導(dǎo)語：ＲPA技術(shù)在結(jié)核分枝桿菌診斷的應(yīng)用一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

摘要:目的傳統(tǒng)的結(jié)核分枝桿菌鑒定方法周期時(shí)間長(zhǎng)、敏感性較差，往往延誤患者的診斷和治療，隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，為了可以快速診斷結(jié)核分枝桿菌，本研究利用重組酶聚合酶擴(kuò)增(ＲecombinasePolymeraseAmplification，ＲPA)技術(shù)建立快速的結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)方法，為結(jié)核病患者的診斷和治療贏得寶貴時(shí)間。方法應(yīng)用ＲPA技術(shù)對(duì)疑似肺結(jié)核患者痰標(biāo)本中的特異性核苷酸片段進(jìn)行檢測(cè)，利用衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)ＲPA技術(shù)與傳統(tǒng)診斷方法有無差異。結(jié)果80例疑似肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本中檢測(cè)出70例陽性，有10例排除結(jié)核病。80例疑似肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本中，ＲPA技術(shù)檢測(cè)陽性率為87.50%，痰涂片檢測(cè)陽性率為56.25%，痰培養(yǎng)檢測(cè)陽性率為75.00%，ＲPA技術(shù)檢測(cè)陽性率較高，與痰涂片、痰培養(yǎng)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=25.00，P＜0.01;χ2=10.00，P＜0.01)。結(jié)論ＲPA技術(shù)的成功建立對(duì)結(jié)核病的快速診斷有著重要意義。

關(guān)鍵詞:重組酶聚合酶擴(kuò)增;結(jié)核分枝桿菌;特異性;診斷;檢測(cè)

結(jié)核病(tuberculosis)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacte-riumtuberculosis，MTB)引起的一種古老的慢性傳染病，以肺部感染最為常見［1］。2019年世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球報(bào)告結(jié)核病患者710萬例，與估算的1000萬例有所差異，可能與大部分患者未被診斷出來有關(guān)［2］，可見結(jié)核病的診斷存在一定的難度。肺結(jié)核是結(jié)核病中具有傳染性的一類，臨床上對(duì)這類患者的診斷主要通過痰涂片法和痰培養(yǎng)法，按照世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)，臨床上的診斷率只有不到70%。由于部分患者未得到及時(shí)診斷，使其成為持續(xù)的傳染源，發(fā)病數(shù)持續(xù)增加?；诖?，需改進(jìn)現(xiàn)有的診斷方法，以提高結(jié)核病的診斷率。重組酶聚合酶擴(kuò)增(ＲecombinasePolymeraseAmplification，ＲPA)技術(shù)被稱為是可以替代PCＲ技術(shù)的核酸檢測(cè)技術(shù)［3－7］。該技術(shù)對(duì)硬件設(shè)備的要求很低，特別適合用于體外診斷、獸醫(yī)、食品安全、生物防御、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域［8－11］。本研究利用ＲPA技術(shù)建立結(jié)核分枝桿菌的快速檢測(cè)方法，現(xiàn)報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1材料結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Ｒv由中國疾病預(yù)防控制中心提供，該研究涉及的菌株標(biāo)本和痰標(biāo)本均來源于邯鄲市第六醫(yī)院;引物與探針(表1)交由上海生工有限公司合成;DNA提取采用江蘇碩世公司的磁珠提取試劑盒，ＲPAMasterMix購自濰坊安普未來生物科技有限公司，培養(yǎng)基選用珠海貝索的酸性羅氏培養(yǎng)基和中性羅氏培養(yǎng)基。1.2儀器西安天?。襡al－timePCＲ儀，江蘇碩世全自動(dòng)核酸提取儀，熱電培養(yǎng)箱。1.3方法1.3.1痰涂片鏡檢抗酸染色［12］，用玻片夾夾持涂片標(biāo)本，滴加石炭酸復(fù)紅2～3滴，在火焰高處徐徐加熱，切勿沸騰，出現(xiàn)蒸汽即暫時(shí)離開，若染液蒸發(fā)減少，應(yīng)再加染液，以免干涸，加熱3～5min，待標(biāo)本冷卻后用水沖洗。3%鹽酸酒精脫色30s～1min，用水沖洗。用堿性美蘭溶液復(fù)染1min，水洗，用吸水紙吸干后用油鏡觀察。1.3.2分離培養(yǎng)取目標(biāo)痰液經(jīng)4%氫氧化鈉溶液消化處理15min后，酸性羅氏培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)7周，分離得到菌株。1.3.3DNA制備取1ml菌懸液或痰液于1.5ml離心管中，7500rpm離心10min，棄上清，加入180μl溶有溶菌酶的緩沖液BL，充分混勻，低速離心，于37℃水浴溫育30min(溫浴期間每隔10min顛倒混勻一次)。加入10μl蛋白酶K至樣品中，充分混勻，低速離心，56℃水浴溫育10min。將消化液全部加入到試劑板AT中的第1、7列中。將加入樣本的試劑板AT放置在核酸提取儀中，試劑板AT的缺口朝外。插入八聯(lián)磁棒套，關(guān)上試驗(yàn)倉，按下設(shè)置核酸提取程序，并選擇運(yùn)行。1.3.4ＲPA反應(yīng)體系每份反應(yīng)液中含有A反應(yīng)液29.4μl，上、下游引物(10μmol/μl)各2μl，探針(10μmol/μl)2μl，滅菌水11.5μl，結(jié)核分枝桿菌DNA樣品2μl，反應(yīng)液總體系50μl。1.3.5PCＲ反應(yīng)條件39℃30s(×1)，39℃10s→39℃20s(×40)。1.3.6結(jié)果分析采用SPSS21.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析，采用χ2檢驗(yàn)對(duì)不同檢測(cè)方法的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1ＲPA技術(shù)檢測(cè)結(jié)果80例疑似肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本中檢測(cè)出70例陽性，結(jié)果見圖1。對(duì)余下的10例患者標(biāo)本分別進(jìn)行痰涂片以及痰培養(yǎng)，結(jié)果均為陰性，又對(duì)10例患者進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以排除結(jié)核病的可能。2.2痰涂片鏡檢結(jié)果對(duì)80例疑似肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本進(jìn)行痰涂片鏡檢，陽性45例，再進(jìn)行ＲPA檢測(cè)，45例患者標(biāo)本全部陽性;對(duì)35例涂片陰性的標(biāo)本進(jìn)行ＲPA檢測(cè)，其中檢出25例陽性、10例陰性。在80例疑似肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本中，ＲPA檢測(cè)陽性率為87.50%，痰涂片檢測(cè)陽性率為56.25%，ＲPA陽性檢測(cè)率較高，對(duì)兩種檢測(cè)方法進(jìn)行配對(duì)設(shè)計(jì)的χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=25.00，P＜0.01)。2.3痰培養(yǎng)結(jié)果80例疑似肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本中培養(yǎng)出60株結(jié)核分枝桿菌。與ＲPA技術(shù)比較見表3。60例培養(yǎng)陽性的標(biāo)本進(jìn)行ＲPA檢測(cè)，全部陽性，對(duì)20例痰培養(yǎng)陰性的標(biāo)本進(jìn)行ＲPA檢測(cè)，其中檢出10例陽性、10例陰性。在80例疑似肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本中，ＲPA檢測(cè)陽性率為87.50%，痰培養(yǎng)檢測(cè)陽性率為75.00%，ＲPA陽性檢測(cè)率較高，對(duì)兩種檢測(cè)方法進(jìn)行配對(duì)設(shè)計(jì)的χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.00，P＜0.01)。

3討論

肺結(jié)核患者傳統(tǒng)診斷方法主要有細(xì)菌學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)。細(xì)菌學(xué)的臨床診斷是傳染性肺結(jié)核患者診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，其中主要的診斷方法有痰涂片的抗酸染色法和結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)法。然而，痰涂片抗酸染色法的陽性率很低，陽性率低的原因主要受痰標(biāo)本質(zhì)量好壞的影響，因此陽性率的差別很大。細(xì)菌分離培養(yǎng)法的陽性率稍高于痰涂片抗酸染色法，并且能夠分離得到活菌，但結(jié)核分枝桿菌的生長(zhǎng)速度緩慢，檢測(cè)周期較長(zhǎng)，一般需要7周左右。隨著PCＲ技術(shù)突飛猛進(jìn)的發(fā)展，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)室診斷之中，具有靈敏、快速、特異的特點(diǎn)，能夠快速檢測(cè)不同類型的標(biāo)本中的少量細(xì)菌，靈敏度較高，而且不受抗生素使用的影響。但PCＲ技術(shù)無法避免地要經(jīng)歷變性、退火、延伸等熱循環(huán)步驟，并且需要具備昂貴的PCＲ擴(kuò)增儀器才能實(shí)現(xiàn)核酸擴(kuò)增，因此限制了其在基層單位以及現(xiàn)場(chǎng)簡(jiǎn)陋條件下的應(yīng)用，加之?dāng)U增時(shí)間長(zhǎng)、成本高，并不適合傳染病的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和床旁診斷［13］。目前Gene－XpertMTB/ＲIF技術(shù)已被應(yīng)用在結(jié)核病的診斷中，雖然可以提高診斷率，但該技術(shù)設(shè)備昂貴并且通量小，試劑封閉且較貴，并未得到很好的應(yīng)用推廣。因此，研究和發(fā)展一種快速高效、操作簡(jiǎn)便、靈敏可靠的檢測(cè)技術(shù)，對(duì)傳染病的診斷、治療和疫情的控制具有重要意義。ＲPA技術(shù)是一種新型的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，是目前全球較新的等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)，其對(duì)硬件設(shè)備的要求很低，尤其可以應(yīng)用于傳染病的分子診斷中［14－17］，且檢測(cè)時(shí)間短，只需5～20min就可以完成［18－20］。

作者：黃亮 胡朝輝 閆永飛 高騰 許夢(mèng)捷 李偉昊 趙麗萍 單位：邯鄲市疾病預(yù)防控制中心