導(dǎo)語：脊神經(jīng)根所致脊髓運動論文一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

【摘要目的摘要：探索脊神經(jīng)根性撕脫傷后脊髓運動神經(jīng)元中Eta1mRNA表達(dá)的意義.方法摘要：首先建立脊神經(jīng)根性撕脫傷的動物模型，采用原位雜交和免疫組織化學(xué)方法檢測損傷前后Eta1mRNA在脊髓運動神經(jīng)元中表達(dá)的變化.結(jié)果摘要：損傷前Eta1在脊髓運動神經(jīng)元中微量表達(dá).損傷后3d，損傷側(cè)脊髓運動神經(jīng)元總數(shù)減少31.6%，但表達(dá)Eta1的運動神經(jīng)元數(shù)量增加52.5%.結(jié)論摘要：脊神經(jīng)根撕脫后Eta1在脊髓運動神經(jīng)元內(nèi)上調(diào)表達(dá)可能是對神經(jīng)元本身的一種保護(hù).

【Eta1；脊髓；脊神經(jīng)根/損傷

0引言

Eta1是一種磷酸化糖蛋白［1］，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥［2,3］及創(chuàng)傷愈合過程中起到一定功能.然而，有關(guān)脊神經(jīng)根性撕脫傷后Eta1mRNA在脊髓運動神經(jīng)元中表達(dá)的變化及意義尚無相關(guān)報道.我們建立脊神經(jīng)根撕脫的動物模型，探究脊神經(jīng)根撕脫是否可以改變Eta1在大鼠脊髓運動神經(jīng)元中的表達(dá)水平.

1材料和方法

1.1材料

雄性Wistar鼠8wk齡，體質(zhì)量200g，30只.用14g/L氟烷及1.5L/minO2對動物行吸入麻醉，于髂嵴上方作左旁正中切口，長約2.5cm.沿中線剝離左側(cè)最長肌，并用小剪刀剪除L5橫突.將經(jīng)過L5橫突的L3,L4神經(jīng)根和四周組織分開，用小鉤將其輕輕提起，并用小血管鉗將其從椎間孔拉出，逐層關(guān)閉切口，制成L3,L4神經(jīng)根的椎管外撕脫模型.術(shù)后1，3，7，14或21d處死動物.如文獻(xiàn)［4］所述方法，在戊巴比妥麻醉下，通過灌注泵用冷生理鹽水及40g/L的低溫多聚甲醛（溶于pH7.4的PBS中）對實驗鼠進(jìn)行心內(nèi)灌注.收集含有L3，L4脊髓的組織塊，于固定液中4℃過夜固定，然后低溫保護(hù)于含200g/L蔗糖的PBS溶液中過夜.用恒溫切片機(jī)(LeicaMicrosystems,Wetzlar,Germany)切取12μm的切片并放置于多聚賴氨酸包埋的載玻片上.

1.2方法Nissl染色，利用甲酚紫對切片進(jìn)行染色.原位雜交，依文獻(xiàn)［5］所述進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄.用BamHI或XbaI切割含有鼠ETA1cDNA序列（核苷酸從259到1025）的pCRⅡ質(zhì)粒(Invitrogen)，使之線性化.按照操作說明書，利用digoxigeninRNA標(biāo)記物（Roche）及SP6,T7的RNA聚合酶（Takara），從線性化的質(zhì)粒中進(jìn)行正義、反義RNA探針的體外轉(zhuǎn)錄.用文獻(xiàn)［6］所述方法的改良法進(jìn)行原位雜交.以正義探針雜交組作為陰性對照.原位雜交反應(yīng)后，PBS清洗切片5min，然后和一抗在4℃下反應(yīng)過夜.一抗為單克隆小鼠抗NeuN抗體(1∶400).切片用PBS沖洗3次以上，每次10min.最后和Alexa熒光488共軛的羊抗小鼠IgG抗體反應(yīng)并用熒光固定劑(DakoCytomation,Copenhagen)固定于載玻片上.如文獻(xiàn)［5］所述進(jìn)行免疫組化反應(yīng).一抗是鼠抗神經(jīng)細(xì)胞核抗體(NeuN;1∶400;ChemiconInternational,Temecula,Calif).隨機(jī)從切片中同側(cè)及對側(cè)的脊髓前角選取0.147mm2大小的范圍，計數(shù)NeuN和Eta1陽性細(xì)胞.

統(tǒng)計學(xué)處理摘要：采用方差分析評估組間差異，并用LSD法進(jìn)行均數(shù)間的多重比較.P%26lt;0.05為有顯著意義.

2結(jié)果

脊神經(jīng)根撕脫傷可造成脊髓運動神經(jīng)元的逐漸減少（Fig1A,B）.從傷后3d起，損傷側(cè)前角運動神經(jīng)元數(shù)目開始明顯減少，而同期對側(cè)前角運動神經(jīng)元的減少則不明顯.運動神經(jīng)元的減少隨時間顯著增加，在傷后21d時，傷側(cè)已有50%以上的運動神經(jīng)元降解，傷側(cè)運動神經(jīng)元的數(shù)量為對側(cè)的45%（Fig2）.此時對側(cè)運動神經(jīng)元的減少和對照組比較也有顯著差異（P%26lt;0.05）.在正常對照組運動神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)觀察到Eta1mRNA的微弱表達(dá)（Fig3A）.損傷后3d，在傷側(cè)運動神經(jīng)元細(xì)胞中的雜交信號水平升高（Fig3B）.在21d時，Eta1mRNA的表達(dá)恢復(fù)到正常水平.NeuN的熒光免疫組化及Eta1的原位雜交（Fig4A，B）兩種方法證實Eta1在運動神經(jīng)元細(xì)胞的表達(dá).傷后3d，比較損傷側(cè)及對側(cè)的前角運動神經(jīng)元（NeuN陽性）表達(dá)Eta1的細(xì)胞數(shù)量，雖然傷側(cè)NeuN陽性的神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量減少31.6%，但表達(dá)Eta1的細(xì)胞數(shù)量增加了52.5%（Fig5）.

3討論

本實驗提示，脊神經(jīng)根撕脫后，Eta1在脊髓運動神經(jīng)元中的表達(dá)上調(diào).雖然由于神經(jīng)元的死亡，脊髓前角中NeuN陽性的神經(jīng)元減少，但Eta1陽性的神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量是增加的.這表明撕脫傷引起運動神經(jīng)元細(xì)胞中Eta1表達(dá)的上調(diào)，以此對運動神經(jīng)元起保護(hù)功能.Chabas等［7］報道，在實驗性自身免疫腦脊髓炎的急性期和復(fù)發(fā)期，Eta1在腦和脊髓的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元細(xì)胞中均有表達(dá)，而在緩解期無表達(dá).因為脊神經(jīng)根撕脫傷模型也可被視為中樞神經(jīng)系統(tǒng)［8］炎性反應(yīng)的模型，所以這兩個獨立實驗的相似結(jié)果，進(jìn)一步證實Eta1在神經(jīng)元細(xì)胞中可能存在保護(hù)功能.另外，在其他一些實驗中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果，如Eta1可以保護(hù)腫瘤細(xì)胞［9］，還能促進(jìn)培養(yǎng)細(xì)胞的發(fā)育，防止培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元缺氧死亡［10］也支持這一論點.］

綜上所述，在脊神經(jīng)根撕脫傷后的運動神經(jīng)元中可觀察到Eta1表達(dá)的上調(diào).我們認(rèn)為Eta1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中可能存在著不同于促進(jìn)炎癥反應(yīng)的其他功能，即保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞抵御iNOS介導(dǎo)的降解的功能.致謝摘要：大阪大學(xué)Dr.ShintaroNomura提供含有Eta1cDNA序列的質(zhì)粒.

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