導語：透視肌源神經(jīng)營養(yǎng)因子修復論文一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

【摘要目的摘要：觀察肌源神經(jīng)營養(yǎng)因子（MDNF）對大鼠四周神經(jīng)損傷修復的影響.方法摘要：從成鼠骨骼肌中提取出MDNF，取10μLMDNF（0.1mg/L）注射到大鼠坐骨神經(jīng)損傷段為實驗組，同時設實驗對照組（注射生理鹽水）和正常對照組.術后20d用辣根過氧化物酶示蹤法（HRP）、尼氏染色法、非凡三色染色法對再生神經(jīng)進行形態(tài)學觀察和計量學統(tǒng)計.結(jié)果摘要：注射MDNF的四周神經(jīng)損傷部有再生的神經(jīng)纖維通過；MDNF組的再生神經(jīng)在形態(tài)學及計量學上均優(yōu)于生理鹽水組.結(jié)論摘要:肌源神經(jīng)營養(yǎng)因子對四周神經(jīng)損傷后的修復有較好的促進功能.

【神經(jīng)生物學；肌源神經(jīng)營養(yǎng)因子；四周神經(jīng)損傷；四周神經(jīng)再生；辣根過氧化物酶；大鼠

0引言

四周神經(jīng)系統(tǒng)具有一定的再生能力.但是，無論怎樣精確的神經(jīng)修復，其功能都很難再恢復到損傷前的水平［1］.通過提高外科手術技術、電或磁的刺激［2］、組織的摘除以及雪旺氏細胞的巧妙處理等方法來促進四周神經(jīng)損傷后的修復工作已做了很多.最近，對神經(jīng)營養(yǎng)因子的分子通路以及生理功能的理解有了重大的進展.這些因子包括神經(jīng)生長因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子3，4，5，6以及膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子等等，它們影響著不同的神經(jīng)細胞亞群，在中樞和四周神經(jīng)系統(tǒng)中均有著復雜的營養(yǎng)功能.許多探究表明，骨骼肌組織中也存在著對神經(jīng)元有營養(yǎng)功能的物質(zhì).Oppenheim等將從大鼠的這種物質(zhì)中分離出的Mr為10000~30000組份蛋白命名為“肌源神經(jīng)營養(yǎng)因子”（musclederivedneurotrophicfactor，MDNF），它能促進胚胎脊髓運動神經(jīng)元生長，并對其損傷具有保護功能［3］.我們通過辣根過氧化物酶示蹤法、尼氏染色法、非凡三色染色法觀察MDNF對坐骨神經(jīng)損傷后修復的影響.

1材料和方法

1.1材料

Wistar大鼠（軍事醫(yī)學科學院動物中心提供）;Tyrode溶液，低溫高速離心機（上海華亭TGL16G）;中空纖維超濾器（UltrafiltrationwiththePorousFibertubers，北京宣武超濾設備廠）;電腦自動記錄儀記錄（上海滬西儀器廠）;電泳儀（北京六一電泳儀器廠）;HRP（中山公司）.

1.2方法

1.2.1成鼠MDNF的制備用80只成年Wistar大鼠，切取四肢，在手術顯微鏡下剝離骨骼肌組織塊.骨骼肌組織用Tyrode溶液浸泡（1∶5）后，再經(jīng)超聲粉碎、低溫高速離心30min得上清液.經(jīng)中空纖維超濾器截取Mr為10000~50000的蛋白液，然后在層析柜內(nèi)過交聯(lián)葡聚糖（Sephadex）G75（Pharmacia產(chǎn)品）層析柱，柱長1m，用PBS平衡液洗脫，流速為0.3mL/min，自動收集器收集，紫外檢測，波長280nm，電腦自動記錄儀記錄.層析預截取的Mr10000~30000洗脫液經(jīng)冷凍干燥后，進行十二烷基硫酸鈉（SDS）聚丙烯酰胺梯度凝膠，中范圍分子質(zhì)量標準蛋白做對照（Pharmacia）.電壓150V，0.5~1h，硝酸銀染色.

1.2.2動物分組及手術方法雄性健康Wister大鼠18只，體質(zhì)量250g左右，隨機分成實驗組、實驗對照組和正常對照組,每組6只.用異戊巴比妥鈉麻醉劑腹腔注射麻醉（2.5mL/kg），于大鼠右側(cè)股后部正中切口，在手術顯微鏡下解剖坐骨神經(jīng)，自梨狀肌下緣夾傷坐骨神經(jīng)30s，直至夾傷段僅有透明的神經(jīng)外膜.實驗組用100mg/L的MDNF10μL注入夾傷處，實驗對照組注射生理鹽水10μL.正常對照組未經(jīng)任何注射，術后各組大鼠按常規(guī)飼養(yǎng)20d.

1.2.3檢測方法①HRP示蹤試驗摘要：各組隨機抽取大鼠2只，于夾傷處遠端4mm處的坐骨神經(jīng)干注入150g/L的HRP溶液10μL，縫合好傷口，繼續(xù)飼養(yǎng)72h，多聚甲醛灌注后取腰段脊髓固定，振動切片，進行四甲基聯(lián)苯胺法染色，觀察各組HRP標記的情況.②Nissl染色摘要：各組大鼠剩余的4只用多聚甲醛灌注，取脊髓腰段，石蠟包埋，切片，展片后進行尼氏染色，觀察神經(jīng)元胞體數(shù).③非凡三色染色摘要：各組大鼠剩余的4只用多聚甲醛灌注后，取坐骨神經(jīng)夾傷段、坐骨神經(jīng)夾傷遠端、近端，石蠟包埋連續(xù)切片，夾傷段縱切，遠、近端既縱切，又橫切，觀察神經(jīng)再生、髓鞘形成情況，計量學分析遠、近端的軸索數(shù)，遠端的軸索直徑和髓鞘厚度.

2結(jié)果

2.1HRP示蹤試驗MDNF組HRP標記神經(jīng)元數(shù)和其余二組均有顯著性差異（P%26lt;0.01，表1）.

2.2Nissl染色Nissl染色后，實驗組脊髓前角運動神經(jīng)元數(shù)和實驗對照組有差異（P%26lt;0.05），兩組和正常對照組均有顯著性差異（P%26lt;0.01，表1）.表1HRP標記和Nissl染色脊髓運動神經(jīng)元數(shù)據(jù)(略)

2.3非凡三色染色實驗組和實驗對照組坐骨神經(jīng)夾傷20d時，兩組坐骨神經(jīng)夾傷段的遠端、近端都不同程度地發(fā)生了Waller變性.實驗組（圖1，2）和實驗對照組（圖3）近端的神經(jīng)纖維損傷分別比遠端輕.在近端橫切面中還能看到大量的正常的有髓神經(jīng)纖維，軸索被染為綠色點狀，軸索四面的髓鞘被染成紅色（圖1）；縱切面中能見到大量的正常有髓神經(jīng)纖維，染成紅色的為髓鞘，在紅色髓鞘的中間有一條綠色的細線為軸索，縱切面中也能見到正在變性和已變性的沒被染成紅色的神經(jīng)纖維（圖2，3）.在變性的神經(jīng)纖維神經(jīng)膜管的內(nèi)面還能見到少量的Schwann細胞（圖2）.實驗組（圖1）、正常對照組（圖4）、實驗對照組近端軸索數(shù)沒有差異（表2）.表2有髓神經(jīng)纖維組織形態(tài)學分析結(jié)果（略）

實驗組（圖5，6）和實驗對照組（圖7，8）遠端的神經(jīng)纖維損傷很重.在實驗對照組橫切面上（圖7）能見到大量的變性神經(jīng)纖維，綠色點狀軸索和紅色髓鞘少見；在實驗組（圖5）也能見到變性神經(jīng)纖維，但綠色軸索和紅色髓鞘較多.在縱切面上，實驗組（圖6）神經(jīng)纖維因損傷髓鞘腔崩解，髓鞘斷裂成為分節(jié)狀結(jié)構(gòu)，在神經(jīng)膜區(qū)域內(nèi)仍可見大量塊狀髓鞘碎片，神經(jīng)膜管有的萎縮、變窄，大量的Schwann細胞在神經(jīng)膜管的內(nèi)面形成Büngner帶；實驗對照組（圖8）神經(jīng)纖維髓鞘碎片已不成塊狀，呈松馳狀，大部分都已消失，神經(jīng)膜管都已萎縮、變窄，大量的Schwann細胞在神經(jīng)膜管的內(nèi)面形成Büngner帶.實驗組和實驗對照組遠端軸索數(shù)、軸索直徑和髓鞘厚度有差異（P%26lt;0.05），兩組均和正常對照組有顯著性差異（P%26lt;0.01）.實驗組損傷段（圖9，10）縱切面上能見到許多髓鞘腔和Schwann細胞，一些髓鞘腔內(nèi)有少量的紅色的髓鞘（圖10）；對照實驗組損傷段（圖11，12）縱切面上幾乎見不到髓鞘腔和髓鞘，大多是疤痕、結(jié)締組織和變性的神經(jīng)纖維.

3討論

神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)展和維持依靠著神經(jīng)營養(yǎng)因子.最初，人們只注重神經(jīng)營養(yǎng)因子對神經(jīng)細胞損傷后的修復功能，而很少留意它們對四周神經(jīng)再生的影響.圖1實驗組近端坐骨神經(jīng)(綠色點狀為軸索

近10余年來，出現(xiàn)了一大批有關MDNF的探究證實MDNF對神經(jīng)元具有促進生長、減少死亡等功能.現(xiàn)已證實，大鼠MDNF對神經(jīng)細胞凋亡有很好的抑制功能，它不但能夠拯救胎齡6~9d凋亡期的1/4運動神經(jīng)元不死亡，而且?guī)缀蹩墒剐律笄袛嗪蟮倪\動神經(jīng)元全部存活.大鼠MDNF是否也象其他神經(jīng)營養(yǎng)因子一樣對四周神經(jīng)損傷后的修復有促進功能呢？本實驗探究發(fā)現(xiàn)，坐骨神經(jīng)損傷后，經(jīng)MDNF孵育的實驗組遠端在軸索數(shù)、軸索直徑和髓鞘厚度均高于實驗對照組.在四周神經(jīng)中，髓鞘厚度、軸索直徑、軸索數(shù)被用來評價神經(jīng)再生［4］.結(jié)果說明，MDNF對四周神經(jīng)損傷后的再生有促進功能.探究還發(fā)現(xiàn)，實驗組HRP標記的神經(jīng)元數(shù)以及Nissl染色的神經(jīng)元數(shù)均比實驗對照組高；非凡三色染色中，實驗組坐骨神經(jīng)損傷段遠端縱切面上仍有大量的塊狀髓鞘碎片，而實驗對照組中髓鞘碎片大部分消失，且實驗組坐骨神經(jīng)損傷段有新生的髓鞘生成.結(jié)果說明，MDNF對四周神經(jīng)損傷的修復有促進功能.但另一方面，實驗組的髓鞘厚度、軸索直徑、軸索數(shù)、HRP標記的神經(jīng)元數(shù)、Nissl染色的神經(jīng)元數(shù)均低于正常對照組，MDNF對四周神經(jīng)損傷的修復也是不完全的.肌源神經(jīng)營養(yǎng)因子對四周神經(jīng)再生有促進功能，至于MDNF是如何促進四周神經(jīng)再生以及其促進再生的發(fā)生率均有待于進一步探究.

【參考文獻

［1］YinQ,KempGJ,YuLG,etal.Neurotrophin4deliveredbyfibringluepromotesperipheralnerveregeneration［J］.MuscleNerve,2001，24(3)摘要:345-351.

［2］ShenN,ZhuJ.Experimentalstudyusingadirectcurrentelectricalfieldtopromoteperipheralnerveregeneration［J］.JReconstrMicrosurg,1995，11摘要:189-193.

［3］周長滿,陳彪,王雪岷,等.骨骼肌組織對雞胚背根節(jié)細胞GABA表達的影響［J］.解剖學報,1997，28(1)摘要:373-378.

［4］LlewinSL,UtleyDS,ChengET,etal.SimultaneoustreatmentwithBDNFandCNTFafterperipheralnervetransectionandrepairenhancesrateoffunctionalrecoverycomparedwithBDNFtreatmentalone［J］.Laryngoscope,1997，107摘要:992-999.