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摘要摘要：目的觀察飼料中添加?；撬?/a>對光化學(xué)損傷后大鼠光感受器細(xì)胞凋亡的影響，并進(jìn)一步從氧化應(yīng)激基因cfos表達(dá)變化角度探索其防護(hù)機(jī)制。方法70只SD大鼠隨機(jī)分為對照組、?；撬峤M。分別喂飼標(biāo)準(zhǔn)飼料或添加4％?；撬犸暳衔癸?5d后接受(3000±200)lx持續(xù)0，1，3，6，9，12,24h光照，凋亡細(xì)胞原位末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測光感受器細(xì)胞凋亡情況并計算凋亡指數(shù)(AI)；RTPCR法及免疫印跡法檢測視網(wǎng)膜內(nèi)cfosmRNA以及蛋白表達(dá)水平。結(jié)果感光細(xì)胞凋亡指數(shù)隨光照時間延長逐漸增加，?；撬峤MAI顯著低于對照組(P%26lt;005)，其中光照12h?；撬峤M和對照組AI分別為(123±47)％和(324±62)％；視網(wǎng)膜cfosmRNA光照1h后一過性表達(dá)增高，?；撬峤M較對照組低(P%26lt;005)；光照后視網(wǎng)膜cfos蛋白表達(dá)逐漸升高，于3h達(dá)峰值，?；撬峤M顯著低于對照組(P%26lt;005)。結(jié)論在視網(wǎng)膜光化學(xué)損傷條件下，?；撬峥赡芡ㄟ^抑制視網(wǎng)膜cfos的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，阻斷光感受器細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)導(dǎo)從而保護(hù)視網(wǎng)膜。

摘要：牛磺酸；視網(wǎng)膜光化學(xué)損傷；凋亡細(xì)胞；cfos

Effectsoftaurineoncfosexpressionofratretinaafterphotochemicaldamage

Abstract摘要：ObjectiveToobservetheeffectofdietarysupplementationwithtaurineonphotoreceptorapoptosisandfurtherinvestigatechangesofcfosexpressionofratretinaafterphotochemicaldamage.MethodsSeventyratswererandomlydividedintocontrolgroup(Control)and4%taurinesupplementationgroup(Taurine).Thesubjectswereexposedto(3000±200)lxtransmittedbysixcoldwhitelightsfor0,1,3,6,9,12,24h.TheapoptoticphotoreceptorcellsweredetectedusingTUNELmethod;TotalRNAandproteinofretinawereextracted;relativecfosmRNAlevelsweredeterminedusingRT-PCRandcfosproteinlevelsweredetectedbywestern-blotanalysis.ResultsWiththelightexposuretimeprolonged,apoptosisindex(AI)ofphotoreceptorcellswaselevated,amongwhichtheAIof12hwere(12.3±4.7)%and(32.4±6.2)%inTaurineandcontrolgroup(P%26lt;0.05).ThecfosmRNAofratretinawastransientlyinducedafterone-hourlightexposureanditwaslowerintaurinegroup(P%26lt;0.05);cfosproteinlevelincreasedafterthreehourexposureanditwaslowerintaurinegroup(P%26lt;0.05).ConclusionTaurinecanpartlyreducethetranscriptionandtranslationofc-fos,whichwouldfurtherinhibittheapoptosissignaltransductionandprotecttheratretinafromphotochemicaldamage.

Keywords摘要：taurine;photochemicaldamage;apoptoticcell;cfos

視網(wǎng)膜是視覺形成的重要組織結(jié)構(gòu)，若光照時間或光照強(qiáng)度等超過視網(wǎng)膜承受力，則會導(dǎo)致光化學(xué)損傷〔1〕，損傷早期視功能減退，光感受器細(xì)胞丟失，后期內(nèi)層神經(jīng)元變性壞死，最終導(dǎo)致失明〔12〕。近年探究認(rèn)為，凋亡是視網(wǎng)膜光化學(xué)損傷中光感受器細(xì)胞丟失的主要機(jī)制〔1,3〕，持續(xù)高強(qiáng)度光照使視網(wǎng)膜內(nèi)自由基和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物激增，同時氧化應(yīng)激基因AP1表達(dá)上調(diào)促進(jìn)凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，且證實其亞單位cfos是必需調(diào)控因子。?；撬岷鸵暰W(wǎng)膜生長發(fā)育和功能維持關(guān)系密切，前期實驗已證實，4％?；撬崮苡行ПＷo(hù)光化學(xué)損傷條件下的大鼠視網(wǎng)膜〔4〕。本探究擬進(jìn)一步觀察其對光感受器細(xì)胞凋亡的影響，并從cfos表達(dá)變化角度探索防護(hù)機(jī)制。

1材料和方法

11實驗動物及分組清潔級SD大鼠(第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院動物中心)70只，體重150g左右，雌雄各半。隨機(jī)分為對照組、牛磺酸組，分別喂飼標(biāo)準(zhǔn)飼料或添加4％?；撬?北京世紀(jì)維他生物技術(shù)有限公司，純品)飼料15d后，各組5只大鼠分別接受(3000±200)lx持續(xù)0，1，3，6，9，12，24h光照。

12凋亡細(xì)胞的原位末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測光感受器細(xì)胞凋亡情況大鼠光照后立即取出眼球，4％多聚甲醛固定過夜，常規(guī)石蠟切片，TUNEL試劑盒(德國Roche公司)檢測視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞凋亡情況參照試劑說明書，計數(shù)10個油鏡視野下每張切片TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)，其和光感受器細(xì)胞總數(shù)比值為光感受器細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)。

13視網(wǎng)膜總RNA提取及RTPCR大鼠光照后立即取出眼球，解剖顯微鏡下小心剝離視網(wǎng)膜，參考Trizol試劑說明書常規(guī)提取總RNA，核酸蛋白檢測儀測定其含量和純度。-20℃保存?zhèn)溆谩TPCR按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行，以大鼠βactin為內(nèi)參，上游引物序列為5′GACCCAGATCATGTTTGAGACC-3′，下游引物序列為5′GCCAGGATAGAGCCACCAAT-3′，退火溫度為554℃，產(chǎn)物長度為684bp；cfos上游引物序列為5′GCCTTTCCTACTACCATTCC-3′，下游引物序列為5′ATCTTATTCCTTTCCCTTCG-3′，退火溫度為533℃，產(chǎn)物長度為370bp。擴(kuò)增條件為94℃5min40s，各退火溫度45s，循環(huán)32次，72℃10min。2％瓊脂糖凝膠電泳，Bio-Rad凝膠成像分析系統(tǒng)掃描以及分析。PCR特異條帶以相對吸光度×面積(mm2)表示，以各組的校正吸光度和其βactin校正吸光度的比值表示(V)。

14免疫印跡法測定視網(wǎng)膜cfos蛋白表達(dá)情況大鼠光照后立即取出眼球，剝離視網(wǎng)膜，常規(guī)方法提取總蛋白，Lowry法定量?？偟鞍?40μg)經(jīng)十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)(5％積層膠、12％分離膠)后，采用BioRad半干轉(zhuǎn)印儀將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，利用cfos多克隆抗體(1摘要：150稀釋，北京中杉生物制劑公司)檢測膜上蛋白。BioRad凝膠成像分析系統(tǒng)分析相對表達(dá)量，以0h組蛋白表達(dá)量為內(nèi)參，其他各個時相點(diǎn)灰度值和內(nèi)參比值為相對灰度值(A)。

15統(tǒng)計分析采用SPSS100統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析。

2結(jié)果

21?；撬釋庹蘸蟠笫笠暰W(wǎng)膜光感受器細(xì)胞凋亡的影響對照組光照6h后，發(fā)現(xiàn)棕褐色TUNEL陽性細(xì)胞散在分布于外核層(ONL)內(nèi)部，即受損的多為視桿細(xì)胞，而牛磺酸組光照9h后才開始出現(xiàn)陽性細(xì)胞，隨光照時間延長，陽性感光細(xì)胞增多，光照24h后視網(wǎng)膜內(nèi)核層、節(jié)細(xì)胞層也出現(xiàn)大量陽性細(xì)胞(圖1)。光化學(xué)損傷后AI隨光照時間延長逐漸增高，?；撬峤M光照12hAI值(123±47)％顯著低于對照組(324±62)％，其他時相點(diǎn)也顯著低于對照組(P%26lt;005)。

A摘要：對照組，光照0h；B摘要：對照組，光照9h；C摘要：?；撬峤M，光照9h

圖1?；撬釋饣瘜W(xué)損傷后大鼠視網(wǎng)膜光感受器凋亡的影響(TUNEL，×400)（略）

22牛磺酸對光照后大鼠視網(wǎng)膜cfos轉(zhuǎn)錄以及表達(dá)的影響

221?；撬釋庹蘸蟠笫笠暰W(wǎng)膜cfosmRNA表達(dá)的影響光照后對照組和牛磺酸組大鼠視網(wǎng)膜cfosmRNA表達(dá)均出現(xiàn)一過性增高，且在光照1h達(dá)到峰值，隨著光照時間延長其表達(dá)逐漸降低，于6h光照后其表達(dá)量接近未光照水平(圖2)。利用灰度掃描計算V值發(fā)現(xiàn)，光照1h時?；撬峤M大鼠視網(wǎng)膜cfosmRNA較對照組表達(dá)低(P%26lt;005)。

222牛磺酸對光照后大鼠視網(wǎng)膜cfos蛋白表達(dá)的影響光照后2組動物視網(wǎng)膜cfos蛋白表達(dá)逐漸增高，于光照3h達(dá)到峰值，隨光照時間延長其表達(dá)量逐漸降低，光照12h其表達(dá)量接近未光照時水平(圖3)。A分析提示?；撬峤M3h蛋白表達(dá)相對量比對照組低(P%26lt;005)。

D摘要：對照組；T摘要：?；撬峤M

圖2不同光照時間對大鼠視網(wǎng)膜cfosmRNA表達(dá)的影響（略）

D摘要：對照組；T摘要：?；撬峤M

圖3不同光照時間對大鼠視網(wǎng)膜中cfos蛋白表達(dá)的影響（略）

3討論

視網(wǎng)膜光化學(xué)損傷后光感受器細(xì)胞丟失的機(jī)制尚存在一定的爭議，但大部分探究者認(rèn)為，凋亡是光化學(xué)損傷以及其他視網(wǎng)膜變性疾病光感受器細(xì)胞丟失的主要機(jī)制〔3，5〕。本探究在前階段證實，4%牛磺酸能有效保護(hù)持續(xù)高強(qiáng)度光照〔(3000±20)lx，24h〕條件下大鼠視網(wǎng)膜基礎(chǔ)上，結(jié)合凋亡細(xì)胞生化特征，采用TUNEL法檢測凋亡細(xì)胞。實驗結(jié)果提示，?；撬釡p少了光照不同時相點(diǎn)凋亡指數(shù)，和其他探究報道〔6，7〕牛磺酸具有抗神經(jīng)元凋亡功能相符。近年探究發(fā)現(xiàn)，AP1是調(diào)控光感受器細(xì)胞凋亡的重要影響因子，其亞基cfos是必需的調(diào)控因子〔3，8〕。AP1參和了許多生理過程如細(xì)胞增殖、分化、死亡及惡性轉(zhuǎn)化等，脂多糖、氧化應(yīng)激、紫外線等均能增加其活性，并通過調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄發(fā)揮功能〔7〕，其中，cjun／cfos二聚體形式的AP1復(fù)合物生物活性最強(qiáng)〔6〕。光損傷條件下cfos(-／-)大鼠光感受器細(xì)胞幾乎未丟失，以及大鼠、小鼠和661W光感受器細(xì)胞短期光照后cfosmRNA表達(dá)一過性增高，均說明cfos在光誘導(dǎo)光感受器細(xì)胞凋亡中促進(jìn)凋亡功能〔3，8〕。本探究發(fā)現(xiàn),?；撬峤McfosmRNA以及蛋白表達(dá)峰值均比對照組低，推測?；撬峥赡芡ㄟ^抑制cfos表達(dá)，導(dǎo)致整個AP1復(fù)合物減少，阻斷凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而有效保護(hù)光感受器細(xì)胞。文獻(xiàn)報道，TauCl能降低FLS細(xì)胞AP1活性，而?；撬岵荒堋?〕。因此，?；撬峥赡芡ㄟ^捕捉次氯酸(HOCI)形成TauC1，TauCl才是?；撬岬幕钚孕问剑鲜鐾普撨€需進(jìn)一步證實。

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