導(dǎo)語(yǔ)：中藥復(fù)方腦藥動(dòng)學(xué)研討方式一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

中藥復(fù)方是中醫(yī)臨床用藥的基本形式，研究中藥復(fù)方的藥代動(dòng)力學(xué)規(guī)律可以闡明中藥復(fù)方的組方原理與配伍規(guī)律，同時(shí)也為中藥新藥研究奠定基礎(chǔ)。關(guān)于中藥復(fù)方藥代動(dòng)力學(xué)研究，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)提出了一些新方法和新思路，如“復(fù)方效應(yīng)成分動(dòng)力學(xué)”假說和“血清藥理學(xué)”方法［1］。

中藥復(fù)方藥代動(dòng)力學(xué)研究的關(guān)鍵問題是根據(jù)其指標(biāo)成分(Markers)的體內(nèi)動(dòng)力學(xué)過程來反映整體的動(dòng)力學(xué)規(guī)律，在選擇Markers的同時(shí)，對(duì)其藥效作用規(guī)律探討也是工作的重點(diǎn)所在。杜力軍等［2］利用PK-PD線性模型對(duì)清熱復(fù)方中3種Markers與發(fā)熱大鼠體溫變化進(jìn)行相關(guān)分析，確定了其中黃芩苷有較高的相關(guān)性，由此以黃芩苷體內(nèi)動(dòng)力學(xué)變化表征該清熱復(fù)方的體內(nèi)動(dòng)力學(xué)過程;同時(shí)對(duì)活血化瘀復(fù)方中葛根素和人參皂苷Rg1與所測(cè)的藥效指標(biāo)間進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)葛根素和人參皂苷Rg1僅在給藥后5～10min體內(nèi)濃度與血小板抑制率呈正相關(guān)(r=0.999和0.996)，且符合線性效應(yīng)模型(對(duì)數(shù)濃度-效應(yīng))。但葛根素和人參皂苷Rg1在體內(nèi)的整個(gè)濃度變化區(qū)間與所測(cè)的藥效指標(biāo)之間無(wú)明顯的全程相關(guān)性。分析原因，本文作者認(rèn)為:一方面可能與所選的藥效指標(biāo)的非即時(shí)性(存在作用時(shí)間的延遲效應(yīng))有關(guān);另一方面，也可能由于中藥復(fù)方中藥效物質(zhì)在體內(nèi)存在多途徑和多靶點(diǎn)的協(xié)同或拮抗作用，以單一的Marker(即使是有效成分)與整體藥效學(xué)指標(biāo)的變化難以直接相關(guān)。為此，本文作者提出“組合血藥濃度”的概念，即將Markers的血藥濃度，以對(duì)藥效學(xué)指標(biāo)的貢獻(xiàn)大小作為權(quán)重，進(jìn)行加權(quán)組合，以“組合血藥濃度”(或稱“表觀藥效濃度”)替代單一Marker的血藥濃度，進(jìn)行“組合藥代動(dòng)力學(xué)”(combinatorialpharmacokinetics，CPK)研究，并進(jìn)行CPK-PD線性模型擬合。以活血化瘀中藥復(fù)方腦得生為例，以腦得生中的Markers與大鼠全血黏度(bloodviscosity，BV)、紅細(xì)胞聚集指數(shù)(erythrocyteaggregationindex，EAI)和紅細(xì)胞壓積(hematocrit，HCT)等血液流變學(xué)特性的改變進(jìn)行相關(guān)分析，探索中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其藥代動(dòng)力學(xué)研究的新方法。

1儀器與材料

LCMS2010EV高效液相色譜質(zhì)譜儀(日本Shimadzu公司)，LCMSsolution3.0色譜工作站(日本Shimadzu公司)，LC-10ATvp高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司)，ANASTAR色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國(guó)SuntekScience公司)，微量取樣器(上海求精生化試劑儀器有限公司)，XW-80A型旋渦混合器(江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠)，TGL-16C臺(tái)式離機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，LG-R-80F血液流變儀(北京世帝公司)，TDZ4-WS低速自動(dòng)平衡離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。甲醇(色譜純，天津康科德科技有限公司)，磷酸(分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠)，丙酮(分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠)，肝素鈉注射液(上海生物化學(xué)制藥廠)。人參皂苷Rg1對(duì)照品(0703-200221)、人參皂苷Rb1對(duì)照品(110704-200216)、葛根素對(duì)照品(752-200108)、黃芩苷對(duì)照品(0715-9708，LC/MS內(nèi)標(biāo)物)(中國(guó)藥品生物制品檢定所)，大豆苷元對(duì)照品(美國(guó)Sigema公司)，人參皂苷Rd、三七皂苷R1(HPLC法檢測(cè)純度質(zhì)量分?jǐn)?shù)均＞96%)、葛根異黃酮(總黃酮含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%)(沈陽(yáng)藥科大學(xué)天然藥物化學(xué)教研室)，紅花黃色素A(紅花黃色素含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90%)、腦得生注射液(含紅花黃色素A0.10μg•L－1、葛根素0.76μg•L－1、人參皂苷Rg10.42μg•L－1)(本實(shí)驗(yàn)室自制)，香蘭素(HPLC-UV內(nèi)標(biāo)物，分析純，沈陽(yáng)市試劑廠)。健康Wistar大鼠，體質(zhì)量200～220g〔沈陽(yáng)藥科大學(xué)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(遼)2003-008;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(遼)2003-0012〕;體質(zhì)量180～220g(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室提供)。實(shí)驗(yàn)期間自由飲水，大鼠靜脈給藥試驗(yàn)前禁食12h。

2方法與結(jié)果

2.1指標(biāo)成分藥代動(dòng)力學(xué)

2.1.1色譜條件血漿中紅花黃色素A與葛根素及其相關(guān)異黃酮的HPLC測(cè)定［3］.色譜柱:KromasilC18柱(250mm×4.6mm，5μm，Scienhome公司)，流動(dòng)相:乙腈-體積分?jǐn)?shù)為0.1%的磷酸溶液-四氫呋喃(體積比為8∶92∶2)，流速:1.0mL•min－1，檢測(cè)波長(zhǎng):250nm。血漿中大豆苷元、人參皂苷Rg1、Rb1、Rd與三七皂苷R1的LC-MS測(cè)定［4］.色譜柱:LunalC18柱(150mm×4.6mm，5μm，Phenomenex公司)，流動(dòng)相A:體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸溶液，流動(dòng)相B:甲醇，梯度洗脫程序:0～5min［30%(φB)～40%(φB)］、5～20min［40%(φB)～80%(φB)］，流速:0.8mL•min－1，大氣壓化學(xué)電離，負(fù)離子方式，選擇離子監(jiān)測(cè)。

2.1.2血漿樣品處理方法取肝素抗凝血漿100μL，置2.0mL具塞離心試管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液50μL、甲醇50μL和丙酮400μL，渦旋混合2min，離心(4000r•min－1)15min。分取上清液，于40℃氮?dú)饬飨麓蹈?。殘?jiān)尤爰状?水(體積比為1∶1)溶液100μL，超聲溶解1min，渦旋混合1min，離心(12000r•min－1)3min，取上清液10μL進(jìn)樣，記錄色譜圖，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血漿藥物濃度。

2.1.3給藥方案與血漿樣品采集Wistar大鼠6只，以10mL•kg－1劑量尾靜脈注射給予腦得生注射液，于給藥前(0h)和給藥后0.033、0.170、0.330、0.670、1.000、2.000、(3.000)、4.000、8.000h由眼眶后靜脈叢取血約0.3mL，置于肝素化試管中，混勻，離心(10000r•min－1)5min，分離血漿，于－20℃冰箱中保存，直至分析測(cè)定。

2.1.4數(shù)據(jù)處理以待測(cè)物峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各指標(biāo)成分的血藥濃度，并將各血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)用3p87藥動(dòng)學(xué)程序進(jìn)行曲線擬合。

2.1.5藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果經(jīng)測(cè)定，除3''''-羥基葛根素(3''''-hydroxypuerar-in，P3)表現(xiàn)為類似口服給藥的一級(jí)吸收過程，紅花黃色素A(saffloryellowA，SyA)和葛根素(puer-arin，Pu)及其相關(guān)異黃酮大豆苷元(daidzein，Da)、大豆苷元-7，4''''-二葡萄糖苷(daidzein-7，4''''-O-glucoside，P2)、3''''-甲氧基葛根素(3''''-methoxypu-erarin，P4)、葛根素芹菜糖苷(puerarinapioside，P5)、未知物I(unknown1，U1)及代謝物I(metab-olite1，M1)在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)過程均符合二室模型;三七皂苷中，人參皂苷RbRb1，GRb1)、人參皂苷Rd(ginsenosidesRd，GRd)、人參皂苷Rg1(ginsenosidesRg1，GRg1)、三七皂苷R1(notoginsenosideR1，NGR1)等動(dòng)力學(xué)過程亦符合二室模型。其中，與藥效動(dòng)力學(xué)過程呈正相關(guān)的大豆苷元以及葛根異黃酮代謝物M1的藥-時(shí)曲線(根據(jù)文獻(xiàn)［3－4］擬合)如圖1、2所示。

2.2藥效動(dòng)力學(xué)文

2.2.1給藥方案與血漿樣品采集Wister大鼠，隨機(jī)分為給藥前(對(duì)照)、給藥后0.5、1.0、1.5、2.5、4.0h6組，每組5只。對(duì)照組不經(jīng)處置，其他各組大鼠以10mL•kg－1劑量尾靜脈注射給藥后，分別于不同時(shí)間心臟穿刺取血4mL，進(jìn)行血液流變學(xué)測(cè)定［5］。

2.2.2血液流變學(xué)與凝血因子活力測(cè)定血液流變學(xué)的測(cè)定.取肝素抗凝血樣，置血液流變儀中測(cè)定BV、HCT和EAI。

2.2.3藥效學(xué)結(jié)果Markers對(duì)BV的影響.對(duì)4個(gè)切變率(200/s、30/s、5/s、1/s)下的大鼠BV均具有隨時(shí)間變化的趨勢(shì)，在低切變率下的BV下降幅度大于高切變率。1.0h時(shí)BV開始下降，1.5h時(shí)下降非常顯著，4.0h時(shí)BV同步恢復(fù)。時(shí)-效曲線見圖3。Markers對(duì)HCT的影響在0.5h時(shí)HCT開始出現(xiàn)下降趨勢(shì);1.5h時(shí)下降顯著，作用持續(xù)至4.0h以上。時(shí)-效曲線見圖4。Markers對(duì)EAI的影響對(duì)EAI的影響具有時(shí)間依賴性，其變化規(guī)律與對(duì)BV的影響基本一致。在1.0h以前呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，1.5h時(shí)EAI時(shí)顯著下降，作用持續(xù)至2.5h，在4.0h時(shí)開始恢復(fù)。時(shí)-效曲線見圖4。

2.3藥代動(dòng)力學(xué)與藥效動(dòng)力學(xué)擬合

2.3.1PK-PD擬合在藥效學(xué)檢測(cè)指標(biāo)發(fā)生改變的時(shí)間區(qū)間內(nèi)(各時(shí)間點(diǎn))，將腦得生中各指標(biāo)成分的血漿濃度數(shù)據(jù)(取自然對(duì)數(shù)值)與藥效學(xué)指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性擬合，相關(guān)系數(shù)(R2)和曲線斜率(k)見表1。以R2=的大小作為其相關(guān)性評(píng)價(jià)指標(biāo);k作為其貢獻(xiàn)評(píng)價(jià)指標(biāo)。Markers與BV的相關(guān)性由表1數(shù)據(jù)可見，Da對(duì)BV的下降呈正相關(guān)(R2=0.7801～0.9429);GRg1(R2=0.5941～0.8146)和NGR1(R2=0.5594～0.7390)呈負(fù)相關(guān);其他各成分無(wú)顯著相關(guān)性。Markers與EAI的相關(guān)性各指標(biāo)成分與EAI的相關(guān)性和與BV的相關(guān)性一致。Da對(duì)EAI的下降呈顯著正相關(guān)(R2=0.9939，r23，0.05=0.994);GRg1(R2=0.9430)和NGR1(R2=0.7305)呈負(fù)相關(guān)。Markers與HCT的相關(guān)性M1對(duì)HCT的下降呈一定的正相關(guān)(R2=0.6435);P2(R2=0.8245)、SyA(R2=0.7091)、Pu(R2=0.6957)、P5(R2=0.6781)、U1(R2=0.6780)和P4(R2=0.6547)呈負(fù)相關(guān);P3(R2=0.5496)、GRb1(R2=0.5168)和GRd(R2=0.4899)呈一定的負(fù)相關(guān)。經(jīng)PK-PD線性模型擬合，Da是大鼠BV下降(特別是BV1的下降，EAI=BV1/BV200)的主要藥效物質(zhì)，M1是HCT下降的主要藥效物質(zhì);GRg1和NGR1對(duì)BV的下降存在拮抗作用，對(duì)HCT下降表現(xiàn)拮抗作用的Markers主要是SyA和葛根黃酮。

2.3.2CPK-PD擬合以藥效學(xué)指標(biāo)發(fā)生改變的時(shí)間區(qū)間內(nèi)的PK-PD相關(guān)曲線的斜率(k)為權(quán)重，用公式(1)將不同時(shí)間點(diǎn)的大鼠血漿中Markers的濃度(取自然對(duì)數(shù))進(jìn)行加權(quán)組合，繪制“組合血藥濃度”-時(shí)間曲線、計(jì)算“組合藥代動(dòng)力學(xué)”參數(shù)，并以“組合血藥濃度”(ρcombinatory)與相同時(shí)間點(diǎn)的藥效學(xué)指標(biāo)的相對(duì)值(以給藥前指標(biāo)值為基數(shù)的比值)進(jìn)行CPK-PD線性模型相關(guān)分析。lnρi=∑nj=1［kjlnρij］(1)式中，ρi為第i時(shí)間點(diǎn)血漿中相關(guān)Markers(包括正相關(guān)和負(fù)相關(guān)成分)的“組合血藥濃度”;ρij為第i時(shí)間點(diǎn)血漿中第j相關(guān)Markers的濃度;kj為第j相關(guān)Markers的PK-PD相關(guān)曲線的斜率，當(dāng)正相關(guān)(藥理指標(biāo)的變化趨勢(shì)與效應(yīng)一致)時(shí)，其符號(hào)不變;當(dāng)負(fù)相關(guān)(藥理指標(biāo)的變化趨勢(shì)與效應(yīng)相反，如本研究中的全血黏度下降表示藥理效應(yīng)增強(qiáng))時(shí)，其符號(hào)相反。經(jīng)“組合血藥濃度”計(jì)算和CPK-PD擬合，上述各項(xiàng)“組合血藥濃度”-時(shí)間曲線與藥理效應(yīng)-時(shí)間曲線存在全程相關(guān)性。

3討論

a.以其相關(guān)系數(shù)(R2)作為藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的評(píng)價(jià)指標(biāo)、曲線斜率(k)作為其對(duì)藥效貢獻(xiàn)大小(包括協(xié)同與拮抗作用)的評(píng)價(jià)指標(biāo)是可行的。與BV和EAI相關(guān)的“組合血藥濃度”-時(shí)間曲線見圖5-7;與HCT相關(guān)的“組合血藥濃度”-時(shí)間曲線見圖8;Da血漿濃度與BV的全程PK-PD相關(guān)曲線見圖9(n=5，R2=0.0013～0.0365)，“組合血藥濃度”與BV的全程CPK-PD相關(guān)曲線見圖10(n=5，R2=0.7969～0.9085);Da、M1血漿濃度與EAI、HCT的全程PK-PD相關(guān)曲線見圖11(n=5，R2=0.1380和0.1165)，“組合血藥濃度”的CPK-PD相關(guān)曲線見圖12(n=5，R2=0.8170和0.7948)。3討論a.中藥復(fù)方“腦得生”中的指標(biāo)成分Da是引起大鼠BV和EAI下降的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，而GRg1和NGR1對(duì)該藥理指標(biāo)具有拮抗作用。由表1可見，在大鼠BV發(fā)生改變的時(shí)間段(1.5～4.0h)內(nèi)，Da與BV下降存在相關(guān)性(R2=0.7801～0.9429，r23，0.05=0.993)，但無(wú)全程(0.5～4.0h)相關(guān)性(見圖9，R2=0.0013～0.0365，r25，0.05=0.771)。說明:在0.5～1.5h區(qū)間，雖然Da血漿濃度較高，但由于GRg1和NGR1的抑制作用，使“組合血藥濃度”處于低水平狀態(tài)(圖5-7)，因而不能產(chǎn)生應(yīng)有的藥理作用。同理，M1是大鼠HCT下降的主要藥效物質(zhì)，但進(jìn)行全程PK-PD相關(guān)分析時(shí)，卻表現(xiàn)出負(fù)相關(guān)(對(duì)HCT下降有抑制作用)。在0.5～1.5h時(shí)段內(nèi)M1濃度雖然處于高水平下降階段，但因受到葛根黃酮的強(qiáng)烈抑制作用(且該抑制作用隨其濃度的下降而逐漸減弱)，表現(xiàn)為“組合血藥濃度”處于低水平、并逐漸升高的變化趨勢(shì)(圖8)，該變化趨勢(shì)與HCT的變化趨勢(shì)一致，故而在CPK-PD擬合中表現(xiàn)出顯著的全程相關(guān)性(見圖12，R2=0.7948，r25，0.05=0.771)。b.CPK-PD相關(guān)分析中，以PK-PD相關(guān)曲線的相關(guān)系數(shù)(R2PK-PD)的大小為秩序，以CPK-PD相關(guān)曲線的相關(guān)系數(shù)(R2CPK-PD)為指標(biāo)，可確定中藥復(fù)方中對(duì)該藥理指標(biāo)具有協(xié)同或拮抗作用的藥效成分，或無(wú)該藥理作用的無(wú)關(guān)成分。通過對(duì)多個(gè)不同的藥理指標(biāo)的相關(guān)分析，可闡明中藥復(fù)方多途徑、多靶點(diǎn)作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其配伍規(guī)律。c.進(jìn)行CPK-PD相關(guān)分析與PK-PD相關(guān)分析時(shí)，均應(yīng)首先確定該藥理指標(biāo)的藥效響應(yīng)是否存在作用時(shí)間的延遲效應(yīng)。若存在時(shí)間滯后，在進(jìn)行相關(guān)分析時(shí)，應(yīng)引入時(shí)間差，即將“組合血藥濃度”與藥理指標(biāo)變化進(jìn)行時(shí)間錯(cuò)位匹配。d.若對(duì)所監(jiān)測(cè)的指標(biāo)成分(Markers)經(jīng)CPK-PD相關(guān)分析，不能獲得較高的相關(guān)系數(shù)。說明，所選擇的Markers可能并非該復(fù)方中對(duì)該藥理指標(biāo)的藥效物質(zhì)(群)。其原因可能是藥理指標(biāo)選擇不恰當(dāng)，或起藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)并非復(fù)方中Markers的原形結(jié)構(gòu)。正如本文中，大鼠HCT下降的主要藥效物質(zhì)并非腦得生中的原形物質(zhì)，而是葛根黃酮的活性代謝物M1，其結(jié)構(gòu)有待進(jìn)一步確證。