPA處理K562細(xì)胞，分別于加藥后0，12，24，36，48，60和72 h檢測(cè)，并計(jì)算出生長(zhǎng)抑制率，以分析作用時(shí)間對(duì)細(xì)胞增殖的影響。

1．2．3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562細(xì)胞以5 × 106／mL種于6孔板中，分為對(duì)照組、VPA（2 mmol／L）組，加藥48 h后，收集各組細(xì)胞，PBS洗2次，離心棄上清，700 mL／L冷乙醇4 ℃固定過(guò)夜后。離心棄去固定液，3 mL PBS重懸5 min，400目的篩網(wǎng)過(guò)濾1次，離心5 min，棄去PBS。用1 mL PI染液染色，4 ℃避光30 min。上機(jī)檢測(cè)，進(jìn)行結(jié)果分析。

1．2．4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562細(xì)胞以5 × 106／mL種于6孔板中，分為對(duì)照組、VPA（2 mmol／L）組，加藥48 h后，收集各組細(xì)胞，PBS洗2次，離心棄上清，懸溶于結(jié)合緩沖液中，調(diào)整細(xì)胞濃度為1 × 106個(gè)／mL。加10 μL異硫氰酸熒光素（ FTIC） 標(biāo)記的連接素（Annexin） 和10 μL的20 mg／ L的普匹碘氨（ PI） ，混勻，避光室溫孵育10 min。用結(jié)合緩沖液洗1次后用Coulter Elite 流式細(xì)胞儀（Coulter 公司） 進(jìn)行分析。Annexin V（－） PI （－） 為活細(xì)胞，Annexin V（－） PI （＋） 為機(jī)械損傷細(xì)胞， Annexin V（＋） PI（－） 為早期凋亡細(xì)胞， Annexin V（＋） PI （＋） 為晚期凋亡細(xì)胞， 實(shí)驗(yàn)中以Annexin V（＋） 作為凋亡細(xì)胞。

1．2．5 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 11．5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用x±s表示，多組間比較進(jìn)行單因素方差分析，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，P ＜ 0．05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 VPA對(duì)K562細(xì)胞的增殖抑制作用

不同濃度（0．5 ～ 25 mmol／L）的VPA均可抑制K562細(xì)胞生長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝15．32， P ＜ 0．05）；并且VPA對(duì)K562細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用在一定濃度范圍內(nèi)呈濃度依賴(lài)性（圖1）。用接近IC50濃度（2 mmol／L）的VPA處理K562細(xì)胞不同時(shí)間后，結(jié)果顯示隨著孵育時(shí)間延長(zhǎng)其生長(zhǎng)抑制作用明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝103．77， P ＜ 0．05）。這反映VPA對(duì)K562細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用在一定時(shí)間內(nèi)也具有時(shí)間依賴(lài)性（圖2）。

2．2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)K562細(xì)胞凋亡

用2 mmol／L的VPA處理K562細(xì)胞在48 h后，以Annexin V／PI雙標(biāo)記后通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果顯示VPA處理組細(xì)胞凋亡率高于未處理對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t ＝ 24．375， P ＜ 0．05， 表1）。

2．3 流式細(xì)胞儀分析K562細(xì)胞周期

用2 mmol／L的VPA作用K562細(xì)胞48 h后，細(xì)胞周期進(jìn)程被阻滯，G0／G1期細(xì)胞明顯較未處理組增加（t ＝ 7．561，P ＝ 0．002），而S期細(xì)胞較未處理組明顯減少（t ＝ 8．70， P ＝ 0．001），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1， 圖3）。

3 討 論

表觀遺傳學(xué)修飾是基因表達(dá)的主要調(diào)節(jié)方式，包括DNA甲基化、組蛋白乙?；蚏NA干擾等。表觀遺傳在轉(zhuǎn)錄調(diào)控上起著極為重要的作用，組蛋白高乙酰化和DNA啟動(dòng)子序列低甲基化可促進(jìn)基因表達(dá)，而組蛋白去乙?；虳NA啟動(dòng)子序列高甲基化可抑制基因的表達(dá)，這兩種機(jī)制相互協(xié)調(diào)，共同實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的精細(xì)調(diào)控［6］。近年來(lái)研究表明，表觀遺傳學(xué)改變?cè)谀[瘤發(fā)生中扮演一個(gè)重要角色。腫瘤發(fā)生的主要表觀遺傳學(xué)改變是抑制腫瘤生長(zhǎng)的基因發(fā)生DNA啟動(dòng)子序列過(guò)甲基化和染色質(zhì)中的組蛋白去乙酰化修飾。惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中常涉及組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase， HDAC）的異常聚集，引起在細(xì)胞發(fā)育、分化、凋亡過(guò)程中起重要作用的基因表達(dá)受抑，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生［7］。HDACI可以通過(guò)抑制HDAC活性，誘導(dǎo)組蛋白高乙?；{(diào)節(jié)基因表達(dá)，從而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)［8］。目前已有多種HDACI 進(jìn)入了Ⅰ／Ⅱ期臨床試驗(yàn)。VPA是一種傳統(tǒng)的抗癲癇藥物，毒副作用輕微，長(zhǎng)期使用患者耐受性好，其在抗癲癇有效治療濃度時(shí)也表現(xiàn)出很強(qiáng)的HDACI活性，可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯、凋亡和分化而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖［4，9］；對(duì)腫瘤細(xì)胞有選擇性細(xì)胞毒性，而對(duì)正常造血細(xì)胞無(wú)嚴(yán)重毒性，且與多種化療藥物有協(xié)同作用［10］。HDACI的應(yīng)用標(biāo)志著一種全新的腫瘤治療途徑，因此研究HDACI 是通過(guò)何種機(jī)制來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用有著積極的實(shí)際意義。

慢性粒細(xì)胞白血病是臨床上一種比較常見(jiàn)的惡性血液病，盡管近幾年來(lái)以Bcr／Abl融合基因的產(chǎn)物P210蛋白作為靶點(diǎn)的新藥——伊馬替尼（格列衛(wèi)）取得了極好的臨床效果，但是在加速期和急變期患者中仍然觀察到了原發(fā)性和繼發(fā)性耐藥的現(xiàn)象［5］。所以臨床上需要開(kāi)發(fā)新一代作用于P210融合蛋白的靶向藥物或其他不同機(jī)制的抗腫瘤藥物。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了傳統(tǒng)的抗癲癇藥物同時(shí)也是一種HDACI的VPA對(duì)K562細(xì)胞的生長(zhǎng)具有劑量－時(shí)間依賴(lài)性的抑制作用；同時(shí)2 mmol／L的VPA作用48 h后K562細(xì)胞凋亡較對(duì)照組增加。這說(shuō)明VPA可能是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)抑制K562細(xì)胞增殖的。VPA引起細(xì)胞凋亡的具體分子機(jī)制現(xiàn)在尚未完全闡明。Caspase-3是凋亡效應(yīng)分子之一，其可以被多種內(nèi)外源性凋亡誘導(dǎo)因子激活從而引起細(xì)胞發(fā)生凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)VPA可引起多種白血病細(xì)胞株發(fā)生caspase-3依賴(lài)性的凋亡，同時(shí)它還可以通過(guò)不依賴(lài)caspase-3活化的途徑引起細(xì)胞凋亡［11］。所以我們推測(cè)其引起K562細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制也有可能比較復(fù)雜，需要進(jìn)一步研究。

此外，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)HDACI對(duì)腫瘤細(xì)胞具有阻滯周期進(jìn)程的作用。Sakura等［12］將VPA和SAHA（suberoylanilide hydroxamic acid）這兩種HDACI作用于14種淋巴系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞株后，細(xì)胞發(fā)生了G1或G2／M阻滯及凋亡，并且與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)有關(guān)的p53、p21和p27基因出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)。本實(shí)驗(yàn)中VPA處理后G0／G1期細(xì)胞比例增加，同時(shí)S期細(xì)胞比例下降。這說(shuō)明VPA可以使K562細(xì)胞周期進(jìn)程受到阻滯。其分子機(jī)制也可能是上調(diào)p21WAF1等細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，而增多的p21WAF1與CDK結(jié)合，抑制CDK活性，從而引起細(xì)胞周期停滯，最終可能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，VPA能夠抑制慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞的生長(zhǎng)，并可誘導(dǎo)其凋亡和細(xì)胞周期阻滯，這為慢性粒細(xì)胞白血病患者的治療提供了新的途徑及一定的理論依據(jù)。

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篇9

1.1方法

1.1.1細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理：MKN1細(xì)胞株用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)、傳代。實(shí)驗(yàn)用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)至60%匯合度時(shí)，分別加入2μmol/L或10μmol/L的5⁃Aza⁃CdR處理液，對(duì)照組使用不含5⁃Aza⁃CdR的普通完全培養(yǎng)液。每隔24h換液1次，培養(yǎng)72h后處理細(xì)胞用于后續(xù)的相關(guān)檢測(cè)。

1.1.2亞硫酸氫鹽修飾DNA和BSP反應(yīng)：采用Blood＆CellCultureDNAMiniKit試劑盒，按說(shuō)明書(shū)步驟提取各組細(xì)胞基因組DNA。取500ngDNA按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾及純化。使未甲基化的胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶（T），而甲基化的Cm不變。以修飾后基因組DNA為模板，用GoT⁃aqDNA聚合酶進(jìn)行BNIP3基因啟動(dòng)子擴(kuò)增。用MethPrimer軟件設(shè)計(jì)甲基化引物，上游：5′⁃TTAAAGTGTTGAGATGAAAGATATG⁃3′，下游：5′⁃AATCCAAATCCAAATATCAAAATAC⁃3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為288bp。反應(yīng)條件為95℃10min，95℃30s、56℃30s、72℃30s進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，然后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳，應(yīng)用膠回收試劑盒回收，純化目的片段，連接pGEM⁃T載體，4℃孵育過(guò)夜。取6μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)大腸桿菌，藍(lán)白篩選陽(yáng)性克隆，送菌液測(cè)序。

1.1.3RT⁃PCR檢測(cè)BNIP3基因表達(dá)：采用Axy⁃PrepTotalRNAMiniprepKit試劑盒提取各組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)成cDNA后進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)，BNIP3引物序列：上游：5′⁃CCACCTCGCTCGCAGACACCAC⁃3′，下游：5′⁃GAGAGCAGCAGAGATGGAAGGAAAAC⁃3′，長(zhǎng)度為317bp。作為內(nèi)參的人β⁃actin引物序列：上游：5′⁃CCAGATCATGTTTGAGACCT⁃3′；下游：5′⁃TTGAAGGTAGTTTCGTGGAT⁃3′，長(zhǎng)度為480bp。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃5min變性，95℃復(fù)性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min，4℃暫時(shí)保存。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。產(chǎn)物行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)（Tanon⁃2500R）拍照及分析表達(dá)情況。

1.1.4染色質(zhì)免疫沉淀：采用ChIP試劑盒按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行如下操作：用1%甲醛PBS交聯(lián)固定蛋白質(zhì)－DNA復(fù)合物，加入交聯(lián)終止液5min，2500r/min、4℃離心10min，PBS洗脫2次；加裂解液冰上裂解5min，酶法消化切割至200~1000bp的染色質(zhì)小片段；之后，染色質(zhì)與DNMT1特異性抗體及DNA/Pro⁃teinGAgorose4℃顛轉(zhuǎn)過(guò)夜，洗脫蛋白/DNA復(fù)合物，純化回收DNA。針對(duì)BNIP3啟動(dòng)子區(qū)的引物序列：上游：5′⁃CCGCGCCGCCTCCTCCGCCTCAC⁃3′；下游：5′⁃GCTCCGACCTCCGCTTTCCCACCGCC⁃3′。PCR擴(kuò)增條件：95℃5min，95℃30s，59℃30s，72℃30s，72℃10min，30個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)（Tanon⁃2500R）拍照及分析表達(dá)情況。

1.2統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)用x±s表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間比較采用t檢驗(yàn)，甲基化率比較用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1MKN1細(xì)胞中BNIP3基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)

2.1.1BNIP3基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島序列分析：在ENSEMBLE上找到BNIP3基因啟動(dòng)子區(qū)的原始序列，利用MethPrimer分析，按照“長(zhǎng)度超過(guò)200bp，GC含量大于50%，CpG出現(xiàn)率（觀察值／預(yù)測(cè)值比例）≥0.6”的參數(shù)定義［8］，可以找到BNIP3基因啟動(dòng)子區(qū)自轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游966bp至下游86bp之間長(zhǎng)度為1052bp的CpG島。圖1為BSP法擬分析其中長(zhǎng)288bp、含14個(gè)CpG位點(diǎn)的DN段。

2.1.2BSP結(jié)果：以亞硫酸氫鹽修飾后的DNA為模板行PCR，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接T載體，轉(zhuǎn)化增菌，PCR擴(kuò)增鑒定陽(yáng)性克隆。圖2為隨機(jī)挑取的5個(gè)克隆的菌液PCR鑒定結(jié)果，在約288bp處可見(jiàn)理想的目的條帶。

2.1.3測(cè)序結(jié)果分析：陽(yáng)性克隆進(jìn)一步測(cè)序，將亞硫酸氫鹽修飾后的序列與原序列進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)非CpG位點(diǎn)的“C”全部轉(zhuǎn)化為“T”，證明亞硫酸氫鹽修飾效果可信。擴(kuò)增的BNIP3啟動(dòng)子區(qū)片段包含有14個(gè)CpG位點(diǎn)，與原始BNIP3基因序列比對(duì)，各CpG位點(diǎn)甲基化概率分別為100%、80%、100%、100%、80%、100%、100%、100%、80%、100%、100%、80%、100%、100%。見(jiàn)圖3及圖4。

2.25⁃Aza⁃CdR對(duì)MKN1細(xì)胞中BNIP3表達(dá)的影響采用不同濃度5⁃Aza⁃CdR處理MKN1細(xì)胞，作用72h后，對(duì)照組、2μmol/L5⁃Aza⁃CdR處理組和10μmol/L5⁃Aza⁃CdR組的BNIP3mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.389±0.018，0.515±0.024，0.839±0.014。10μmol/L5⁃Aza⁃CdR組的BNIP3mRNA表達(dá)量較對(duì)照組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)圖5。

2.35⁃Aza⁃CdR對(duì)MKN1細(xì)胞中BNIP3基因啟動(dòng)子甲基化的影響10μmol/L的5⁃Aza⁃CdR處理細(xì)胞72h后，BNIP3基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)有所逆轉(zhuǎn)（圖6），啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)甲基化率（74.2%±9.37%）與對(duì)照組（圖4）甲基化率（94.3%±19.80%）比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.4BNIP3啟動(dòng)子與DNMT1蛋白的結(jié)合用ChIP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MKN1細(xì)胞中DNMT1與BNIP3啟動(dòng)子區(qū)DNA的結(jié)合。結(jié)果顯示，在對(duì)照組可以檢測(cè)到DNMT1與BNIP3啟動(dòng)子區(qū)DNA的結(jié)合，而10μmol/L的5⁃Aza⁃CdR處理組與對(duì)照組相比DNMT1與BNIP3啟動(dòng)子區(qū)DNA的結(jié)合明顯減少。見(jiàn)圖7。

3討論

DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)修飾的重要作用方式之一，指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下，在基因組CpG二核苷酸的胞嘧啶5′碳位共價(jià)鍵結(jié)合一個(gè)甲基基團(tuán)。越來(lái)越多的研究表明，DNA甲基化在癌癥的發(fā)生機(jī)制中扮演重要角色。正常生理?xiàng)l件下，人類(lèi)基因組中位于啟動(dòng)子區(qū)、富含CpG二核苷酸的CpG島處于非甲基化狀態(tài)，抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島過(guò)度甲基化可誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄失活、表達(dá)沉默。BNIP3是Bcl⁃2家族中BH3⁃only亞家族的成員，具有BH3結(jié)構(gòu)域和跨膜區(qū)，屬于促凋亡蛋白，通過(guò)促進(jìn)線(xiàn)粒體通透性、轉(zhuǎn)運(yùn)開(kāi)放和線(xiàn)粒體的損傷誘導(dǎo)凋亡。Murai等［3］在66%的結(jié)直腸癌和49%的胃癌中檢測(cè)到BNIP3表達(dá)缺失。Abe等發(fā)現(xiàn)在幾乎所有的胰腺癌組織和50%的胰腺癌細(xì)胞系中未檢測(cè)到BNIP3的表達(dá)，其失活機(jī)制和DNA啟動(dòng)子區(qū)高度甲基化相關(guān)。

目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于BNIP3基因的甲基化研究基本都局限于甲基化特異PCR法，此方法的特點(diǎn)是靈敏度高，但只能對(duì)引物序列中少量CpG位點(diǎn)進(jìn)行分析，具有一定的局限性。所以關(guān)于腫瘤細(xì)胞中BNIP3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的具點(diǎn)還不清楚。BSP克隆測(cè)序法具有能明確目的片段中每一個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)的優(yōu)勢(shì)，是公認(rèn)的DNA甲基化分析的金標(biāo)準(zhǔn)［7］。本研究利用MethPrimer軟件分析了MKN1細(xì)胞中BNIP3基因CpG位點(diǎn)分布情況。結(jié)果顯示，BNIP3基因啟動(dòng)子區(qū)自轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游966bp至下游86bp之間CpG位點(diǎn)分布密集，存在長(zhǎng)度為1052bp的CpG島。本研究中利用BSP克隆測(cè)序法對(duì)BNIP3基因啟動(dòng)子區(qū)中（+21bp~-267bp）長(zhǎng)288bp、包含14個(gè)CpG位點(diǎn)的DN段進(jìn)行甲基化水平的檢測(cè)，甲基化率為80%~100%。因此，首次明確了胃癌MKN1細(xì)胞中BNIP3基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化位點(diǎn)，并檢測(cè)到這些CpG位點(diǎn)呈現(xiàn)高度的甲基化。

我們進(jìn)一步用去甲基化藥物處理MKN1細(xì)胞，以明確啟動(dòng)子甲基化與BNIP3基因表達(dá)的關(guān)系。5⁃Aza⁃CdR是一種高效的DNMT抑制劑，它可與DNMT不可逆性結(jié)合，具有較強(qiáng)去甲基化作用，使表觀遺傳學(xué)沉默的基因去甲基化，逆轉(zhuǎn)其惡性表型。本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組MKN1細(xì)胞中BNIP3表達(dá)缺失，10μmol/L的5⁃Aza⁃CdR可誘導(dǎo)BNIP3mRNA表達(dá)明顯增加，BNIP3基因的啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)甲基化概率較對(duì)照組明顯下降，提示胃癌MKN1細(xì)胞中BNIP3基因表達(dá)缺失與啟動(dòng)子區(qū)高甲基化關(guān)系密切，該區(qū)域的CpG位點(diǎn)甲基化在調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮重要作用。

DNA甲基化是由DNMT催化完成的。DNMT1催化甲基基團(tuán)與胞嘧啶環(huán)的結(jié)合，維持DNA復(fù)制過(guò)程中的甲基化模式，在表觀遺傳修飾中發(fā)揮重要作用，其活性及表達(dá)水平與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。近年研究報(bào)道，DNMT1通過(guò)與靶基因啟動(dòng)子DNA序列結(jié)合，介導(dǎo)DNA甲基化，調(diào)節(jié)基因表達(dá)［12，13］。我們推測(cè)DNMT1是否參與介導(dǎo)BNIP3發(fā)生DNA甲基化的機(jī)制。我們利用ChIP技術(shù)檢測(cè)DNMT1與BNIP3啟動(dòng)子區(qū)DNA的結(jié)合狀態(tài)。結(jié)果顯示，MKN1細(xì)胞中DNMT1能與BNIP3啟動(dòng)子區(qū)DNA結(jié)合。5⁃Aza⁃CdR能夠明顯抑制DNMT1與BNIP3啟動(dòng)子的結(jié)合。提示5⁃Aza⁃CdR降低DNMT1與BNIP3啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合能力，部分逆轉(zhuǎn)BNIP3的甲基化狀態(tài)，是導(dǎo)致MKN1細(xì)胞中BNIP3表達(dá)上調(diào)的重要原因。

篇10

[關(guān)鍵詞]桔梗；同源四倍體；DNA甲基化；MSAP

[Abstract]In order to investigate the epigenetic variations between diploid and autotetraploid of Platycodon grandiflorus.the diploid buds of P. grandiflorus were soaked in the mixture of different concentration colchicines and 0.002 g?mL-1 dimethyl sulphoxide （DMSO）.The identification of autotetraploid plants were based on morphological characteristics，chromosome number and flow cytometry. And then the level and pattern of DNA methylation explored by using the technology of methylation sensitive amplified polymorphism （MSAP）.The result demonstrated that the buds soaked in 0.2% colchicines and 0.002 g?mL-1 DMSO solution for 12 h was ideal conditions to induce autotetraploid of P. grandiflorus，with induction rate of 32.0%.The diploid and tetraploid plants existed distinctly differences in morphological indexes.Totally，1 586 bands were amplified by 20 pairs of selective primers，of which 764 and 822 bands were detected in diploid and autotetraploid respectively.The total methylation ratio，full methylation ratio and hemimethylated ratio were 91.25%，61.25% and 30.65% in diploid of P. grandiflorus，respectively.However，the total methylation ratio，full methylation ratio and hemimethylated ratio of autotetraploid of P. grandiflorus were 86.13%，54.38% and 31.75%， respectively. Compared with diploid，the genomic DNA total methylate ratio and full methylation ratio of autotetration plants decreased by 6.02% and 7.14%.But the hemimethylated ratio of autotetraploid was higher than that of diploid，which more than 1.6%.All this results indicated that DNA methylation patterns have adjusted during the polyploidy process.

[Key words]Platycodon grandiflorus； autotetraploid； DNA methylation； MSAP

多倍體是指含有3套或3套以上完整染色體組的生物體[1]。由于多倍體將1個(gè)或多個(gè)整套染色體累加到基因組上，對(duì)生物體的基因組產(chǎn)生了一定沖擊，這種“基因組沖擊”使生物體的新陳代謝和基因調(diào)控等發(fā)生改變，從而使植株的形態(tài)器官、生理指標(biāo)、遺傳特性等產(chǎn)生變異[2-5]，這些變異會(huì)增強(qiáng)植株的生態(tài)適應(yīng)性和環(huán)境的抗逆性，降低蒸騰作用，提高光合效率等，對(duì)植株的生物量和某些次生代謝產(chǎn)物含量及品質(zhì)有促進(jìn)作用[6]。因此多倍體植物具有更大的生存潛能和更強(qiáng)的選擇優(yōu)勢(shì)。研究表明，多倍化不僅能導(dǎo)致植物的基因組結(jié)構(gòu)改變、堿基序列消除、轉(zhuǎn)座子激活等，還能影響表觀遺傳調(diào)控模式[7-8]。表觀遺傳變異是指不改變DNA堿基序的一種可遺傳的基因表達(dá)變化，包括DNA甲基化修飾、組蛋白的各種修飾等[9]，其中DNA甲基化修飾是研究多倍體表觀遺傳變異的最佳途徑之一[10]。DNA甲基化能在分子水平上對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，保護(hù)基因組結(jié)構(gòu)的完整性，并控制冗余基因的表達(dá)，保持多倍體植物基因組的穩(wěn)定性 [11-12]。多倍化能夠誘導(dǎo)DNA甲基化的改變，而DNA甲基化又在基因組調(diào)控和基因表達(dá)上起到一個(gè)樞紐的作用，因而用甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性技術(shù)（MSAP）研究不同倍性植株基因組DNA甲基化的表達(dá)水平及模式變化，在一定程度上對(duì)解釋多倍體植株出現(xiàn)的新的表型具有重要的意義。

目前多倍體方面的研究主要集中于異源多倍體的物種[13-16]，而對(duì)同源多倍體化后所產(chǎn)生的一系列變化方面的相關(guān)文章較少，這是因?yàn)楫愒炊啾扼w化后較同源多倍體化后引起的變化更為明顯[17-18]。但是，異源多倍體帶來(lái)的雜交效應(yīng)將混淆于倍性引起的后果[19]，因此，僅依賴(lài)于倍性調(diào)控變化方面的研究應(yīng)通過(guò)同源多倍體來(lái)體現(xiàn)，揭示僅由基因組加倍而不涉及雜交等其他因素所造成的基因組沖擊以及隨后多個(gè)基因組趨于穩(wěn)定的內(nèi)在機(jī)制也需通過(guò)同源多倍體的研究來(lái)闡明。

桔梗為常用大宗藥材，具有開(kāi)宣肺氣，祛痰排膿的功效[20]，在我國(guó)南北各地大面積栽培。但長(zhǎng)期以來(lái)只種不選，導(dǎo)致品種退化，藥材產(chǎn)量和品質(zhì)下降[21]。本研究在采用生物技術(shù)離體誘導(dǎo)并鑒定獲得桔梗同源四倍體的基礎(chǔ)上，采用甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性（MSAP）技術(shù)對(duì)二倍體和四倍體基因組DNA的甲基化變化情況進(jìn)行分析，一方面為桔梗的品種選育提供材料，另一方面從表觀遺傳學(xué)的角度探討桔梗四倍體表型變化的分子機(jī)制，為多倍體育種提供一定的理論依據(jù)。

1材料

挑選籽粒飽滿(mǎn)的桔梗種子，經(jīng)流水沖洗40 min后置于超凈工作臺(tái)，用75%乙醇消毒30 s后轉(zhuǎn)入0.1%升汞（HgCl2）中滅菌6 min，無(wú)菌水清洗3～5次，接入MS培養(yǎng)基，25～30 d后獲得桔梗無(wú)菌系。

2方法

2.1桔梗無(wú)菌快繁體系的建立和優(yōu)化

以桔梗幼芽為材料，接種到增殖和生根培養(yǎng)基上，增殖培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度6-BA（6-芐氨基嘌呤）、NAA（α-萘乙酸）和2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）；生根培養(yǎng)基以1/2MS為基本培養(yǎng)基，并添加不同濃度NAA（α-萘乙酸）和IBA（吲哚丁酸）進(jìn)行生根培養(yǎng)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，2。每個(gè)處理15個(gè)幼芽，5瓶重復(fù)，培養(yǎng)30 d后分別統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)和生根率。

2.2桔梗同源四倍體的離體誘導(dǎo)及鑒定

2.2.1桔梗同源四倍體的離體誘導(dǎo)具體方法參照王紅娟等[22]，并作適當(dāng)調(diào)整。質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%，0.1%，0.2%的秋水仙素（加0.02 g?mL-1二甲亞砜）混合液經(jīng)20 mL的注射器和0.22 μm的水系濾頭抽濾滅菌后將桔梗不定芽浸泡在其中，置于震動(dòng)搖床內(nèi)處理12，24，36，48，60 h，然后用無(wú)菌水沖洗3次后接種到MS培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。以清水浸泡作為對(duì)照，共15個(gè)處理，每個(gè)處理15個(gè)幼芽，做5次重復(fù)。

2.2.2桔梗同源四倍體的鑒定采用形態(tài)鑒別、流式細(xì)胞儀分析和根尖染色體鑒定相結(jié)合的方法來(lái)確定倍性株系。先將形態(tài)變異明顯的植株進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析，具體方法參照張俊娥等[23]，稱(chēng)取0.5 g組培苗葉片，用濾紙吸干水分后置于干凈培養(yǎng)皿中，加入2 mL預(yù)冷的組織解離液（80 mmol?L-1KCl，20 mmol?L-1NaCl，15 mmol?L-1Tris-HCl，20 mmol?L-1Na2EDTA，0.1% TritonX-100，2.0% PVP-K30，pH 7.5），用刀片一次性快速切碎葉片，過(guò)濾后于4 ℃環(huán)境下2 000 r?min-1離心5 min，漂洗2～3次，加入2 mL DAPI染液室溫下反應(yīng)1 h后即可上樣測(cè)定。流式細(xì)胞儀鑒定的株系進(jìn)一步采用根尖壓片法確定植株染色體數(shù)目。具體方法參照張振超等[24]，早上9：00～11：00點(diǎn)取幼苗根尖（0.5～1 cm），在0.002 mol?L-1的八羥基喹啉預(yù)處理2～3 h，于4 ℃冰箱中卡諾固定液（乙醇-冰醋酸 3∶1）處理24 h，在60 ℃的1 mol?L-1 HCL中解離8 min，卡寶品紅染色10 min，然后制片、鏡檢。

2.3總DNA提取

稱(chēng)取0.5 g二倍體和四倍體桔梗試管苗幼葉，采用改良的CTAB法進(jìn)行DNA提取，具體方法參照陳昆松等[25]，提取的DNA經(jīng)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定濃度和純度后用并1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，總DNA 置于-20 ℃冰箱待用。

2.4MSAP分析及聚丙烯酰胺凝膠電泳

2.4.1酶切、鏈接反應(yīng)MSAP試驗(yàn)步驟參照Portis等[26]方法，用雙切酶組合EcoRⅠ/HpaⅡ和EcoR Ⅰ/ MspⅠ對(duì)基因組DNA進(jìn)行酶切，在酶切片段的兩端加上人工設(shè)計(jì)的與EcoRⅠ和Hpa Ⅱ/Msp Ⅰ酶切位點(diǎn)互補(bǔ)的人工接頭，然后用AFLP擴(kuò)增體系進(jìn)行擴(kuò)增，接頭和引物序列見(jiàn)表3。引物由北京博友順生物科技有限公司合成。

2.4.2預(yù)擴(kuò)增、選擇性擴(kuò)增和電脈預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL，其中含有10 mmol?L-1 dNTPs 0.4 μL，10×Buffer 2 μL，5 U?μL-1Taq酶0.2 μL，10 μmol?L-1 E00-primer 0.5 μL，10 μmol?L-1 M00-primer 0.5 μL，其余用水補(bǔ)齊。反應(yīng)條件為：94 ℃ 30 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，26個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋20倍，供選擇擴(kuò)增用。

選擇擴(kuò)增體系同預(yù)擴(kuò)增體系，條件為：94 ℃ 30 s，65 ℃至56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，13個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)降0.7 ℃進(jìn)行降式PCR 擴(kuò)增；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，23個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

選擇性擴(kuò)增完成后在擴(kuò)增PCR產(chǎn)物中加入上樣緩沖液，94 ℃變性10 min 后然后立即轉(zhuǎn)移到冰上冷卻防止復(fù)性，取5 μL變性產(chǎn)物于6%變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行垂直電泳分析，銀染后觀察。

2.5條帶統(tǒng)計(jì)與數(shù)據(jù)處理

由于甲基敏感擴(kuò)增多態(tài)性技術(shù)中分別用EcoRⅠ/HpaⅡ和EcoRⅠ/MspⅠ雙切酶對(duì)基因組DNA進(jìn)行酶切。因此每個(gè)樣品同時(shí)擁有2條泳道：第1條泳帶采用EcoRⅠ/HpaⅡ進(jìn)行酶切，記為H，第2條泳帶采用EcoRⅠ/ MspⅠ進(jìn)行酶切，記為M。同一位點(diǎn)有條帶的記為“1”，無(wú)帶的記為“0”。

3結(jié)果與分析

3.1增殖及生根培養(yǎng)基優(yōu)化

將長(zhǎng)1.5～2 cm的桔梗不定芽接到7種增殖培養(yǎng)基中，經(jīng)30 d培養(yǎng)后均出現(xiàn)不定芽增殖的現(xiàn)象，具體結(jié)果見(jiàn)表4，在4號(hào)培養(yǎng)基中，分化的芽數(shù)最多，增殖系數(shù)平均達(dá)9.3±0.24，且出芽整齊，生長(zhǎng)健壯，葉色濃綠。因此，桔梗無(wú)菌苗增殖的最適培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.5 mg?L-1+ NAA 0.3 mg?L-1。

生根培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)表5，不同濃度的NAA和IBA對(duì)桔梗試管苗生根率、根生長(zhǎng)狀況均有影響，隨著NAA和IBA濃度的增大，生根率逐漸降低，且出根不整齊，根細(xì)短。當(dāng)培養(yǎng)基蔗糖含量為28 g?L-1，NAA質(zhì)量濃度為0.6 mg?L-1時(shí)，平均生根率高達(dá)82.6±3.8，且根粗壯，整齊。由此可見(jiàn)，桔梗的最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.6 mg?L-1。

3.2桔梗同源四倍體的誘導(dǎo)結(jié)果

將桔梗不定芽用抽濾滅菌的秋水仙素（加0.02 g?mL-1二甲亞砜）混合液浸泡處理后，成功得到了桔梗同源四倍體植株。誘導(dǎo)結(jié)果見(jiàn)表6，不同的質(zhì)量濃度和處理時(shí)間對(duì)不定芽的誘導(dǎo)效果不同，低濃度和短時(shí)間處理下誘導(dǎo)率低，但成活率高，隨著質(zhì)量濃度和處理時(shí)間的增加，誘導(dǎo)率逐漸提高，但不定芽成活率降低。根據(jù)四倍體植株的誘導(dǎo)率和成活率，篩選出最佳處理濃度和時(shí)間，即用0.1%的秋水仙素溶液處理48 h或0.2%的秋水仙素溶液處理12 h為桔梗同源四倍體誘導(dǎo)的最佳條件。

3.3桔梗同源四倍體的鑒定

一般而言，四倍體植株具有巨型化特征，將形態(tài)變異明顯的植株先經(jīng)流式細(xì)胞儀分析后，再用根尖壓片法鑒定，見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，桔梗二倍體植株根尖染色體數(shù)為2n=2x=18，DNA相對(duì)含量在100處有1個(gè)單峰；同源四倍體植株染色體數(shù)為2n=4x=36，DNA相對(duì)含量在200處有1個(gè)單峰，見(jiàn)圖2。

3.4桔梗二倍體和同源四倍體基因組DNA甲基化水平差異

MSAP技術(shù)中同裂酶HpaⅡ和MspⅠ都能識(shí)別并切割CCGG序列，但二者識(shí)別甲基化的位點(diǎn)不同，HpaⅡ能切割無(wú)甲基化和單鏈甲基化位點(diǎn)而不能切割雙鏈甲基化位點(diǎn)；MspⅠ能切割無(wú)甲基化和內(nèi)甲基化位點(diǎn)而不能切割外甲基化位點(diǎn)，因此經(jīng)HpaⅡ和MspⅠ切割后在聚丙烯酰胺凝膠電泳分析膠上能檢測(cè)出4種條帶類(lèi)型，即：Ⅰ型，H，M都有帶，說(shuō)明CCGG位點(diǎn)無(wú)甲基化；Ⅱ型，H有帶，M無(wú)帶，說(shuō)明CCGG位點(diǎn)發(fā)生單鏈外甲基化，即半甲基化；Ⅲ，H無(wú)帶，M有帶，說(shuō)明CCGG位點(diǎn)發(fā)生雙鏈內(nèi)甲基化，即全甲基化；Ⅳ，H，M都無(wú)帶，說(shuō)明CCGG位點(diǎn)有雙鏈內(nèi)外側(cè)甲基化、雙鏈外甲基化或無(wú)CCGG序列[16]。桔梗二倍體和同源四倍體DNA經(jīng)MSAP擴(kuò)增的條帶數(shù)及甲基化水平見(jiàn)表7，用20對(duì)引物組合共擴(kuò)增后共有1 586條條帶，其中二倍體764條，四倍體822條。二倍體總甲基化率、全甲基化率和半甲基化率分別為92.15%，61.52%，30.65%，而四倍體的為86.13%，54.38%，31.75%，與桔梗二倍體相比，其同源四倍體總甲基化率降低6.02%，全甲基化率降低7.14%，而半甲基化率升高1.6%，這說(shuō)明染色體加倍后其DNA甲基化水平發(fā)生了變化。

3.5桔梗二倍體和同源四倍體基因組DNA甲基化類(lèi)型

二倍體和同源四倍體桔梗基因組DNA甲基化類(lèi)型見(jiàn)表8，二倍體和四倍體共有15種條帶，見(jiàn)圖3。其中A型為單態(tài)性位點(diǎn)，包括3個(gè)亞類(lèi)，表示二倍體與四倍體甲基化狀態(tài)相同；B型為去甲基化位點(diǎn)，包括5個(gè)亞類(lèi)，說(shuō)明在該位點(diǎn)二倍體存在甲基化，而四倍體發(fā)生了去甲基化；C型為過(guò)或超甲基化類(lèi)型，也有5個(gè)亞類(lèi)，即與二倍體相比，四倍體甲基化升高；D型為次甲基類(lèi)型，有2個(gè)亞類(lèi)，表示相比于二倍體來(lái)說(shuō)，四倍體甲基化降低，但仍有甲基化現(xiàn)象[17]。與二倍體相比，桔梗試管苗染色體加倍后，其基因組DNA有23.54%發(fā)生了去甲基化現(xiàn)象，29.07%發(fā)生了過(guò)或超甲基化現(xiàn)象，2.97%發(fā)生了次甲基化現(xiàn)象，只有44.42%的基因組DNA未發(fā)生任何改變。

4討論與結(jié)論

4.1桔梗同源四倍體的離體誘導(dǎo)及鑒定

本研究中采0.2%抽濾滅菌的秋水仙素溶液浸P11～P20.其中的10對(duì)引物，每對(duì)引物下有4條泳道，從左往右依次為2H，2M，4H，4M；2H和4H分別表示二倍體和四倍體桔梗EcoR Ⅰ/Hpa Ⅱ酶切的擴(kuò)增結(jié)果；2M和4M表示二倍體和四倍體桔梗EcoR Ⅰ/Msp Ⅱ酶切的擴(kuò)增結(jié)果。

泡桔梗頂芽12 h，獲得了誘導(dǎo)率為32.0%的四倍體植株。高山林等[27]采用培養(yǎng)基中添加40 mg?L-1秋水仙素的方法誘導(dǎo)桔梗四倍體，誘導(dǎo)率達(dá)到37.5%；王小華等[28]采用0.1%秋水仙素處理桔梗嫩莖40 h，誘導(dǎo)率達(dá)到50%。前人誘導(dǎo)率較高的原因可能是在鑒定過(guò)程中僅用形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)的方法鑒定倍性，并沒(méi)有排除嵌合體的干擾，從而將嵌合率也計(jì)算到誘導(dǎo)率中，出現(xiàn)誘導(dǎo)率較高的現(xiàn)象，本研究采用了形態(tài)鑒別、流式細(xì)胞儀分析和根尖染色體鑒定相結(jié)合的方法進(jìn)行倍性鑒定，排除了嵌合體的干擾，提高了結(jié)果的可靠性，為進(jìn)一步研究桔梗同源四倍體的遺傳穩(wěn)定性和農(nóng)藝性狀評(píng)價(jià)提供可靠的材料。

4.2桔梗二倍體與四倍體基因組DNA甲基化水平差異及模式變化

多倍體植物具有器官巨大、活性成分含量高、抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，這可能是多倍化后植物體內(nèi)基因組結(jié)構(gòu)和表觀遺傳修飾發(fā)生了廣泛變化[3]，進(jìn)而導(dǎo)致植物出現(xiàn)新的性狀。但在對(duì)擬南芥[5]、水稻[29]、白菜[18]的同源多倍體及二倍體的比較研究中發(fā)現(xiàn)這些植物同源多倍化后基因組結(jié)構(gòu)并沒(méi)有發(fā)生明顯改變，且多倍化后多倍體的基因表達(dá)譜也與二倍體十分相似。表明同源多倍化后基因組并沒(méi)有同異源多倍化一樣發(fā)生大規(guī)模的基因組結(jié)構(gòu)調(diào)整事件。本研究中，從圖1可以明顯看出桔梗同源四倍體比二倍體植株粗大，葉片增厚增大，葉柄葉脈粗大等現(xiàn)象，同源多倍體桔梗新出現(xiàn)的區(qū)別于親本的性狀則可能與表觀遺傳調(diào)控密切相關(guān)。

甲基化是一種常見(jiàn)的表觀遺傳修飾形式，在基因表達(dá)中起著重要的調(diào)節(jié)作用，同源多倍化過(guò)程中，DNA甲基化會(huì)參與多倍體的適應(yīng)性調(diào)整，并發(fā)生特異性的變化以調(diào)控基因表達(dá)和轉(zhuǎn)座子的活性等，所以不同倍性材料中DNA甲基化水平會(huì)發(fā)生一定程度的改變[29]。楊嵐等[30]采用MSAP技術(shù)對(duì)甜葉菊同源四倍體與二倍體的表觀遺傳進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)四倍體基因組DNA的總甲基化率和全甲基化率略有所降低，甲基化模式主要以過(guò)和超甲基化為主；長(zhǎng)春花[31]多倍化后基因組CCGG位點(diǎn)的 DNA的總甲基化率、全甲基化率和半甲基化率較二倍體植株均有所提高，甲基化類(lèi)型以C型即過(guò)或超甲基化類(lèi)型最多。本研究中，桔梗同源四倍化后基因組DNA的總甲基化率和全甲基化率有所降低，其中總甲基化率降低6.02%，全甲基化率降低7.14%，且甲基化模式主要以過(guò)或超甲基化類(lèi)型（C型）為主，占29.07%，其次是去甲基化（B型），占23.54%，最少的是次甲基化（D型），占2.97%。由此可推測(cè)同源四倍體出現(xiàn)新的表型與DNA甲基化模式的重新調(diào)整尤其是大量過(guò)或超甲基化變異有關(guān)，過(guò)或超甲基化就可能導(dǎo)致相應(yīng)位點(diǎn)所在基因表達(dá)的關(guān)閉或抑制，進(jìn)而維持四倍體植株這自身基因組的穩(wěn)定性。有關(guān)染色體加倍后DNA甲基化模式調(diào)整的程度對(duì)多倍體性狀和表型改變的機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

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