導(dǎo)語：海藻硫酸多糖制備及抗凝血研究論文一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

摘要:海藻硫酸多糖是從海藻中提取的一類生物活性多糖,迄今已提取出多種具有抗凝血活性的海藻硫酸多糖,它作為一種有望替代肝素的新型抗凝血活性物質(zhì)日益受到關(guān)注?，F(xiàn)就目前國內(nèi)外對海藻硫酸多糖的制備及其抗凝活性的研究進(jìn)展作一綜述。

關(guān)鍵詞:海藻;硫酸多糖;抗凝血

中圖分類號:R282.77文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:1672-979X(2007)08-0054-03

海藻硫酸多糖(sulfatedpolysaccharideformseaweed,SPS)是從海藻中提取的多糖硫酸化衍生物,是多糖分子鏈中單糖分子的部分羥基被硫酸根取代而形成的一類多功能活性物質(zhì),由不同的單糖基通過糖苷鍵(一般為C1,3-鍵和C1,4-鍵)相連而成。SPS的來源不同,其糖基單體及硫酸基的位置也不相同。研究表明,SPS具有抗腫瘤、抗病毒、降血脂、降血糖、抗凝血以及增強(qiáng)機(jī)體免疫機(jī)能等生物學(xué)活性,日益受到關(guān)注。目前常用的抗凝藥物是從動(dòng)物體中獲得的肝素,其來源有一定限制。SPS抗凝血活性顯著,來源廣泛且無副作用,有望代替肝素成為新型的抗凝血藥物。臨床資料表明,SPS對缺血性心腦血管疾病及高血黏度綜合征有明顯的抗凝、解痙、解聚、降壓降脂、降低血液黏度以及擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)的作用。

1.SPS的來源

1913年Killing首次從褐藻中提取了具有抗凝血活性的SPS,1957年Springer等報(bào)道,從墨角藻中分離到的褐藻多糖硫酸酯在體內(nèi)和體外都表現(xiàn)出了強(qiáng)抗凝血活性。1958年Gerber從膠質(zhì)石花菜(Gelidiumcartiagenium)中提取了呈高度硫酸化的SPS。在很長一段時(shí)間內(nèi)人們認(rèn)為,具有抗凝血活性的硫酸多糖主要是從褐藻中提取的巖藻聚糖和從紅藻中提取的卡拉膠,綠藻中沒有抗凝血硫酸多糖。直到1985年Deacon報(bào)道,綠藻Codiumfragilessp.tomentosides中有抗凝血活性多糖,人們才開始將目光轉(zhuǎn)向綠藻,并從剛毛藻、蕨藻、孔石莼等綠藻中發(fā)現(xiàn)了含量很高的硫酸多糖。表明硫酸多糖在海藻中普遍存在,來源非常廣泛。

2.SPS的制備

SPS制備的主要工藝環(huán)節(jié)包括破碎、浸提、沉淀、純化、水解等。浸提及沉淀是影響收率、產(chǎn)品質(zhì)量及經(jīng)濟(jì)性的主要環(huán)節(jié),純化與水解則是關(guān)系到其生理活性的重要因素。

2.1粗多糖的制備

目前制備粗多糖多用水提醇沉法。通常是用熱水浸提破碎的海藻,離心得到上清液,濃縮并加入60%~75%乙醇沉淀多糖。離心后再用乙醚、丙酮、無水乙醇等反復(fù)洗滌,干燥即得粗多糖。也可用微波、超聲波以及反復(fù)凍融等方法輔助提取,以提高多糖的提取率并縮短提取時(shí)間。此外,還可用稀酸、稀鹽溶液提取或復(fù)合酶-熱水浸提相結(jié)合的方法提取,但提取條件不能過分強(qiáng)烈以免破壞其天然高級結(jié)構(gòu),或造成硫酸基團(tuán)脫落而喪失生物活性。提取硫酸多糖一般不用堿溶液,因?yàn)閴A處理易使SPS的硫酸基團(tuán)脫落,用稀酸提取則不存在這個(gè)問題。吳永沛[1]報(bào)道,提取福建產(chǎn)海帶巖藻聚糖的條件是用8倍0.1mol/L鹽酸提取2h,70%乙醇沉淀精制,巖藻聚糖的提取率為2.1%,產(chǎn)品SO42-含量為20%。工藝條件溫和,不使用有害元素或化學(xué)品,產(chǎn)品安全度高、生物活性強(qiáng)。酶法提取多用纖維素酶或果膠酶使細(xì)胞破壁以提高收率,酶解法具有條件溫和、雜質(zhì)易除去等優(yōu)點(diǎn)。

提取液含有褐藻膠時(shí),可先用低濃度的乙醇沉淀褐藻膠,再用高濃度的乙醇沉淀硫酸多糖。還可用氫氧化鉛、氫氧化鋁以及季胺鹽類陽離子表面活性劑沉淀多糖。

2.2硫酸多糖的純化

沉淀所獲得的多糖常含有較多的蛋白質(zhì),可選用Sevag法、三氟三氯乙烷法、三氯醋酸法或是蛋白酶水解法脫去蛋白質(zhì),得到多糖粗品。Sevag法操作繁瑣,多糖損失量大,且有有機(jī)溶劑殘留;三氯醋酸法反應(yīng)劇烈,易使糖苷鍵斷裂;蛋白酶法不僅脫蛋白效率高而反應(yīng)條件溫和,多糖不易破壞或損失。文獻(xiàn)[2]報(bào)道,用堿性蛋白酶脫除多糖中的蛋白質(zhì),脫除率可達(dá)86.4%,多糖收率為89.3%;Sevag法的蛋白質(zhì)脫除率雖然達(dá)87.9%,但多糖收率僅為28.6%。

進(jìn)一步的分離純化多采用色譜柱層析法,純化硫酸多糖多用弱陰離子交換柱層析,如DEAE-cellulose-52[3],DEAE-SepharoseFF[4]等。根據(jù)所帶電荷的不同可用不同濃度的鹽溶液分離硫酸多糖,然后根據(jù)相對分子質(zhì)量大小用葡聚糖凝膠或瓊脂糖凝膠柱層析進(jìn)一步分離純化。Yasantha[5]研究褐藻Eckloniacava硫酸多糖的抗凝血活性時(shí),使用兩次DEAE-纖維素層析柱得到單一的洗脫峰,再用Sepharose4B柱層析再次純化,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測為相對單一的組分。

2.3SPS的水解

天然的SPS是一種含有多種單糖和硫酸基的水溶性雜多糖,其相對分子質(zhì)量從幾萬至幾十萬不等,結(jié)構(gòu)復(fù)雜,難吸收。用適當(dāng)?shù)姆椒ń档秃Ｔ辶蛩岫嗵堑南鄬Ψ肿淤|(zhì)量,是亟待解決的問題。降解SPS可用酸解法、堿解法、鹽解法、酶解法、超聲波降解和射線降解,但這些方法對多糖的降解大都是隨機(jī)的,所得降解產(chǎn)物相對分子質(zhì)量范圍較大;專一性的糖苷酶因價(jià)格昂貴不適合大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。王琪琳等[6]用自由基方法降解海帶硫酸多糖,可使多糖的相對分子質(zhì)量降低到1萬左右,不但相對分子質(zhì)量很集中,而且降解之后海帶硫酸多糖的多糖含量、硫酸根含量均增加,而單糖組成及多糖結(jié)構(gòu)基本沒有變化;Elisa[7]用H2O2降解Schizymeniabinderi中的硫酸多糖,得到相對分子質(zhì)量約8.5×103的片斷,且具有抗凝血活性;馬夏軍[8]用超聲波輔助H2O2降解麒麟菜硫酸多糖,降解后不需處理氧化劑,相對分子質(zhì)量為5×103~4×104,水溶性明顯增強(qiáng),且活性基團(tuán)得以較好地保留。

3.SPS多糖抗凝血作用機(jī)制

SPS抗凝血的機(jī)制與肝素類似,它能提高抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)的活性,抑制凝血過程中必需的絲氨酸蛋白酶、凝血酶和活化因子(FXa)的活性。Church[9]的研究表明,巖藻聚糖濃度為10μg/mL時(shí)可激活肝素輔助因子Ⅱ(HCⅡ),使HCⅡ介導(dǎo)的抗凝血酶活性提高超過3500倍,而對的ATⅢ介導(dǎo)凝血酶的活化因子無太大影響,表明巖藻聚糖主要通過增強(qiáng)HCⅡ發(fā)揮了抗凝血的作用;Takashi[10]認(rèn)為,昆布硫酸多糖能顯著抑制內(nèi)源性途徑和外源性途徑凝血酶的產(chǎn)生,它主要是抑制凝血酶的產(chǎn)生過程,而不是抑制凝血酶的活性。此外,還有研究表明,低相對分子質(zhì)量巖藻糖可加強(qiáng)ATⅢ和HCⅡ?qū)δ傅囊种谱饔肹11];從綠藻Codiumcylindricum中提取的硫酸半乳糖體雖沒有增強(qiáng)ATⅢ和HCⅡ的活性,但可以直接抑制凝血酶活性以及血纖維蛋白的聚合[12]。

4.影響SPS抗凝血活性的主要因素

影響SPS抗凝血活性的因素很多。不同來源的硫酸多糖抗凝血的活性會(huì)有很大差別。Yasantha[5]比較了7種褐藻硫酸多糖的抗凝血活性,發(fā)現(xiàn)E.cava,S.horneri以及S.coreanum的抗凝血活性最強(qiáng),其它4種褐藻的抗凝血活性則較弱;Maria[13]研究了紅藻Gelidiumcrinale.硫酸多糖的結(jié)構(gòu)與抗凝血活性的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)2,3-二硫-α-半乳糖單元可增強(qiáng)抗凝血作用;Yasantha[5]測定了褐藻硫酸多糖酶解后多糖片斷的APTT、TT和PT活性,結(jié)果表明,相對分子質(zhì)量大于3×104的片斷表現(xiàn)出高抗凝血活性;Shanmugam等[14]的研究表明,相對分子質(zhì)量為(0.05~1)×104的巖藻聚糖有抗凝血活性,相對分子質(zhì)量大于8.5×104的片斷則沒有抗凝血活性;Susanne等[15]研究表明,硫酸多糖抗凝血活性與相對分子質(zhì)量呈啞鈴型曲線關(guān)系;Mariana[16]指出,呈線性結(jié)構(gòu)的硫酸半乳糖體的抗凝血活性依賴于所帶的電荷量、單糖的組分、硫酸基和糖苷鍵的位置等;Groth等[17]比較相同取代條件下硫酸化纖維素和磷酸化纖維素的抗凝血活性,發(fā)現(xiàn)后者的最低抗凝血濃度為2~5mg/mL,是前者的100倍;若以四元胺基取代硫酸化纖維素中的硫酸基,則其原有的抗凝血活性全部消失。表明雖然同為負(fù)電荷的取代基,其產(chǎn)生生物學(xué)活性的效果不同,硫酸根更能誘導(dǎo)抗凝血活性;Mulloy等[18]通過核磁共振分析發(fā)現(xiàn),保持硫酸基取代度不變,將硫酸軟骨素BC4位上的硫酸基變?yōu)镃6位硫酸基,其抗凝血活性完全喪失,表明C4位上的硫酸基發(fā)揮著抗凝血作用;王靜鳳等[19]的研究表明,枝管藻多糖普遍具有抗凝血作用,且有明顯的量-效依賴關(guān)系;施志儀[20]指出,褐藻糖膠有明顯的抗凝血作用,且靜脈注射的效果明顯好于腹腔注射。由此可見,影響SPS抗凝血活性的因素主要有硫酸多糖的來源、結(jié)構(gòu)、相對分子質(zhì)量大小、糖苷鍵的連接形式、單糖組成、硫酸基的含量與位置以及硫酸多糖的用量與攝入方式等。

5.應(yīng)用開發(fā)前景

全世界的藻類約3萬余種,迄今被人們廣泛利用的主要是紅藻、綠藻和褐藻3大類,約100余種。大量研究表明,SPS具有抗凝血活性,它具有抗血栓形成和溶解血栓的雙重作用,在溶栓的同時(shí)能防止新的血栓形成,這是目前臨床應(yīng)用的抗凝血?jiǎng)┖腿芩▌┒疾痪邆涞奶攸c(diǎn),所以,SPS有望取代肝素成為抗凝血藥物的新來源。中國海洋大學(xué)藥物所已經(jīng)利用褐藻膠研制出多糖硫酸酯(PSS)、甘糖酯(PGMS)等治療心腦血管疾病的藥物。我國有豐富的海藻資源,在開發(fā)具有抗凝血活性的SPS方面有著廣闊的發(fā)展前景。

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