導語：胃痞消萎縮性胃炎癌病變改變研究論文一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

【摘要】觀察健脾化瘀解毒中藥胃痞消(由黃芪、太子參、白術(shù)、丹參、白花蛇舌草等組成)對脾虛型慢性萎縮性胃炎(CAG)癌前病變大鼠胃黏膜上皮細胞的增殖周期分布及凋亡基因表達的影響?！痉椒ā窟x用SD大鼠，隨機分為6組，即正常對照組，模型組，胃痞消高、中、低劑量組(劑量分別為15、75、375g·kg-1·d-1)，維酶素組(劑量為027g·kg-1·d-1)。除正常對照組外，其他組均采用N甲基N′硝基N亞硝基胍(MNNG)液自由飲用結(jié)合饑飽失常加耗氣瀉下法復制脾虛型CAG胃癌前病變模型,觀察胃痞消各劑量組連續(xù)治療4周后對大鼠胃黏膜上皮細胞增殖周期分布、凋亡率、凋亡基因p53、Bcl2和Bax表達的影響?！窘Y(jié)果】胃痞消各劑量組可顯著增加胃黏膜上皮細胞凋亡率，增加G0/G1期、減少S期細胞分布,促進p53表達,抑制Bcl2表達(均P<001),胃痞消高劑量組可顯著促進Bax表達(P<005)?！窘Y(jié)論】胃痞消可抑制CAG癌前病變大鼠胃黏膜上皮細胞的增殖,促進細胞凋亡,其機制可能與其能促進p53和Bax表達,抑制Bcl2表達有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】：胃痞消/藥理學;癌前狀態(tài)/中藥療法;胃腫瘤;細胞周期;基因表達調(diào)控;疾病模型，動物;大鼠

胃癌同其他腫瘤一樣,很少從正常組織發(fā)生癌變,單純的慢性萎縮性胃炎(CAG)與胃癌的發(fā)生可能無直接關(guān)系,而在CAG基礎上發(fā)生的腸上皮化生及異型增生,則是胃癌發(fā)生的組織學基礎[1]。因此CAG胃癌前病變(PLGC)大鼠模型均采用長期CAG法進行復制。本文擬通過觀察健脾化瘀解毒中藥胃痞消對脾虛型CAG模型大鼠胃黏膜上皮細胞凋亡和增殖周期分布,以及凋亡基因表達的影響,探討中藥逆轉(zhuǎn)CAG并阻斷CAG癌變的分子機制,現(xiàn)報道如下。

1材料與方法

11實驗動物SPF級SD大鼠77只,體質(zhì)量60～80g,雌雄各半,由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供,合格證號：SCXK(粵)20030001;飼養(yǎng)及實驗環(huán)境：廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF實驗室,實驗環(huán)境合格證號：0008252。

12藥品、試劑及儀器N甲基N′硝基N亞硝基胍(MNNG)由日本東京株氏會社提供,藻紅蛋白(phycoerythrin,PE)標記抗大鼠p53單克隆抗體、PE標記大抗鼠Bax單克隆抗體均為美國Dako公司產(chǎn)品,PE標記抗大鼠Bcl2單克隆抗體為美國Zymed公司產(chǎn)品,PE標記的二抗羊抗鼠異硫氰酸熒光素標記IgG抗體(FITCIgG)為美國Sigma公司產(chǎn)品。胃痞消(由黃芪、太子參、白術(shù)、丹參、白花蛇舌草等組成)由廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥劑科提供并鑒定,維酶素由張家港制藥廠生產(chǎn)(批號：國藥準字H46020296)。Facstarplus型流式細胞儀為美國BectonDickinson公司產(chǎn)品。

13分組及脾虛型CAG模型復制將大鼠隨機分為正常對照組(10只)，模型組(15只)，維酶素組(13只，劑量為027g·kg-1·d-1,1倍成人臨床等效劑量[2],下同)，胃痞消高劑量組(13只,劑量為15g·kg-1·d-1,2倍成人臨床等效劑量)、中劑量組(13只,劑量為75g·kg-1·d-1,1倍成人臨床等效劑量)和低劑量組(13只,劑量為375g·kg-1·d-1,05倍成人臨床等效劑量)。除正常對照組予以正常飲食外，其他組均采用MNNG液自由飲用法[3]復制CAG大鼠模型：先用滅菌自來水將MNNG配制成10g/mL濃度的儲存液,避光冷藏保存,臨用時將其配成150μg/mL的飲用液,裝入200mL的飲水瓶中,外貼黑色避光紙,整個配制過程全部避光操作。在此基礎上結(jié)合經(jīng)典的饑飽失常加耗氣瀉下法復制脾虛證[4],連續(xù)12周。

14給藥方法于實驗第8周末,從模型組中隨機取2只大鼠,取胃組織,常規(guī)蘇木素—伊紅(HE)染色,光鏡下觀察到2只大鼠均有胃黏膜萎縮性病變,確認模型復制成功后,所有治療組于第9周開始灌胃給藥,正常對照組和模型組均灌服等容積滅菌自來水,1次/d,連續(xù)4周。于第12周末,禁食禁水12h后處死,取外周抗凝血10mL,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

15單細胞懸液的制備取新鮮胃黏膜組織約4g,除去表面黏液,用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次,盡量洗盡組織中的血液,在平面皿上剪成肉糜狀,置300目銅網(wǎng)一邊用眼科鑷手背側(cè)輕輕摩擦組織于銅網(wǎng)表面,一邊將PBS洗搓下的細胞放入試管內(nèi),在37℃、體積分數(shù)5%CO2、95%相對濕度下孵育4h。在4℃、1500r/min條件下離心7min,棄上清液,重復2次,調(diào)整細胞數(shù)為1×106/mL,制成單細胞懸液。

16誘導胃癌前病變組織細胞凋亡實驗將上述制備的單細胞懸液,用體積分數(shù)70%乙醇固定,進行流式細胞儀分析,上機前離心去除固定液,采用溴化乙啶(EthidiumBromide,EB)一步插入法,DNA定量熒光染色,染液含EB10μg/mL、核糖核酸酶(RNA酶)10μg/mL和曲里通X100(TritonX100)10mg/mL,每份樣品細胞調(diào)至1×106/mL,4℃染色30min后,用流式細胞儀進行檢測,觀察細胞周期分布。

17p53、Bcl2和Bax表達的檢測采用間接熒光流式細胞術(shù)檢測,取1mL細胞懸液,體積分數(shù)75%冷乙醇固定,過夜。PBS清洗2次,加單克隆抗體(McAb)p53(第一抗體)、McAbBcl2或McAbBax1μL,4℃反應45min。PBS清洗2次,加第二抗體羊抗小鼠FITCIgG50μL(1∶200稀釋),4℃反應45min,PBS清洗2次。每組樣品均設非特異對照,以PBS代替第一抗體,其余步驟同上。用流式細胞儀檢測和分析,記錄p53、Bcl2、Bax表達陽性細胞的百分率,減去非特異對照值,即為p53、Bcl2、Bax表達水平。

18統(tǒng)計學方法采用SPSS150統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)均以(±s)表示,組間均值的比較采用單因素方差分析,方差齊時組間均值兩兩比較采用SNK法,方差不齊時組間均值兩兩比較采用DunnettT3法，檢驗水平α=005。

2結(jié)果

21各組對脾虛型PLGC大鼠胃黏膜上皮細胞增殖周期分布的影響表1結(jié)果顯示：與正常對照組比較,模型組胃黏膜上皮細胞凋亡率顯著降低(P<001)。與模型組比較,胃痞消各劑量組和維酶素組胃黏膜上皮細胞凋亡率均顯著增加(P<001);與維酶素組比較，胃痞消各劑量組胃黏膜上皮細胞凋亡率均顯著增加(P<001)。

與正常對照組比較，模型組G0/G1、G2+M期細胞百分率均顯著降低(P<001),而S期細胞百分率則顯著升高(P<001)。與模型組比較,胃痞消高、中、低劑量組G0/G1期細胞百分率顯著增加(P<001),S期細胞百分率顯著降低(均P<001),而胃痞消高、低劑量組G2+M期細胞百分率比較差異無顯著性意義(P>005),胃痞消中劑量組則顯著增加(P<005)。與維酶素組比較,胃痞消各劑量組G0/G1期細胞百分率顯著增加(均P<001)，S期細胞百分率顯著降低(均P<001),胃痞消高、低劑量組G2+M期細胞百分率顯著減少(均P<001),而胃痞消中劑量組則差異無顯著性意義(P>005)。表1各組脾虛型PLGC大鼠胃黏膜上皮細胞增殖周期分布及凋亡率比較(±s)

組別Np凋亡/%p增殖周期/%G0/G1期S期G2+M期正常對照組101022±2154572±0954720±1201012±151模型組13461±167①3281±125①6280±110①744±168①胃痞消高劑量組132122±242③④7199±168③④2260±170③④753±176④胃痞消中劑量組132063±250③④5960±132③④3219±210③④932±201②胃痞消低劑量組131684±235③④5410±109③④4175±160③④622±184④維酶素組131062±181③3750±114③5497±190③1064±166③①P<001，與正常對照組比較;②P<005,③P<001，與模型組比較;④P<001,與維酶素組比較

22各組對脾虛型PLGC大鼠胃黏膜上皮細胞p53、Bcl2、Bax表達的影響表2結(jié)果顯示：與正常對照組比較,模型組p53和Bax表達顯著減少(均P<001),而Bcl2表達顯著增加(P<001)。與模型組比較,胃痞消高、中、低劑量組和維酶素組p53表達顯著增加(均P<001),而Bcl2表達顯著減少(均P<001),胃痞消高劑量組Bax表達顯著增加(P<005),而胃痞消中、低劑量組Bax表達差異無顯著性意義(均P>005)。表2各組脾虛型PLGC大鼠胃黏膜上皮細胞p53、Bcl2、Bax表達比較(±s)

組別Np53Bcl2Bax正常對照組104752±5361144±3024232±1122模型組131236±439①2652±492①2855±961①胃痞消高劑量組133375±819③⑤1426±335③⑤4146±1220②④胃痞消中劑量組132794±627③④1688±345③④3663±1144胃痞消低劑量組132361±842③1959±328③3381±664維酶素組132082±768③2115±343③3127±548①P<001,與正常對照組比較;②P<005，③P<001,與模型組比較;④P<005,⑤P<001，與維酶素組比較。公務員之家

3討論

腫瘤是一類細胞周期性疾病,是增殖與凋亡失平衡的過程[5],表現(xiàn)為細胞的過度增生和死亡/凋亡減少。細胞可分為靜止期(G0)和增殖期,增殖周期由G1期、S期、G2期及M期和G0/G1、G1/S、G2/M3個調(diào)控點組成,化學物質(zhì)可通過影響增殖周期內(nèi)物質(zhì)代謝,在調(diào)控點作用下,阻滯于G1、S或M期。MNNG作為較強的化學致癌劑,可導致細胞DNA甲基化性損傷[6],常用于誘發(fā)實驗性PLGC。本研究結(jié)果表明,模型組胃黏膜上皮細胞凋亡以及G0/G1期、G2+M期細胞百分率顯著減少,而S期細胞百分率顯著增加,與胃癌前病變存在細胞凋亡和增殖的調(diào)節(jié)紊亂結(jié)果相符[7],提示PLGC大鼠模型復制成功,胃黏膜上皮細胞存在細胞增殖阻滯(阻滯于S期),大鼠胃黏膜從正常胃黏膜細胞→淺表性胃炎→萎縮性胃炎→腸上皮化生→異型性增生,其凋亡率逐漸升高[8]。本實驗結(jié)果表明,PLGC大鼠胃黏膜上皮細胞凋亡率顯著減少,提示可能存在異型增生。胃痞消各劑量組可顯著增加PLGC大鼠G0/G1期胃黏膜上皮細胞百分率,減少S期細胞百分率,表明胃痞消有細胞增殖抑制作用,可阻滯于G0/G1期,減少S、M期細胞百分率。

細胞的凋亡是由凋亡基因進行調(diào)控的。p53基因是一種抗癌基因,參與基因穩(wěn)定,p53功能缺失或者發(fā)生突變將導致腫瘤的惡性增生[9]。p53基因表達產(chǎn)物p53蛋白也能活化p21wafl基因表達,從而抑制細胞周期蛋白激酶復合物如cyclinD/cdk4的活性,抑制損傷細胞由G1進入S期,活化的p53蛋白水平增加可降低細胞發(fā)生凋亡反應的閾值,促進不能修復受損細胞的凋亡[10]。促凋亡基因Bax可以與Bcl2形成異二聚體,決定細胞凋亡的敏感性[11]。Bcl2可直接調(diào)節(jié)線粒體膜上通透性轉(zhuǎn)換孔的通透性,阻止細胞色素C釋放入胞質(zhì)而抑制細胞凋亡,而Bax可直接結(jié)合到線粒體膜上,增加線粒體膜上通透性轉(zhuǎn)換孔膜的通透性,引起細胞色素C釋放入胞漿,激活Caspases家族,最終引起凋亡[12]。由本實驗結(jié)果可知,PLGC大鼠胃黏膜上皮細胞p53和Bax表達減少、Bcl2表達增加,提示PLGC大鼠胃黏膜上皮細胞存在增殖與凋亡異常,與增殖周期細胞百分率結(jié)果一致。胃痞消各劑量組可通過促進p53和Bax表達,同時抑制Bcl2表達,阻止PLGC胃黏膜上皮細胞從G0/G1期進入S期,并通過誘導凋亡,抑制胃癌前病變不典型增生基礎上的癌性惡變。

綜上所述,健脾化瘀解毒中藥胃痞消可抑制PLGC胃黏膜上皮細胞的不典型增生和促進細胞凋亡,其機制可能與其能促進p53和Bax表達、抑制Bcl2表達有關(guān)。

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