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【摘要】目的建立測(cè)定兔血漿中葛根素濃度的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。方法血漿加入內(nèi)標(biāo)橙皮苷后經(jīng)固相萃取處理,采用AglientC18柱(150mm×2.1mm,3.5μm)分離,流動(dòng)相為甲醇10mmol·L-1醋酸銨緩沖液乙腈(體積比70∶20∶10),流速為0.2mL·min-1。樣品在串聯(lián)質(zhì)譜中經(jīng)ESI源離子化后以多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)方式測(cè)定。結(jié)果葛根素在10~3000ng·mL-1線性良好(r=0.9986),檢測(cè)限為10ng·mL-1,回收率為99.91%~103.92%,絕對(duì)回收率為91.33%~100.40%,日內(nèi)、日間變異(RSD)均≤15%,色譜峰保留時(shí)間為1.67min。結(jié)論方法靈敏、準(zhǔn)確、快速、特異性強(qiáng),適用于中藥葛根素的藥動(dòng)學(xué)研究。

【關(guān)鍵詞】液相色譜質(zhì)譜法;葛根素;血藥濃度

Abstract:ObjectiveToestablishanHPLCMSMSmethodfordeterminingthecontentofplasmapuerarin.MethodsTheplasmasamplepretreatedwithsolidphaseextractionafteradditionofinternalstandardofhesperidinwasanalyzedonanAglientC18column(150mm×2.1mm,3.5μm).Themobilephaseconsistedofmethanol10mmol·L-1NH4ACbufferacetonitrile(70∶20∶10)withtheflowrateof0.2mL·min-1.Thesamplewasionizedbyelectrosprayionizationsourceinthetriplequadrupletandemmassspectrometer,then,itwasquantitatedwithmultiplereactionmonitoringmode.ResultsTherewasagoodlinearityovertheconcentrationrangesof10~3000ng·mL-1(r=0.9986).Thedetectionlimitofthismethodwas10ng·mL-1.Therecoveryandabsoluterecoverywere99.91%~103.92%and91.33%~100.40%,respectively.Thewithindayandbetweendaydeviationswerelessthan15%andthechromatographypeaktRwas1.67min.ConclusionThemethodissensitive,accurate,rapidandsuitableforthedeterminationofpuerarininhumanplasma.

Keywords:liquidchromatography-tandemmassspectrometry;puerarin;plasmaconcentration

葛根素(puerarin)是中藥葛根的主要成分之一,具有擴(kuò)張冠脈血管、降低血壓和心肌耗氧量、抗心律失常等作用[1]。文獻(xiàn)報(bào)道的葛根素血藥濃度測(cè)定方法多數(shù)是高效液相色譜法[2-4],但有時(shí)也難以滿足藥動(dòng)學(xué)研究中微量血藥濃度的測(cè)定要求,且分析用時(shí)較長(zhǎng)。本文建立測(cè)定葛根素血藥濃度的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LCMSMS)法,具有簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)且檢測(cè)快速等優(yōu)點(diǎn),適用于葛根素的藥動(dòng)學(xué)研究。

1材料與方法

1.1儀器與試藥美國(guó)AB公司API3000型液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng);Waters20管型固相萃取儀;TECHNE樣品濃縮儀;WatersHLB固相萃取小柱(100mg)。葛根素注射劑(浙江康恩貝制藥股份有限公司,0.25g/5mL);葛根素、橙皮苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)分別為:0752200108,0721200104);甲醇、乙腈為色譜純;醋酸胺為分析純;重蒸餾水。

1.2色譜及質(zhì)譜條件色譜柱:AglientC18(150mm×2.1mm,3.5μm),流動(dòng)相:甲醇10mmol·L-1醋酸銨緩沖液乙腈(體積比70∶20∶10),流速為0.2mL·min-1。輔助氣化電噴霧離子源(ESI),多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)(MRM)模式正離子檢測(cè),檢測(cè)離子對(duì):m/z417.2→267.2(葛根素),m/z611.2→303.2(內(nèi)標(biāo)橙皮苷),輔助氣化氣流量:7500CC·min-1,霧化氣流量:8L·min-1,氣簾氣流量:8L·min-1,碰撞氣流量:6L·min-1,離子源噴霧電壓:5500V,離子源霧化溫度:350℃。

1.3對(duì)照品及內(nèi)標(biāo)溶液的配制精密稱(chēng)取適量的葛根素對(duì)照品,用甲醇溶解并定容得160μg·mL-1的對(duì)照品溶液;精密稱(chēng)取適量的橙皮苷對(duì)照品,用甲醇溶解并定容得500ng·mL-1的內(nèi)標(biāo)溶液。

1.4血漿樣品處理固相萃取小柱用1.0mL甲醇活化和1.0mL雙蒸水平衡,取血樣300μL加入10mmol·L-1醋酸銨緩沖液300μL和內(nèi)標(biāo)溶液20μL,混勻后上樣,雙蒸水1.0mL洗滌,0.5mL甲醇洗脫,收集洗脫液于45℃水浴下用N2吹干濃縮,加入150μL流動(dòng)相復(fù)溶,取5μL進(jìn)樣。

2結(jié)果

2.1方法專(zhuān)屬性根據(jù)葛根素和內(nèi)標(biāo)物橙皮苷的子離子質(zhì)譜掃描結(jié)果(見(jiàn)圖1),分別選擇特異的m/z417.2→267.2和m/z611.2→303.2用于定量監(jiān)測(cè)。按照血漿樣品處理方法和檢測(cè)條件,空白血漿的色譜圖、空白血漿加葛根素和內(nèi)標(biāo)對(duì)照品的色譜圖、用藥后血漿色譜圖,分別見(jiàn)圖2A、圖2B和圖2C。結(jié)果表明,葛根素和內(nèi)標(biāo)物的保留時(shí)間分別為1.67min和1.75min,血漿中無(wú)內(nèi)源性物質(zhì)和基質(zhì)效應(yīng)干擾,方法特異性強(qiáng)。

圖1葛根素(1)和橙皮苷(2)的質(zhì)譜子離子掃描圖(略)

Fig.1FullscanMS-MSspectraofpuerarin(1)andhesperidin(2)

A.空白血漿;B.空白血漿加入葛根素和橙皮苷對(duì)照品;C.兔給藥后血漿

1.葛根素m/z417.2→267.2,tR=1.67min;2.橙皮苷m/z611.2→303.2,tR=1.75min

圖2血漿中葛根素和橙皮苷的色譜圖(略)

Fig.2ChromatogramsofpuerarinandhesperidininplasmabyLCMSMS

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍取空白血漿加入葛根素對(duì)照品溶液,配制成濃度為10、30、100、300、1000、3000ng·mL-1的血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,按“1.4”項(xiàng)下方法操作,計(jì)算葛根素與內(nèi)標(biāo)峰面積比,得回歸方程為:Y=0.00299C+000234,r=0.9986,權(quán)重1/X2。血漿中葛根素在10~3000ng·mL-1范圍內(nèi)與峰面積比線性關(guān)系良好,定量下限為10ng·mL-1。

2.3精密度與相對(duì)回收率取空白血漿加入葛根素對(duì)照品溶液,制備濃度為10、1500和2500ng·mL-1的血漿質(zhì)控樣品,按“1.4”項(xiàng)下方法操作測(cè)定,每個(gè)濃度的樣品在1d內(nèi)作5份樣品分析,連續(xù)測(cè)定3d,計(jì)算方法的日內(nèi)和日間差,結(jié)果低、中、高3種濃度的日內(nèi)RSD分別為7.56%,4.43%,9.66%(n=5);日間RSD分別為13.58%,7.20%,7.06%(n=15);將實(shí)測(cè)值與真實(shí)值相比得相對(duì)回收率,結(jié)果低、中、高3種濃度的相對(duì)回收率分別為(103.92±14.12)%,(99.91±719)%,(100.29±7.08)%(n=15)。

2.4提取回收率取空白血漿樣品按“1.4”項(xiàng)下提取、吹干,然后加入分別含10、1500和2500ng·mL-1葛根素對(duì)照品的流動(dòng)相150μL復(fù)溶(n=5),使對(duì)照品溶液含空白血漿基質(zhì),測(cè)定其峰面積并計(jì)算得均值A(chǔ)1,A2,A3;另取低、中、高濃度的質(zhì)控血漿各5份,按“1.4”項(xiàng)下方法操作、測(cè)定峰面積,分別與A1,A2,A3進(jìn)行比較,計(jì)算本法的提取回收率(n=5),分別為(91.33±11.06)%,(100.40±7.97)%,(96.36±6.28)%。

2.5稀釋能力試驗(yàn)取濃度為2500ng·mL-1的血漿質(zhì)控樣品5份,用空白血漿稀釋5倍后按“1.4”項(xiàng)下方法操作,將測(cè)定值乘稀釋因子后與標(biāo)示值比較,準(zhǔn)確度為(98.45±3.57)%。所以對(duì)高于定量上限的樣品可用空白血漿稀釋后測(cè)定。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)取低、中、高3種濃度的血漿質(zhì)控樣品各5份,分別在-75℃保存5個(gè)月、室溫21℃放置24h及經(jīng)3個(gè)冷凍融解循環(huán)處置,然后按“1.4”項(xiàng)下方法操作,測(cè)定值與真實(shí)值比較,相對(duì)偏差均<15%,表明血漿樣品穩(wěn)定;血樣制備后的待測(cè)液在自動(dòng)進(jìn)樣器中放置6h,其測(cè)定值與真實(shí)值比較,相對(duì)偏差均<15%,表明待測(cè)液在測(cè)定過(guò)程中也是穩(wěn)定的。

2.7兔體內(nèi)血藥濃度的測(cè)定取新西蘭兔6只(廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供),雌雄兼有,體重2.0~2.5kg,禁食12h后于耳緣靜脈注射葛根素100mg,于注射前、注射結(jié)束后0.25、0.5、1、2、3、4、6、8、10、12h取耳緣靜脈血2mL,置肝素抗凝管中,離心(3500r/min)15min,吸取上層血漿進(jìn)行分析,以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)樣本中的葛根素濃度,同時(shí)測(cè)定質(zhì)控樣本以保證結(jié)果的可靠性。兔靜脈注射葛根素后的平均藥時(shí)曲線見(jiàn)圖3。

3討論

葛根素選擇m/z417.2→267.2作為監(jiān)測(cè)離子對(duì),特異性強(qiáng)且具有較高的儀器響應(yīng)值。以含醋酸銨緩沖液的甲醇乙腈作為流動(dòng)相,可使靈敏度進(jìn)一步提高和有利于檢測(cè)體系穩(wěn)定。使用SPE法凈化血漿樣品,能有效消除LCMSMS法檢測(cè)生物樣品時(shí)常有的基質(zhì)效應(yīng)的影響,而且使用WatersHLB小柱,提取效率很高,本試驗(yàn)曾對(duì)提取步驟中的洗滌液和二次甲醇洗脫液進(jìn)行跟蹤檢測(cè),均無(wú)葛根素的檢出。藥動(dòng)學(xué)研究涉及一系列的血樣采集、保存、制備和測(cè)定等步驟,藥物在紛繁的操作過(guò)程中是否保持穩(wěn)定,需預(yù)先在方法學(xué)確證試驗(yàn)中進(jìn)行考察,穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明,在上述條件下血樣中的葛根素是穩(wěn)定的。LC/MS/MS技術(shù)已開(kāi)始在中藥藥動(dòng)學(xué)研究得到應(yīng)用,其特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)可滿足在復(fù)雜的生物樣品中進(jìn)行微量成分分析的要求。本試驗(yàn)采用此技術(shù)測(cè)定中藥葛根素的血藥濃度,定量下限達(dá)到10ng·mL-1,目標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)物的保留時(shí)間均在2min之內(nèi),檢測(cè)快速。本方法的各項(xiàng)指標(biāo)符合生物樣品定量分析方法學(xué)的要求,可用于藥動(dòng)學(xué)研究的大量血樣的測(cè)定。

圖3兔靜脈注射葛根素100mg后的平均血藥濃度時(shí)間曲線(n=6)(略)

Fig.3Theconcentrationtimecurveofpuerarininrabbitplasmaafteriv100mg(n=6)

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