導(dǎo)語：人肝癌細(xì)胞凋亡影響半胱氨酸蛋白酶論文一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

【摘要】研究日本新近研制的第三代3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA，HMG-CoA）還原酶抑制劑匹伐他汀（pitavastatin，NK-104）對人肝癌細(xì)胞凋亡及半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）活性的影響。方法:采用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，以肝癌細(xì)胞系HepG2為靶細(xì)胞，以不同濃度的藥物處理細(xì)胞48h后，利用WST-8法測定NK-104對細(xì)胞增殖的影響;利用熒光染料Hoechst33258染色，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核碎片;以流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期的變化;采用半胱氨酸蛋白酶3比色法檢測caspase-3活性。結(jié)果:NK-104（10μmol/L）對HepG2細(xì)胞有明顯抑制作用，可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，并能增強(qiáng)caspase-3基因的活性。結(jié)論:NK-104能夠誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與caspase-3依賴性凋亡調(diào)節(jié)信號(hào)通路有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】肝癌

3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA，HMG-CoA）還原酶抑制劑，統(tǒng)稱為抑制素，是重要的脂類合成抑制劑，主要在人體肝臟中代謝，臨床上廣泛應(yīng)用于治療高脂血癥［1］。最近研究發(fā)現(xiàn)，HMG-CoA還原酶抑制劑具有生物學(xué)多效性，與降血脂無關(guān)。有報(bào)道其在體外具有抗癌作用［2］、體內(nèi)與5氟尿嘧啶（fluorouracil，5-Fu）共同作用能夠延長晚期肝癌患者的生存期［3］。匹伐他?。╬itavastatin，NK-104）是日本新近研制的第三代高效HMG-CoA還原酶抑制劑［4］。在血管內(nèi)皮細(xì)胞系NK-104通過磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide3-kinase/proteinkinaseB，PI3K-Akt）基因激活途徑對內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用已有報(bào)道［5］，但其在肝癌細(xì)胞系的抗癌作用尚未見報(bào)道。本文在肝癌細(xì)胞系HepG2通過2-（2-甲氧基-4-硝基苯）-3-（4-硝基苯）-5-（2，4-二硫代苯）-2H-四氮唑單鈉鹽｛［2-（2-methoxy-4-nitrophe-nyl）-3-（4-nitrophenyl）-5-（2，4-disulfophenyl）-2H-tetrazolium，monosodiumsalt］，WST-8｝、熒光染料Hoechst33258染色、流式細(xì)胞儀和半胱氨酸蛋白酶3比色法等檢測方法，研究NK-104對人肝癌細(xì)胞凋亡及半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）活性的影響，為NK-104在抗腫瘤中的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料和方法

1.1主要材料與儀器NK-104，日本興和有限公司（日本名古屋）和日產(chǎn)化學(xué)工業(yè)公司（日本東京）產(chǎn)品;熒光染料Hoechst33258、甲羥戊酸（mevalonicacid，MEV）和碘化丙啶（propidiumiodide，PI）染色液（PI100g/L，1%Triton100，9g/LNaCl），Sigma公司產(chǎn)品。流式細(xì)胞儀，2000FCA，美國BD公司產(chǎn)品。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞株HepG2（美國ATCC公司產(chǎn)品）在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基、5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞種植于適當(dāng)培養(yǎng)皿中，90%的細(xì)胞融合時(shí)，用磷酸鹽緩沖液洗凈后，加入適量含有NK-104和MEV（1mmol/L）等藥物的培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2WST-8方法利用WST-8試劑盒對細(xì)胞增殖進(jìn)行測定。HepG2細(xì)胞（1×104個(gè)細(xì)胞/孔）接種于含100μl培養(yǎng)液的96孔培養(yǎng)板中，NK-104（0.1～100μmol/L）治療48h后，分別加入WST-8試劑10μl（日本同仁化學(xué)研究所）培養(yǎng)2h后，選擇450nm波長，測定各孔的吸光度OD值。

1.2.3Hoechst33258染色細(xì)胞經(jīng)藥物刺激48h后，甲醇-冰乙酸（3∶1）細(xì)胞固定液4℃固定5min，磷酸鹽緩沖液稍洗后，點(diǎn)加Hoechst33258染色液，10min。用濾紙沾去多余液體，封片劑封片后熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核碎片。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測凋亡峰在室溫下將刺激48h后的細(xì)胞用冷磷酸鹽緩沖液洗滌2次，并在適當(dāng)?shù)娜旧彌_液中吸取100μl的細(xì)胞（1×105）至試管中。加入200μlRNaseA，37℃水浴30min，再加800μlPI染色液混勻，4℃避光30min后，立即上機(jī)分析。

1.2.5半胱氨酸蛋白酶3比色法經(jīng)藥物治療48h后收集細(xì)胞，采用半胱氨酸蛋白酶3比色法試劑盒按照廠家說明進(jìn)行測定（Medical&BiologicalLaboratoriesCo.，LTD，Japan）。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)均以x±s表示，采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1NK-104對HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用為了確定NK-104在人肝癌細(xì)胞HepG2中的治療濃度，采用WST-8方法對細(xì)胞的增殖作用進(jìn)行測定。與對照組相比，NK-104在10和100μmol/L時(shí)，對HepG2細(xì)胞生長均有明顯的抑制作用。100μmol/L時(shí)，近50%的細(xì)胞死亡（P<0.01）。見圖1。

圖1不同濃度NK-104對HepG2生長的抑制作用（略）

Figure1GrowthinhibitionofHepG2cellsbyNK-104

**P<0.01，vscontrolgroup.

2.2NK-104誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的形態(tài)變化對照組細(xì)胞界限清晰，胞漿豐富，細(xì)胞核呈彌散、均勻熒光分布，經(jīng)10～100μmol/LNK-104處理后，HepG2發(fā)生細(xì)胞凋亡，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見濃染致密的藍(lán)色熒光顆粒及明顯核形態(tài)變化。見圖2。

2.3NK-104對HepG2細(xì)胞周期的影響與對照組相比，NK-104治療組可明顯誘導(dǎo)HepG2的細(xì)胞凋亡，出現(xiàn)相當(dāng)比例的DNA含量小于二倍體的亞G1凋亡峰（24%），不同周期細(xì)胞的比例也發(fā)生變化，與MEV共同作用后可消除NK-104的這種誘導(dǎo)作用。見圖3。

2.4NK-104對caspase-3活性的影響與對照組相比，NK-104可明顯誘導(dǎo)caspase-3活性（P<0.01），同樣加入MEV能夠消除NK-104的這種誘導(dǎo)作用。見圖4。

圖2NK-104處理48h后HepG2細(xì)胞核的形態(tài)變化（Hoechst33258染色，×400）（略）

Figure2NuclearmorphologyoftheHepG2cellstreatedbyNK-104for48hours（Hoeschst33258staining，×400）

A:Control，normalnuclearstructure;B:NK-10410μmol/L;C:NK-104100μmol/L;●:Cytoplasmicchange;■:Nuclearfragmentation.

圖3NK-104治療HepG2細(xì)胞后細(xì)胞周期分布變化（略）

Figure3CellcycleanalysisofHepG2cellstreatedbyNK-104（PercentageofSubG1cells）

**P<0.01，vscontrolgroup.A:Control;B:NK-10410μmol/L;C:NK-104+MEV.

圖4NK-104對caspase-3活性的影響（略）

Figure4NK-104inducedactivityofcaspase-3

**P<0.01，vscontrolgroup.TheHepG2cellswereexposedtoNK-104（10μmol/L）alone，orNK-104（10μmol/L）plusMEV（1mmol/L）for48hours.Thecaspase-3activitywasmeasuredwithacolorimetricproteaseassay.

3討論

目前認(rèn)為惡性腫瘤是一種多基因異常的疾病，其發(fā)生的分子基礎(chǔ)是原癌基因的激活或抑癌基因的突變失活或缺失，導(dǎo)致某些細(xì)胞分化不良、凋亡受阻和增殖失控而形成腫瘤。原發(fā)性肝癌約55%發(fā)生在中國［6］。肝癌細(xì)胞的凋亡在肝癌的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)歸及治療等方面均有重要的意義。HMG-CoA還原酶抑制劑，是重要的脂類合成抑制劑，臨床上廣泛應(yīng)用于治療高脂血癥。最近研究表明，HMG-CoA還原酶抑制劑具有抗感染、降低炎性細(xì)胞因子水平及抗癌等生物學(xué)多效性作用。Otsuki等［7］報(bào)道1～30μmol/L的西米伐他?。╯imvastatin）具有預(yù)防癌癥的作用。Sutter等［8］研究認(rèn)為1～10μmol/L的弗魯伐他?。╢luvastatin）通過誘導(dǎo)Huh7細(xì)胞凋亡而抑制肝癌細(xì)胞的增殖。Denoyelle等［9］認(rèn)為25μg/L的賽里伐他?。╟erivas-tatin）對MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞通過抑制細(xì)胞核因子κB活性起到重要的抗轉(zhuǎn)移作用。HepG2細(xì)胞具有典型肝癌細(xì)胞的一系列惡性特征，是研究和評(píng)價(jià)防治肝癌藥物的較理想的細(xì)胞模型。NK-104是日本新近研制的第三代HMG-CoA還原酶抑制劑，具有副作用小、高效和強(qiáng)力的藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)［4］。我們的研究結(jié)果表明，NK-104對HepG2細(xì)胞增殖有明顯抑制作用，其最大抑制率可達(dá)50%左右，使HepG2細(xì)胞呈現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)特征，核質(zhì)濃集，有凋亡小體。提示NK-104能在一定程度上抑制肝癌細(xì)胞的增殖。流式細(xì)胞術(shù)具有檢測的細(xì)胞數(shù)量大、反映群體細(xì)胞的凋亡狀態(tài)比較準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)［10］。NK-104作用于HepG2細(xì)胞后，通過流式細(xì)胞儀分析，與對照組相比，可見凋亡細(xì)胞出現(xiàn)在直方圖亞二倍體峰位置，并與細(xì)胞主峰G0/G1分界清楚，可定量凋亡占整個(gè)細(xì)胞群百分比。本研究結(jié)果表明，NK-104可明顯誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡的核心成分是半胱氨酸蛋白酶家族（caspase），其中研究最多，功能相對較明確的為caspase-3。caspase-3是哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶之一，為凋亡的效應(yīng)分子，被稱為凋亡的“執(zhí)行者”［11～13］。激活的caspase-3可裂解相應(yīng)的胞核內(nèi)底物DNA修復(fù)酶（polyADP-ribosepolymerase，PARP），使PARP失去對DNA的修復(fù)功能，導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)向凋亡［14］。本研究表明，10μmol/LNK-104能夠增強(qiáng)caspase-3的活性，加入MEV能夠消除NK-104的這種誘導(dǎo)作用。這一研究結(jié)果表明，NK-104誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡與激活caspase-3依賴性凋亡調(diào)節(jié)信號(hào)通路有關(guān)。

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