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篇1

[關(guān)鍵詞] 糖尿病；肝臟；線粒體；琥珀酸脫氫酶；三磷酸腺苷酶；養(yǎng)陰活血方藥

[中圖分類號(hào)] R587.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2013）09（b）-0016-03

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是嚴(yán)重威脅人類健康的常見內(nèi)分泌代謝疾病，肝臟作為長(zhǎng)期受高血糖刺激的臟器之一，肝臟與糖尿病的關(guān)系逐漸受到人們重視。糖尿病肝病是糖尿病的一種慢性并發(fā)癥，其病因及發(fā)病機(jī)制仍未完全明了。糖尿病屬祖國(guó)醫(yī)學(xué)消渴證，陰虛為本[1]。養(yǎng)陰活血方藥是經(jīng)多年研究和臨床試驗(yàn)的核心方劑[2]。琥珀酸脫氫酶（SDH）是線粒體內(nèi)膜的結(jié)合酶，是連接氧化磷酸化與電子傳遞的樞紐之一，可為線粒體需氧和產(chǎn)能的呼吸鏈提供電子，是反映線粒體功能的標(biāo)志酶之一[3]。三磷酸腺苷酶（ATP酶）是維持胞內(nèi)離子內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和神經(jīng)元興奮性、沖動(dòng)傳導(dǎo)、突觸傳遞的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，為葡萄糖和氨基酸的攝取提供驅(qū)動(dòng)力，維持細(xì)胞生命活動(dòng)，也是反映線粒體功能的重要酶之一[3-4]。本研究在線粒體水平研究糖尿病大鼠肝臟的損傷作用，并且觀察糖尿病大鼠肝臟線粒體中ATP酶和SDH活性的變化。同時(shí)采用養(yǎng)陰活血方藥對(duì)糖尿病大鼠進(jìn)行治療，研究其對(duì)糖尿病肝病的防治作用，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用清潔級(jí)健康雄性SD大鼠，體重為250～300 g，24只，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（動(dòng)物合格證編號(hào)：809091）。

1.2 中藥配方

養(yǎng)陰活血方藥組成：熟地20 g、牡丹皮20 g、山藥15 g、山茱萸10 g等。

1.3 主要儀器及試劑

血糖檢測(cè)儀（購(gòu)于強(qiáng)生公司），3K-15型高速冷凍離心機(jī)（Sigma公司），7200型可見分光光度計(jì)（上海尤尼柯公司），鏈脲佐菌素（STZ，Sigma公司），線粒體提取試劑盒（批號(hào)20090809）、ATP酶測(cè)定試劑盒（批號(hào)20090710）、SDH測(cè)定試劑盒（批號(hào)20090710）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物分組 4月齡健康雄性SD大鼠24只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為三組：正常對(duì)照組（8只）；糖尿病模型組（8只）；中藥干預(yù)組（8只）。

1.4.2 糖尿病動(dòng)物模型制備及給藥 除正常對(duì)照組外，其他兩組腹腔注射STZ造糖尿病模型。各組正常飼料喂養(yǎng)，正常對(duì)照組和糖尿病模型組自由飲水，中藥干預(yù)組按人與動(dòng)物間體表面積折算的等效劑量比值灌喂給藥。

1.4.3 取材 造模成功后10周，對(duì)各組大鼠進(jìn)行稱重，股動(dòng)脈放血，并取肝臟，部分進(jìn)行固定，其余立即放入液氮，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 ATP酶和SDH活性的測(cè)定 取一小塊肝組織，稱重，用勻漿介質(zhì)制成10%組織勻漿，提取線粒體，然后測(cè)SDH活性、Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4.5 肝線粒體超微結(jié)構(gòu)的觀察 取肝組織切成1 mm×1 mm×1 mm的小塊，用4%戊二醛進(jìn)行固定，磷酸緩沖液浸洗3次，每次10 min，然后用鋨酸（10 g/L）固定2 h，環(huán)氧樹脂包埋，切片，染色，然后在電鏡下進(jìn)行觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較用單因素方差分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肝線粒體ATP酶和SDH活性測(cè)定結(jié)果

與正常對(duì)照組比較，糖尿病模型組的SDH活性明顯降低，Na+-K+-ATP酶與Ca2+-Mg2+-ATP酶活性明顯降低（P < 0.01）。見表1。與糖尿病模型組相比，中藥干預(yù)組SDH活性、Na+-K+-ATP酶與Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均有顯著升高（P < 0.01）。見表2。

表1 大鼠肝線粒體琥珀酸脫氫酶和三磷酸腺苷酶活性

（糖尿病模型組與正常對(duì)照組）（U/mgprot，x±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P < 0.01；SDH：琥珀酸脫氫酶；ATP酶：三磷酸腺苷酶

表2 大鼠肝線粒體琥珀酸脫氫酶和三磷酸腺苷酶活性

（中藥干預(yù)組與糖尿病模型組）（U/mgprot，x±s）

注：與糖尿病模型組比較，*P < 0.01；SDH：琥珀酸脫氫酶；ATP酶：三磷酸腺苷酶

2.2 肝線粒體超微結(jié)構(gòu)變化

通過(guò)觀察透射電鏡下（×15 000）肝組織，與正常對(duì)照組比較，糖尿病模型組可見肝細(xì)胞線粒體空泡化，線粒體嵴大部分融合、消失，線粒體膜部分融合、消失；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張，脫顆粒現(xiàn)象明顯。中藥干預(yù)組肝細(xì)胞線粒體無(wú)空泡，但是線粒體嵴和膜不清晰。而正常對(duì)照組肝細(xì)胞線粒體完整，線粒體嵴清晰。見圖1。

A：正常對(duì)照組；B：糖尿病模型組；C：中藥干預(yù)組

圖1 養(yǎng)陰活血方藥對(duì)大鼠肝臟線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響（TEM，×15 000）

3 討論

糖尿病是一種新陳代謝疾病，以慢性高血糖為特征，因胰島素分泌、胰島素活性異常所致；糖尿病患者經(jīng)常伴有高脂血癥，心血管病病死率高[6]。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，2011年全球有近三億六千四百萬(wàn)人罹患糖尿病。2004年全世界有340萬(wàn)人因高血糖致死[7]。

肝臟是能量代謝的重要器官，含有豐富的線粒體，而線粒體是真核細(xì)胞中重要的細(xì)胞器，是細(xì)胞有氧呼吸的基地和能量供應(yīng)的場(chǎng)所，細(xì)胞生命活動(dòng)大約95%的能量來(lái)自線粒體[8]；線粒體的一個(gè)重要生物學(xué)功能是氧化代謝和鈣代謝，其正常運(yùn)行依賴于結(jié)構(gòu)的完整性。線粒體的氧化磷酸化功能與鈣平衡狀態(tài)密切相關(guān)。Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶對(duì)調(diào)節(jié)線粒體膜內(nèi)外的離子平衡至關(guān)重要，其活性依賴于膜流動(dòng)性并受ATP水平的影響[9]。細(xì)胞內(nèi)Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性下降，必然會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Na+超載，進(jìn)而引起線粒體中的Ca2+釋放和細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載；Mg2+-ATP酶活性下降則導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Mg2+減少，削弱Mg2+-ATP酶對(duì)Ca2+超載的生理拮抗作用，抑制蛋白質(zhì)和能量合成，降低多種酶的活性，增加細(xì)胞膜的通透性，造成了離子分布狀態(tài)失衡和水積聚，線粒體結(jié)構(gòu)破壞，最終導(dǎo)致組織細(xì)胞損傷和死亡。高血糖和血脂成分的變化造成膜酶的糖化，致使Na+-K+-ATP酶活性降低[10]，也會(huì)致線粒體結(jié)構(gòu)破壞，組織細(xì)胞凋亡。

SDH是嵌在線粒體內(nèi)膜上的一種多聚體酶，具有雙重作用；一是三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵性脫氫酶，二是氧化磷酸化以及把電子直接傳遞給輔酶Q10的呼吸鏈的重要組分。SDH氧化琥珀酸形成三羧酸循環(huán)組分之一的延胡索酸，其氧化輔酶Q10形成線粒體電子傳遞鏈里的泛醇[11]。SDH活性的變化可反映細(xì)胞能量代謝情況和三羧酸循環(huán)狀態(tài)[12]，該酶活性的升高表明線粒體經(jīng)由短呼吸鏈中ATP產(chǎn)生的增加以及三羧酸循環(huán)的加快[13]；SDH活性增強(qiáng)時(shí)，琥珀酸受體的表達(dá)下降；而SDH活性逐漸降低時(shí)，琥珀酸受體表達(dá)則隨之顯著升高[14]。SDH是檢測(cè)線粒體損傷程度的敏感指標(biāo)[15]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常對(duì)照組比較，糖尿病模型組的鈉鉀ATP酶與鈣鎂ATP酶活性明顯降低，SDH活性明顯降低，觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)，模型組可見肝細(xì)胞線粒體空泡化，線粒體嵴大部分融合、消失，線粒體膜部分融合、消失；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張，脫顆?，F(xiàn)象明顯。這說(shuō)明糖尿病使肝臟中線粒體損傷程度嚴(yán)重，表明糖尿病對(duì)肝臟會(huì)造成功能性損傷。

經(jīng)過(guò)10周的飼養(yǎng)，模型組大鼠肝臟線粒體SDH及ATP酶活力均有大幅降低，說(shuō)明長(zhǎng)期糖尿病可引起肝臟線粒體功能衰減，有可能引起肝組織線粒體鈉-鉀泵、鈣-鎂泵及呼吸鏈功能障礙，從而引起糖尿病肝病。有資料顯示，中藥可以治療糖尿病并發(fā)癥[16]。研究結(jié)果表明，與糖尿病模型組相比，中藥干預(yù)組SDH活性、鈉鉀ATP酶和鈣鎂ATP酶活性均有顯著升高，觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)，肝細(xì)胞線粒體無(wú)空泡，損傷程度較輕，說(shuō)明此配方中藥對(duì)糖尿病患者的肝臟線粒體損傷有明顯的防治作用。

糖尿病屬于中醫(yī)學(xué)中“消渴病”范疇，病因多為陰傷所致，本實(shí)驗(yàn)所用養(yǎng)陰活血方藥由熟地、牡丹皮、山藥、山茱萸等中藥組成。其中熟地可滋陰補(bǔ)血，山萸肉可滋補(bǔ)肝腎，諸藥并用以奏養(yǎng)陰活血之功。研究結(jié)果表明，養(yǎng)陰活血方藥可有效提高SDH和ATP酶活性，這可能是養(yǎng)陰活血方藥對(duì)糖尿病大鼠肝臟線粒體的保護(hù)作用機(jī)制之一。

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