導(dǎo)語：人肺上皮細(xì)胞蛋白酶激活論文一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

【摘要目的摘要:蛋白酶激活受體（proteaseactivatedreceptors,PARs）廣泛分布在多種組織細(xì)胞上，但4種PARs在肺上皮細(xì)胞的表達(dá)情況尚不清楚.我們用A549細(xì)胞探究PARs在肺上皮細(xì)胞的表達(dá).方法摘要:采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）、流式細(xì)胞儀和免疫熒光細(xì)胞染色分析技術(shù)分析肺上皮細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞PARs的表達(dá)情況.結(jié)果摘要:4種PARs在肺上皮細(xì)胞上均有不同程度的表達(dá).結(jié)論摘要:肺上皮細(xì)胞同時表達(dá)PAR1~44種受體，這為進(jìn)一步探究PARs在肺上皮細(xì)胞的功能奠定了基礎(chǔ).

【蛋白酶激活受體；肺上皮細(xì)胞；RTPCR；流式細(xì)胞術(shù)；免疫熒光細(xì)胞染色

0引言

蛋白酶激活受體（proteaseactivatedreceptors,PARs）屬G蛋白耦聯(lián)受體家族，目前共發(fā)現(xiàn)4個成員摘要：PAR1，PAR2，PAR3，PAR4.蛋白酶可以酶切PAR的N末端，暴露含有系鎖配體的新的N末端，可自我激活PAR功能［1］.探究顯示，PARs分布在多種組織細(xì)胞上，包括血小板、白細(xì)胞、肥大細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、消化道上皮細(xì)胞等.PAR被激活后，可介導(dǎo)跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)從而參和凝血、炎癥、變態(tài)反應(yīng)等生理和病理過程的發(fā)生［2］.許多組織上皮表達(dá)的PARs可能在不同的病理過程中起功能，雖然一些組織的PARs的分布已有探究，但4種PARs在肺上皮的表達(dá)情況和功能還不是十分清楚.因此，我們利用培養(yǎng)的人肺癌上皮細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞探索四種PARs在肺上皮細(xì)胞上的表達(dá)特征.

1材料和方法

1.1材料

人肺癌上皮細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞探究所,青、鏈霉素、非酶性細(xì)胞分離液購于Sigma公司，DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）購自Gibco公司，TRIZOLReagent購自Invitrogen公司,TAKARALARTPCRkit,購自TAKARA公司，SYBRGreenI核酸凝膠染料購自BMA公司,PCRMarkers購自Biolabs公司.PE標(biāo)記的小鼠抗人PAR1和PAR2mAb,兔抗人PAR3和兔抗人PAR4多克隆抗體及相應(yīng)的同型對照均購自SantaCruz公司.FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗購自BDPharmingen公司.PCR儀PTC200購自MJResearch公司，激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)購自日本Nikon公司，F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀購自BectonDickinson公司.

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)人肺癌上皮細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞接種于50mL培養(yǎng)瓶內(nèi)，用DMEM完全培養(yǎng)液（含100g/LFBS，1×105u/L青霉素和100mg/L鏈霉素），于37℃,50mL/LCO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

1.2.2RTPCR收集培養(yǎng)的A549細(xì)胞，用TRIZOLReagent提取細(xì)胞總RNA，具體操作步驟按試劑說明進(jìn)行.RNA經(jīng)10g/L瓊脂糖電泳后，按TAKARARTPCRkit說明進(jìn)行cDNA合成.逆轉(zhuǎn)錄的條件為摘要：oligod(T),42℃30min，99℃5min,5℃5min.PAR1，PAR2，PAR3，PAR4和βactin的特異性引物均由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成.βactin（F）5′AGGGGCCGGACTCGTCATACT3′,（R）5′GGCGGCAACACCATGTACCCT3′，PAR1（F）5′CAGCTCCTGGCTGACACTCTTTGTC3′，（R）5′CGAGCAGGGTTTCATTGAGCACAT3′,PAR2（F）5′GCAGCCTCTCTCTCCTGCAGTGG3′，（R）5′CTGAGGCAGGTCATGAAGAGAATGG3′，PAR3（F）5′GGCTGGACAGGAGCCACGAT3′，（R）5′AGCGGTTGATGCTGATGCAGG3′,PAR4（F）5′GGATCGCCTACCACCTGCGTG3′，（R）5′CCCGTAGCACAGCAGCATGG3′.βactin的PCR擴增條件為摘要：94℃2min,94℃30s,55℃30s,72℃30s,35個循環(huán),72℃10min.PAR1,PAR2,PAR3和PAR4的PCR擴增條件為摘要：94℃2min,94℃30s,67℃30s,72℃1min,35個循環(huán),72℃10min.PAR1,PAR2,PAR3和PAR4擴增的目的片段分別為500,461,403和401bp；βactin的擴增片段為202bp.PCR擴增片段經(jīng)測序驗證.

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)分析待培養(yǎng)細(xì)胞生長至70%~80%時，用非酶性細(xì)胞分離液懸浮細(xì)胞，10g/LBSA/PBS洗2次，調(diào)整細(xì)胞密度為5×109~1×1010/mL，40g/L多聚甲醛室溫固定10min,按說明書分別加入1∶20PE標(biāo)記的抗PAR1、抗PAR2小鼠抗人mAb、1∶20抗PAR3、抗PAR4兔多克隆抗體及相應(yīng)的同型對照抗體，4℃避光孵育30min,10g/LBSA/PBS洗2次;PAR3,PAR4管再加入FITC標(biāo)記的羊抗兔Ig二抗，4℃避光孵育30min,10g/LBSA/PBS洗2次,最后各管均加入500μL1×PBS懸浮細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀CELLQUEST軟件檢測和分析上皮細(xì)胞PAR的表達(dá)情況.

1.2.4免疫熒光細(xì)胞染色將A549細(xì)胞接種于8孔顯微鏡玻片培養(yǎng)過夜，用10g/LBSA/PBS漂洗后加入甲醇固定20min,然后用10g/LBSA/PBS孵育5min，加入1∶20的PE標(biāo)記的抗PAR1、抗PAR2小鼠抗人mAb、抗PAR3、抗PAR4兔多克隆抗體及相應(yīng)的同型對照抗體，室溫避光孵育1h,10g/LBSA/PBS洗3次,PAR3，PAR4管再加入FITC標(biāo)記的羊抗兔Ig二抗，室溫避光孵育1h,10g/LBSA/PBS洗3次,最后用甘油封片，共聚焦顯微鏡下觀察.

2結(jié)果

2.1肺上皮細(xì)胞PARsmRNA的表達(dá)肺上皮細(xì)胞表達(dá)PAR1，PAR2，PAR3和PAR4的mRNA，擴增PAR1，PAR2，PAR3和PAR4mRNA的長度分別為500,461,403和401bp（Fig1）.

2.2肺上皮細(xì)胞PARs蛋白質(zhì)的表達(dá)流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)肺上皮細(xì)胞表達(dá)PAR1，PAR2，PAR3和PAR4，其中PAR4的表達(dá)為最強，PAR1和PAR3的表達(dá)水平較相似，PAR2的表達(dá)水平最弱.免疫熒光細(xì)胞染色分析進(jìn)一步證實上述PARs在肺上皮細(xì)胞上的表達(dá)（Fig2）.

Fig2ImmunofluorescencestainingofPARsonlungepithelialcells

圖2免疫熒光細(xì)胞染色分析檢測肺上皮細(xì)胞PAR的表達(dá)

3討論

PARs家族共有PAR1，PAR2，PAR3和PAR44個成員，凝血酶可激活PAR1、PAR3和PAR4，而PAR2可被胰蛋白酶、肥大細(xì)胞類胰蛋白酶和活化的凝血因子Ⅹ所激活［3-5］.另外，這些受體還可被相應(yīng)的PARs激動肽所激活.其中PAR1是凝血酶的高親和力受體，而PAR4只能被高濃度凝血酶激活.探究顯示，凝血酶通過PAR1和PAR4途徑協(xié)同互補介導(dǎo)血小板的活化，而PAR3作為PAR4的輔助因子，在血小板活化中也起著一定功能［6］，除參和凝血外，多種細(xì)胞類型PARs的廣泛激活還可參和血管損傷反應(yīng)［7,8］.PAR2的激活可參和細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)的釋放,增加微血管的滲出以及中性粒細(xì)胞的趨化,血管擴張,血管收縮,細(xì)胞增殖等炎癥的病理過程.此外，在不同的生理和病理條件下，體內(nèi)不同的內(nèi)源性蛋白酶的存在，可能會激活同一細(xì)胞上的PAR2.

我們利用RTPCR、流式細(xì)胞儀和免疫熒光細(xì)胞染色分析技術(shù)檢測到了4種PARs在肺上皮細(xì)胞上的表達(dá).肺上皮細(xì)胞作為首先接觸吸入性抗原的組織細(xì)胞之一，在變態(tài)反應(yīng)性疾病的發(fā)病機制中起重要功能，它能夠合成和釋放許多前炎癥細(xì)胞因子和趨化性細(xì)胞因子，包括IL1，IL6，IL8，GMCSF，MIP，RANTES和eotaxin等［3,9］，還可以合成抗炎因子如PGE2和NO［10］.通過這些因子的功能來募集、激活炎癥性細(xì)胞從而調(diào)節(jié)機體的炎癥過程，尤其是PAR2的激活可多方面參和肺部炎癥的發(fā)生和發(fā)展.我們也曾經(jīng)用胰蛋白酶和PAR2激動肽激活肺上皮細(xì)胞，誘導(dǎo)其產(chǎn)生了趨化性細(xì)胞因子MCP1［11］，但其釋放的機制及肺上皮細(xì)胞表達(dá)PARs的生理和病理生理意義還有待進(jìn)一步的探索.

【參考文獻(xiàn)

［1］De′ryO,CorveraCU,SteinhoffM,etal.Proteinaseactivatedreceptors摘要:Novelmechanismsofsignalingbyserineproteases［J］.AmJPhysiol,1998；274（6Pt1）摘要:C1429-C1452.

［2］OssovskayaVS,BunnettNW.Proteaseactivatedreceptors摘要:Contributiontophysiologyanddisease［J］.PhysiolRev,2004；84(2)摘要:579-621.

［3］AsokananthanN,GrahamPT,FinkJ,etal.Activationofproteaseactivatedreceptor(PAR)1,PAR2,andPAR4stimulatesIL6,IL8,andprostaglandinE2releasefromhumanrespiratoryepithelialcells［J］.JImmunol,2002；168（7）摘要:3577-3585.

［4］HeS,AslamA,GacaMD,etal.Inhibitorsoftryptaseasmastcellstabilizingagentsinthehumanairways摘要:Effectsoftryptaseandotheragonistsofproteinaseactivatedreceptor2onhistaminerelease［J］.JPharmacolExpTher,2004；309(1)摘要:119-126.

［5］OBrienPJ,MolinoM,KahnM,etal.Proteaseactivatedreceptors摘要:Themeandvariations［J］.Oncogene,2001;20（13）摘要:1570-1581.

［6］MacfarlaneSR,SeatterMJ,KANKET,etal.ProteinaseActivatedReceptors［J］.PharmacolRev,2001；53(2)摘要:245-282.

［7］CoughlinSR.Proteaseactivatedreceptorsinvascularbiology［J］.ThrombHaemost,2001；86(1)摘要:298-307.

［8］GriffinCT,SrinivasanY,ZhengYW,etal.Aroleforthrombinreceptorsignalinginendothelialcellsduringembryonicdevelopment［J］.Science,2001；293(5535)摘要:1666-1670.

［9］StellatoC,BeckLA,GorgoneGA,etal.ExpressionofthechemokineRANTESbyahumanbronchialepithelialcellline摘要:Modulationbycytokinesandglucocorticoids［J］.JImmunol,1995；155(1)摘要:410-418.

［10］KnightDA,StewartGA,ThompsonPJ.Therespiratoryepitheliumandairwaysmoothmusclehomeostasis摘要:Itsrelevancetoasthma［J］.ClinExpAllergy,1994；24(8)摘要:698-706.

［11］王海燕,何韶衡.蛋白酶激活受體2激動劑誘導(dǎo)上皮細(xì)胞分泌MCP1［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2004;25(19)摘要：1782-1784.