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【論文關鍵詞】土霉素片;微生物限度檢查法

【論文摘要】目的:建立土霉素片的微生物限度檢查方法。方法:采用薄膜過濾法對土霉素片處理后,分別進行細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證。結果:金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的回收率均大于70%。結論:土霉素片采用薄膜過濾法檢查微生物限度方法成立。

TerramycinpiecemicroorganisminspectionmethodconfirmationWangYanningGuoLingbo

【Abstract】Objective:Establishmentterramycinpiecemicroorganismlimitinspectionmethod.Method:Usesthethinfilmtofilterthelawafterterramycinpieceprocessing,separatelycarriesonthebacterium,themoldandthesaccharomycetescountsthemethodconfirmation.Result:Thegoldenyellowstaphylococcusandthewhiterosaryfungusreturns-ratioisbiggerthan70%.Conclusion:Theterramycinpieceusesthethinfilmtofilterthelawinspectionmicroorganismlimitmethodtobetenable.

【Keywords】Terramycinpiece;Microorganismlimitinspectionmethod

土霉素是四環(huán)素類抗生素,能特異性地與細菌核糖體30S亞基的A位結合,抑制肽鏈的增長和影響細菌蛋白質(zhì)的合成,對細菌有廣譜抑菌作用。因此其微生物限度檢查不能用平皿法,而應采用薄膜過濾法消除其抑菌作用后再檢查。

1材料

1.1儀器:HWS-250型恒溫恒濕箱(天津蘇瑞科技開發(fā)有限公司),集菌儀(杭州泰林生物技術設備有限公司),薄膜(孔徑0.22um),康氏振蕩器。

1.2試劑:玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基,營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基,MUG培養(yǎng)基,甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基等,均由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.3菌種:陽性對照菌:金黃色葡萄球菌(驗證細菌)、白色念珠菌(驗證酵母菌、霉菌);陰性對照:金黃色葡萄球菌(驗證大腸埃希菌)。所用菌種均由中國藥品生物制品檢定所提供;稀釋劑及沖洗劑為pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液。

1.4樣品:土霉素片[0.25g(25萬單位)],廠家為河南華利藥業(yè)有限責任公司,批號為07070601。

2方法與結果

2.1細菌、霉菌、酵母菌檢查方法驗證。

2.1.1細菌檢測方法驗證。

2.1.1.1試驗組:取供試品10g,加入pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液,于康氏振蕩器上振搖10分鐘,使片分散,500轉、分離心后,分離上清液作為供試液。取上述供試液10ml,加入100ml稀釋劑中,薄膜過濾,用沖洗液沖洗2次,每次100ml,第3次沖洗液中加入金黃色葡萄球菌菌懸液0.5ml,薄膜過濾,取出濾膜,面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂平皿上,35℃培養(yǎng)48小時,計數(shù)。

2.1.1.2菌液組:取金黃色葡萄球菌菌懸液0.5ml,直接接種于營養(yǎng)瓊脂平皿上,35℃培養(yǎng)48小時,計數(shù)。

2.1.1.3供試品對照組:取上述供試液10ml,加入100ml稀釋劑中,薄膜過濾,用沖洗液沖洗3次,每次100ml,取出濾膜,面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂平皿上,35℃培養(yǎng)48小時,計數(shù)。

2.1.1.4稀釋劑對照組:取稀釋液10ml,薄膜過濾,用沖洗液沖洗2次,每次100ml,第3次沖洗液中加入0.5ml金黃色葡萄球菌菌懸液,薄膜過濾,取出濾膜,菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂平皿上,35℃培養(yǎng)48小時,計數(shù)。

2.1.1.5上述試驗連續(xù)做三次,結果如下:

金黃色葡萄球菌計數(shù)后平均值:

稀釋劑對照組菌數(shù):第一次47個,第二次53個,第三次49個;

菌液組菌數(shù):第一次58個,第二次64個,第三次60個;

試驗組菌數(shù):第一次45個,第二次54個,第三次46個;

供試品對照組菌數(shù):第一次0個,第二次0個,第三次0個。

2.1.1.6計算金黃色葡萄球菌回收率。

2.1.1.6.1稀釋劑對照組的回收率:(稀釋劑對照組的平均菌落數(shù)/菌液組的平均菌落數(shù))×100%

第一次:47/58×100%=81.0%

第二次:53/64×100%=82.8%

第三次:49/60×100%=81.7%

2.1.1.6.2試驗組的回收率:

[(試驗組的平均菌落數(shù)-供試品對照組平均菌落數(shù))/菌液組平均菌落數(shù)]×100%

第一次:(45-0)/58×100%=77.6%

第二次:(54-0)/64×100%=84.4%

第三次:(46-0)/60×100%=76.7%

2.1.2霉菌、酵母菌檢查方法驗證。

2.1.2.1試驗組:取供試品10g,加入pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液,于康氏振蕩器上振搖10分鐘,使片分散,500轉、分離心后,分離上清液作為供試液。取上述供試液10ml,加入100ml稀釋劑中,薄膜過濾,用沖洗液沖洗2次,每次100ml,第3次沖洗液中加入白色念珠菌菌懸液0.5ml,薄膜過濾,取出濾膜,面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂平皿上,23℃培養(yǎng)72小時,計數(shù)。

2.1.2.2菌液組:取白色念珠菌菌懸液0.5ml,直接接種于營養(yǎng)瓊脂平皿上,23℃培養(yǎng)72小時,計數(shù)。

2.1.2.3供試品對照組:取上述供試液10ml,加入100ml稀釋劑中,薄膜過濾,用沖洗液沖洗3次,每次100ml,取出濾膜,面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂平皿上,23℃培養(yǎng)72小時,計數(shù)。

2.1.2.4稀釋劑對照組:取稀釋液10ml,薄膜過濾,用沖洗液沖洗2次,每次100ml,第三次沖洗液中加入0.5ml白色念珠菌菌懸液,薄膜過濾,取出濾膜,菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂平皿上,23℃培養(yǎng)72小時,計數(shù)。

2.1.2.5上述試驗連續(xù)做三次,結果如下:

白色念珠菌計數(shù)后平均值:

稀釋劑對照組菌數(shù):第一次56個,第二次60個,第三次53個;

菌液組菌數(shù):第一次45個,第二次47個,第三次42個;

試驗組菌數(shù):第一次43個,第二次45個,第三次44個;

供試品對照組菌數(shù):第一次0個,第二次0個,第三次0個。

2.1.2.6計算白色念珠菌的回收率。

2.1.2.6.1稀釋劑對照組的回收率:

(稀釋劑對照組的平均菌落數(shù)/菌液組的平均菌落數(shù))×100%

第一次:45/56×100%=80.4%

第二次:47/60×100%=78.3%

第三次:42/53×100%=78.2%

2.1.2.6.2試驗組的回收率:

[(試驗組的平均菌落數(shù)-供試品對照組平均菌落數(shù))/菌液組平均菌落數(shù)]×100%

第一次:(43-0)/56×100%=76.8%

第二次:(45-0)/60×100%=75.0%

第三次:(44-0)/53×100%=83.0%

2.2大腸埃希菌檢測方法驗證。

2.2.1試驗組:取供試品10g,加入pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液,于康氏振蕩器上振搖10分鐘,使片分散,500轉/分離心后,分離上清液作為供試液。取上述供試液10ml,加入100ml稀釋劑中,薄膜過濾,用沖洗液沖洗2次,每次100ml,第三次沖洗液中加入大腸埃希菌菌懸液0.2ml,薄膜過濾,取出濾膜,放入100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中,35℃培養(yǎng)24小時,取0.2ml上述培養(yǎng)物加入5mlMUG培養(yǎng)基中,24小時后,加靛基質(zhì)試液5滴,液面呈現(xiàn)玫瑰紅環(huán)。

2.2.2陰性菌對照組:照上述方法操作,第三次沖洗時沖洗液中加入2ml金黃色葡萄球菌菌液,薄膜過濾,取出濾膜加入100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中,于35℃培養(yǎng)24小時,再取上述培養(yǎng)物劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基的平板上,于35℃培養(yǎng)24小時,未發(fā)現(xiàn)有金黃色葡萄球菌典型菌落。

3討論

3.1在細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法驗證三次平行試驗中,稀釋劑對照菌回收率均不低于70%,試驗組的菌回收率均不低于70%,照薄膜過濾法可進行土霉素片的細菌、霉菌及酵母菌的檢查。

3.2通過大腸埃希菌檢測方法驗證,陰性對照組未檢出金黃色葡萄球菌,試驗組檢出大腸埃希菌,按薄膜過濾法可進行土霉素片的大腸埃希菌檢查。