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【摘要目的摘要:克隆人膀胱逼尿肌中腎上腺素能β3受體基因全長，并構(gòu)建其反義真核表達載體.方法摘要:采用RTPCR法從人膀胱逼尿肌中擴增出β3AR的全長cDNA序列，上游引物5′端加有BamHI及ClaI酶切位點，下游引物加有HindIII酶切位點，將該片段插入pUC18載體中，搖菌擴增后，用ClaI和HindIII切下目的基因，然后將目的片段反向插入逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體pLNCX上.最后對產(chǎn)生的重組子進行瓊脂糖凝膠電泳和測序鑒定.結(jié)果摘要：經(jīng)瓊脂糖凝膠鑒定，所克隆的目的基因大約為1.2kb，并成功地連接到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCX上，經(jīng)測序證實，插入的目的片段其堿基序列和Genbank上報道的完全一致，且插入載體的方向完全正確.結(jié)論摘要：成功克隆了人逼尿肌中腎上腺素能β3受體基因的全長cDNA序列和構(gòu)建了其反義真核表達載體.

【受體;腎上腺素能β3;載體

0引言

膀胱逼尿肌活動亢進是下尿路癥狀的常見原因.探究發(fā)現(xiàn)，腎上腺素能β受體（βadrenoceptor,βAR）亞型能夠介導膀胱平滑肌松弛，對維持儲尿過程中膀胱良好的順應性起著關(guān)鍵功能［1］.但何種βAR亞型介導逼尿肌松弛，國內(nèi)外學者還有一定的爭論［2-3］.為進一步探索βAR亞型在逼尿肌中功能奠定基礎，我們擬采用反義基因（antisense）技術(shù)，構(gòu)建βAR亞型的反義真核表達載體，封閉三種βAR中的任意兩個，得到表達單一亞型的細胞克隆，再進一步進行探究，以確定βAR激活對逼尿肌細胞的松弛和增殖的影響，并為尋找新的最終解決膀胱逼尿肌活動亢進的治療方法提供理論依據(jù).

1材料和方法

1.1材料人膀胱逼尿肌標本取自手術(shù)中因膀胱癌而行膀胱全切患者標本，取正常組織的膀胱平滑肌約1g，迅速放入液氮中10min，再放入-70℃冰箱中保存.pUC19購于Takara公司；逆轉(zhuǎn)錄病毒載體plncx購自Invitrogen公司；JM109大腸桿菌感受態(tài)菌株購自Takara公司.限制性內(nèi)切酶和DNA工具酶BamHI，HindIII，ClaI等內(nèi)切酶購于華美生物有限公司；RNase和T4DNA連接酶購于Promega公司.Trizol試劑及RNALAPCRTMKit(AMV)購自大連寶生物公司；QiAquickGelExtractionKit購于Qiagen公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自Gibco公司.

1.2方法

1.2.1人膀胱逼尿肌中β2AR全長基因的克隆稱取冰凍狀態(tài)下的膀胱逼尿肌組織約200mg，采用寶生物公司的Trizol試劑并按使用說明書操作提取總RNA，10g/L低熔點瓊脂糖凝膠鑒定RNA的含量及完整性.根據(jù)Genebank提供的β3AR基因序列（NM_000024）采用Oligo6.6軟件設計如下兩對引物，外引物及內(nèi)引物，應用套式PCR來擴增目的基因.

內(nèi)引物摘要：上游引物F01摘要：5′CCGGATCCATCGATATGGGGCAACCCGGGAACGG3′,下游引物R01摘要：5′AGGAAGCTTTTACAGCAGTGAGTCATTTG3′;外引物摘要：上游引物F02摘要：5′TGCGCTTACCTGCCAGACTG3′,下游引物R02摘要：5′GCCCTTCCTTCTGCATATCTC3′.

其中內(nèi)引物是針對蛋白質(zhì)編碼區(qū)（CDS摘要:220~1461bp）設計的，其上游加有BamHI及ClaI酶切位點，下游加有HindIII位點，使其能反向連接在pLNCX的多克隆位點上.外引物F02，R02可擴增βARcDNA第194~1587bp.引物由大連寶生物公司合成.取總RNA1μL采用寶生物公司的RNALAPCRTMKit(AMV)試劑盒進行RTPCR反應.取8μL擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠跑電泳，并用BIORADFlus凝膠圖像處理系統(tǒng)進行圖像分析.

1.2.2β2AR基因反義真核表達載體的構(gòu)建PCR產(chǎn)物用10g/L瓊脂糖凝膠跑電泳除雜質(zhì)，并用柱式PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收.回收產(chǎn)物和pUC18克隆載體分別用BamHI和HindIII酶切后在T4DNA連接酶的功能下16℃過夜連接.取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109，涂布含有氨芐青霉素、IPIG和Xgal的平板，37℃過夜培養(yǎng)，挑取白色菌落并作標記，通過菌落PCR鑒定陽性重組克隆.將含有陽性重組質(zhì)粒的菌落挑入適量LB培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)過夜，采用Gibco公司的質(zhì)粒提取試劑盒制備質(zhì)粒，一部分作BamHI+HindIII雙酶切鑒定正確后將其命名為pUCβ3AR；一部分用ClaI+HindIII雙酶切后，10g/L瓊脂糖凝膠回收1.2kb目的基因；隨后用ClaI+HindIII雙酶切逆轉(zhuǎn)錄病毒載體plncx，并用Qiagen公司的QiAquickGelExtractionKit后回收plncx經(jīng)酶切后所產(chǎn)生的載體片段，經(jīng)T4DNA連接酶連接目的基因及載體片段（16℃水浴過夜連接），搖菌擴增，提取質(zhì)粒后，用ClaI+HindIII雙酶切進行電泳鑒定.插入片段的堿基序列及其插入方向采用DNA測序方法進行鑒定（由大連寶生物公司鑒定）.鑒定正確后將β3AR反義真核表達載體命名為pLNCXβ3AR（圖1）.

2結(jié)果

2.1目的基因克隆反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)PCR擴增，10g/L瓊脂糖凝膠電泳顯示RTPCR結(jié)果和預期長度一致（1.2kb，圖1）.

2.2pLNCXβ3AR反義表達載體的酶切鑒定其結(jié)果和理論設計完全相符（圖2）.

1摘要:dl2000marker;2摘要：β3AR;3摘要:陰性對照.

圖1β3AR目的基因產(chǎn)物的RTPCR檢測（略）

1摘要:dl2000marker;2摘要:pLNCXβ3AR;3摘要:空白對照;4摘要:λHindIIImarker.

圖2pLNCXβ3AR反義表達載體的酶切鑒定（略）

2.3pLNCXβ3AR載體中目的基因的堿基序列及其插入方向測序結(jié)果顯示我們所克隆進入plncx的目的片段其堿基序列和Genebank所提供的β3AR的堿基序列完全一致，且插入方向完全正確，表明我們已經(jīng)成功構(gòu)建了人膀胱逼尿肌腎上腺素能β3受體基因的反義真核表達載體摘要：

TGGGAAATCACCATAAACGTGAAATGTCTTTGGATTTGGGAATCTTATAAG

TTCTGTATGAGACCACTCGGATCCCGCAACAACTCT

GTTGATCATTCAAGAGATGATCAACAGAGTTGTTGCT（測序）.

3討論

反義技術(shù)是目前許多領域應用得比較多的一種基因治療技術(shù)，其概念就是應用反義核酸在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平阻斷某些基因的表達［4］.反義技術(shù)一般分三種方法摘要：第一種是應用陽離子脂質(zhì)體將反義的寡鏈核苷酸帶入細胞內(nèi)部，和mRNA結(jié)合，將其屏蔽掉.第二種是將反義基因（cDNA）連接到所需的表達載體（質(zhì)粒，病毒）上，轉(zhuǎn)染細胞后轉(zhuǎn)錄出反義RNA，并和靶mRNA互補結(jié)合，阻斷轉(zhuǎn)錄過程，從而最終阻止蛋白的表達.第三種是核酶，它是一種具有酶切割活性的反義核酸，和相應的mRNA結(jié)合后能發(fā)揮酶活性將其降解.我們的實驗中應用了第二種方法，即應用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體重組β3AR反義RNA，成功地構(gòu)建了β3AR反義RNA的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體，以期在基因水平上封閉β3AR的表達，來探索β3AR亞型在膀胱逼尿肌松弛過程中的可能價值.在我們的實驗中，因為根據(jù)相關(guān)文獻［5］，β3AR無內(nèi)含子成分，無法針對其中的外顯子來構(gòu)建載體，故此我們選擇了以全長的β3ARcDNA序列為模板構(gòu)建載體，來完成封閉功能.

目的基因的獲得我們是通過RTPCR的方法.在實驗的最初我們只是基于β3AR的蛋白質(zhì)編碼區(qū)（CDS）設計了一對引物，并根據(jù)plncx和pUC19的多克隆位點在上下游設計了三個酶切位點，使其能通過克隆擴增后反向連接到真核表達載體中，應用此對引物進行擴增時，電泳結(jié)果在1.4kb處有微弱亮帶(目的基因為1.2kb)，且四周有很多雜帶存在，將1.4kb泳帶切膠回收后，經(jīng)測序證實不是我們想要的目的基因，分析可能是引物的特異性不高，在β3ARmRNA的其他的位置亦有此引物的結(jié)合位點所造成的，故此又以5′上游及3′下游非翻譯區(qū)為模板設計了一對外引物，先用外引物擴增后，再用帶有內(nèi)切酶的內(nèi)引物進行擴增，結(jié)果得到了1.2kb的單一片段，保證了反應的特異性.

腎上腺素能β受體分為三種亞型，β1，β2和β3.目前對于腎上腺素能β受體的探究，大多是應用βAR亞型選擇性的受體激動劑來探究其在膀胱松弛過程中的功能［6-8］，但其選擇性依靠于受體激動劑的特異性，而我們構(gòu)建βAR亞型的反義真核表達載體，轉(zhuǎn)錄出反義的βAR，從基因水平封閉其亞型的表達，然后用非選擇性βAR激動劑處理細胞以消除激動劑親和性和效能差異造成的影響，則更加確切.我們選用的真核表達載體pLNCX是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體，相對于脂質(zhì)體而言，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體所介導的基因轉(zhuǎn)移效率極高，最高時可達100%，并且可以將目的基因整合到宿主細胞的染色體中長期表達，可以使我們能有足夠的時間來觀察在β3AR其他兩種亞型被抑制之后的膀胱平滑肌的各種生物學特性的改變.而后者往往由于細胞攝入率較低或進入細胞后即被降解而影響其反義抑制效果［9］.經(jīng)酶切鑒定和序列分析，本實驗所克隆的βAR全長cDNA序列和Genbank上報道的完全一致且插入載體的方向也完全正確，重組病毒載體plncxβAR經(jīng)雙酶切鑒定，釋放出1.2kb的片段，說明βAR逆轉(zhuǎn)錄病毒反義真核表達載體已構(gòu)建成功，這就為下一步βAR亞型功能的探究奠定了基礎.

【參考文獻

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