導(dǎo)語(yǔ)：六味地黃丸抑制黑色素瘤研究論文一文來(lái)源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

【摘要】探討六味地黃丸含藥血清對(duì)單純皰疹病毒核苷激酶/丙氧鳥(niǎo)苷(HSVtk/GCV)系統(tǒng)殺傷小鼠黑色素細(xì)胞瘤B16細(xì)胞株的增效作用,為提高臨床基因治療腫瘤療效提供新思路?！痉椒ā繕?gòu)建并鑒定惡性黑色素瘤B16細(xì)胞HSVtk/GCV治療系統(tǒng),制備六味地黃丸含藥血清及對(duì)照血清,將B16、B16/tk細(xì)胞按20%(1∶4)的比例混合制成細(xì)胞懸浮液接種于96孔培養(yǎng)板上,分為對(duì)照血清組、含藥血清組、對(duì)照血清聯(lián)合GCV組、含藥血清聯(lián)合GCV組,其中含藥血清組及含藥血清聯(lián)合GCV組按血清體積分?jǐn)?shù)計(jì)又分高(10%)、中(5%)、低(25%)3組,GCV的終濃度為25μmol/L,按分組添加相應(yīng)的含藥血清,每孔培養(yǎng)液總體積200μL,37℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。48h后采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測(cè)殺傷效應(yīng)。采用金正鈞Q值法分析六味地黃丸含藥血清與自殺基因治療系統(tǒng)聯(lián)合作用對(duì)旁觀者效應(yīng)是否具有協(xié)同性?！窘Y(jié)果】MTT實(shí)驗(yàn)表明聯(lián)合用藥組對(duì)B16細(xì)胞的抑制率明顯高于其他組,六味地黃丸含藥血清對(duì)B16細(xì)胞株HSVtk/GCV系統(tǒng)的增效作用存在量效關(guān)系：25%、5%、10%含藥血清聯(lián)合20%tk/GCV組的實(shí)際抑制率(4875%、5939%、6928%)顯著高于理論抑制率(3813%、3867%、3992%),金正鈞Q值分別為128、154、174,均大于115,具有協(xié)同增效作用

【關(guān)鍵詞】六味地黃丸/藥理學(xué);自殺基因療法;黑色素細(xì)胞/病理學(xué);細(xì)胞培養(yǎng)

惡性黑色素瘤被選擇作為腫瘤基因治療的第一個(gè)臨床試用目標(biāo),經(jīng)過(guò)近20年的摸索已取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展,其中自殺基因療法以其獨(dú)特的旁觀者效應(yīng)而備受青睞[1]。目前單純皰疹病毒Ⅰ型核苷激酶(HSV1tk)自殺基因治療轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤已應(yīng)用于Ⅰ/Ⅱ期的臨床研究[2],但仍存在轉(zhuǎn)染效率低、靶向性不夠、治療載體的毒副作用等問(wèn)題,使單純自殺基因治療難以完全治愈惡性黑色素瘤。聯(lián)合治療是提高自殺基因治療療效的方法之一。前期實(shí)驗(yàn)表明[3]滋陰補(bǔ)腎經(jīng)典名方六味地黃丸對(duì)小鼠移植性惡性黑色素瘤自殺基因治療具有增效作用,本研究擬通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步論證,在構(gòu)建黑色素瘤B16細(xì)胞HSV1tk自殺基因治療系統(tǒng)的基礎(chǔ)上觀察六味地黃丸對(duì)其旁觀者效應(yīng)是否具有增效作用,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1材料與方法

11實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞SD大鼠,體質(zhì)量200～220g,雄性,健康,SPF級(jí),廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào)：SCXK(粵)20030001,粵監(jiān)證字：2007A024;小鼠惡性黑色素瘤細(xì)胞株B16購(gòu)于中山大學(xué)動(dòng)物中心細(xì)胞庫(kù)。

12試劑及耗材細(xì)胞培養(yǎng)用RPMI1640粉和25g/L含乙二胺四乙酸(EDTA)胰酶為Gibco公司產(chǎn)品,新生牛血清為奧地利PAA公司產(chǎn)品,青、鏈霉素合劑為杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司產(chǎn)品,四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、丙氧鳥(niǎo)苷(GCV)均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品,細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、凍存管均為德國(guó)Greinerbioone公司產(chǎn)品,一次性微孔濾膜為美國(guó)Corning公司產(chǎn)品,2倍TapPCRMasterMix為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品,基因組DNA提取試劑盒為上海申能博彩生物科技有限公司產(chǎn)品,瓊脂糖粉為美國(guó)Amresco公司產(chǎn)品,DNA凝膠電泳指示染料GoldView購(gòu)自北京賽百盛生物工程技術(shù)有限服務(wù)公司。

13主要儀器BNA3210型CO2培養(yǎng)箱(日本Espec公司),JH型超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠),XDS1B型倒置顯微鏡(重慶COIC公司),680型酶標(biāo)儀(美國(guó)BioRad公司),XYJ801型電動(dòng)離心機(jī)(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠),318K型高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司),JB1型磁力攪拌器(上海雷磁儀器廠新涇分廠),TP600型PCR儀(大連TaKaRa公司),DYY8C型穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳系統(tǒng)(美國(guó)BioRad公司),GenDoc1000型凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)BioRad公司),IX71F22FL/PH型圖像采集系統(tǒng)(日本Olympus公司),80210398型紫外分光光度計(jì)(英國(guó)PharmciaBiotech公司)。

14惡性黑色素瘤細(xì)胞HSVtk/GCV治療系統(tǒng)的構(gòu)建與鑒定

141惡性黑色素瘤細(xì)胞HSVtk/GCV治療系統(tǒng)的構(gòu)建取PT67/tk細(xì)胞病毒上清液感染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的B16細(xì)胞,G418抗性篩選陽(yáng)性克隆命名為B16/tk并擴(kuò)大培養(yǎng)。

142惡性黑色素瘤細(xì)胞HSVtk/GCV治療系統(tǒng)的鑒定提取B16/tk細(xì)胞基因組DNA,采用PCR法對(duì)tk基因進(jìn)行鑒定。引物由Invitrogen公司廣州合成部合成,上游引物：5GCAGCAAGAAGCCACGGAAGTC3,下游引物：5GTGTTGTGTGGTGTAGATGTTC3,產(chǎn)物片段：226bp。PCR反應(yīng)體系：模板DNA05μg、上下游引物(10μmol/L)各025μL、2倍TapPCRMasterMix5μL,用ddH2O補(bǔ)足體積至10μL。PCR循環(huán)條件：94℃預(yù)變性5min,94℃變性30s,62℃退火30s,72℃延伸30s,30個(gè)循環(huán),最后72℃延伸7min。擴(kuò)增結(jié)束后,用20g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。

143B16/tk生物活性檢測(cè)方法將B16/tk和野生型B16細(xì)胞分別以2×103、3×103、5×103個(gè)/孔細(xì)胞接種96孔板,同時(shí)加入不同濃度的GCV使終濃度分別為001、01、1、10、100、500μmol/L,以不加GCV的細(xì)胞孔作對(duì)照,每一濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔,倒置顯微鏡觀察殺傷效應(yīng)并攝像。

15GCV工作濃度及tk+比例確定方法將B16/tk和B16按照0%、10%、20%、40%、100%比例混合,分別加入GCV，終濃度為0、625、125、25、50、100、200μmol/L,MTT法檢測(cè)殺傷效率。

16對(duì)照血清與含藥血清的制備及其對(duì)B16細(xì)胞生長(zhǎng)影響的檢測(cè)方法

161血清制備SPF級(jí)健康SD大鼠30只,隨機(jī)分為六味地黃丸組與對(duì)照組,分別灌服六味地黃丸研磨液8mL(含生藥4g)和等容積的蒸餾水,連續(xù)灌胃4d,末次給藥后1h腹主動(dòng)脈取血,制備血清,-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

162分組及檢測(cè)方法體外實(shí)驗(yàn)設(shè)5組(以體積分?jǐn)?shù)計(jì)，下同),即10%新生牛血清組，10%對(duì)照血清組，25%含藥血清組(75%對(duì)照血清和25%含藥血清)，5%含藥血清組(5%對(duì)照血清和5%含藥血清)，10%含藥血清組,采用MTT法檢測(cè)不同濃度血清對(duì)B16細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔的光密度(D)值并計(jì)算細(xì)胞抑制率：p細(xì)胞抑制(%)=(1-D測(cè)定孔/D對(duì)照孔)×100%。

17對(duì)照血清與含藥血清對(duì)B16細(xì)胞株tk/GCV系統(tǒng)增效作用量效關(guān)系的檢測(cè)方法按B16/tk占總細(xì)胞數(shù)的20%(1∶4)比例混合B16與B16/tk細(xì)胞,設(shè)置10%對(duì)照血清組，25%、5%、10%含藥血清組，10%對(duì)照血清聯(lián)合GCV組,25%、5%、10%含藥血清聯(lián)合GCV組。采用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的抑制率,并采用金正鈞Q值法[4]分析六味地黃丸含藥血清與自殺基因治療系統(tǒng)聯(lián)合作用對(duì)旁觀者效應(yīng)是否具有協(xié)同性。

18統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS130統(tǒng)計(jì)軟件處理,各組間實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)比較采用兩樣本均數(shù)的t檢驗(yàn),多組間比較用OneWayANOVA法。

2結(jié)果

21惡性黑色素瘤細(xì)胞HSVtk/GCV治療系統(tǒng)的構(gòu)建與鑒定結(jié)果

211瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果以PT67/tk細(xì)胞病毒上清液感染的B16細(xì)胞,經(jīng)過(guò)抗性篩選后,PCR鑒定結(jié)果見(jiàn)圖1,野生型B16細(xì)胞組未見(jiàn)條帶,B16/tk組可見(jiàn)一清晰條帶,產(chǎn)物位于200～300bp之間。

212B16/tk生物活性測(cè)定結(jié)果倒置顯微鏡觀察野生型B16和B16/tk在添加GCV前生長(zhǎng)狀態(tài)與數(shù)目無(wú)明顯差異,加GCV后48h觀察,B16/tk的高濃度組(10、100、500μmol/L)大部分細(xì)胞出現(xiàn)死亡,表現(xiàn)為胞膜不完整、輪廓模糊、不透亮、形狀不規(guī)則、并且碎裂成小粒狀,且密度為2×103/孔時(shí)最明顯,1μmol/L組僅見(jiàn)極少數(shù)細(xì)胞死亡,且細(xì)胞發(fā)生明顯增殖,其他濃度組及野生型B16細(xì)胞組均呈現(xiàn)明顯的細(xì)胞增殖。密度為2×103/孔的B16和B16/tk在添加10μmol/LGCV48h后的細(xì)胞形態(tài)見(jiàn)圖2(彩圖見(jiàn)第556頁(yè))。

22GCV工作濃度及tk+比例的確定結(jié)果圖3、圖4(彩圖見(jiàn)第557頁(yè))結(jié)果顯示,當(dāng)GCV濃度達(dá)625μmol/L以上時(shí)對(duì)B16/tk細(xì)胞表現(xiàn)出一定的殺傷效應(yīng),GCV濃度達(dá)100μmol/L以上時(shí)對(duì)B16有一定的細(xì)胞毒性作用,選擇對(duì)B16/tk敏感而對(duì)B16無(wú)細(xì)胞毒性的GCV濃度(625~100μmol/L),并且發(fā)揮最大殺傷效應(yīng)的最低GCV濃度作為本實(shí)驗(yàn)的最適GCV工作濃度,故GCV的工作濃度確定為25μmol/L。

40%B16/tk與100%B16/tk組在較低濃度的GCV(625μmol/L)時(shí),就能殺傷幾乎全部細(xì)胞(B16/tk與B16),即40%B16/tk細(xì)胞混合時(shí)比例太高,殺傷效應(yīng)太強(qiáng),聯(lián)合殺傷沒(méi)有發(fā)揮的空間;而B(niǎo)16與10%B16/tk組在GCV濃度很高(100μmol/L)時(shí),殺傷效應(yīng)也很弱;20%B16/tk組則既能觀察到旁觀者效應(yīng),又為中藥留有足夠的發(fā)揮空間,故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用20%B16/tk比例混合組。

23對(duì)照血清與含藥血清對(duì)B16細(xì)胞生長(zhǎng)的影響含藥血清孵育前,倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好,細(xì)胞形態(tài)與數(shù)目無(wú)明顯差異,添加相應(yīng)血清后48h鏡下觀察細(xì)胞貼壁穩(wěn)定,細(xì)胞密度高,生長(zhǎng)旺盛,含藥血清組細(xì)胞數(shù)目多于10%新生牛血清組與10%對(duì)照血清組。MTT法檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1,10%對(duì)照血清組與10%新生牛血清組對(duì)細(xì)胞作用比較差異無(wú)顯著性意義(P>005),而六味地黃丸含藥血清各組對(duì)細(xì)胞有增殖作用(均P<001)。

24各組對(duì)B16細(xì)胞株HSVtk/GCV系統(tǒng)增效作用量效關(guān)系的檢測(cè)結(jié)果MTT法分析各組的抑制率見(jiàn)表2,含藥血清聯(lián)合GCV各濃度組的實(shí)際抑制率明顯高于相應(yīng)濃度的理論抑制率,金正鈞Q值分別為128、154、174,均大于115,具有協(xié)同增效作用。表1各組對(duì)B16細(xì)胞生長(zhǎng)的影響(MTT檢測(cè))表2各組對(duì)B16細(xì)胞株HSVtk/GCV系統(tǒng)

3討論

黑色素瘤是表皮基底黑色素細(xì)胞發(fā)生的惡性腫瘤,好發(fā)于頭頸部,其惡性程度高,容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,預(yù)后差。臨床治療以手術(shù)切除為主,放療化療效果差[5],基因治療尤其是自殺基因療法給黑色素瘤患者帶來(lái)了希望。自殺基因療法即將自殺基因?qū)肽[瘤細(xì)胞中,其基因表達(dá)產(chǎn)物可選擇性地將低毒或無(wú)毒的前體藥物代謝成有毒代謝產(chǎn)物,這些有毒代謝產(chǎn)物通過(guò)干擾細(xì)胞DNA正常合成而使細(xì)胞死亡[6]。自殺基因療法有一個(gè)突出的優(yōu)點(diǎn)“旁觀者效應(yīng)”(bystandereffect),即導(dǎo)入自殺基因的腫瘤細(xì)胞對(duì)鄰近的未導(dǎo)入自殺基因的腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用,近年來(lái)備受關(guān)注[7]。Bonnekoh等[8]在黑色素瘤自殺基因治療的模型研究中發(fā)現(xiàn),腫瘤體積減少的程度(80%)與轉(zhuǎn)導(dǎo)效率推測(cè)的程度不成比例,考慮到可能是通過(guò)旁觀者效應(yīng)殺傷未導(dǎo)入基因的鄰近分裂細(xì)胞,提高旁觀者效應(yīng)。

HSV1tk/GCV系統(tǒng)是最常用的自殺基因治療系統(tǒng),旁觀者效應(yīng)的有無(wú)關(guān)系到HSV1tk/GCV系統(tǒng)治療的成敗,除極少數(shù)細(xì)胞株未發(fā)現(xiàn)旁觀者效應(yīng)外,絕大多數(shù)細(xì)胞株均有旁觀者效應(yīng)。不同細(xì)胞對(duì)該系統(tǒng)敏感性的差異,很大程度上與旁觀者效應(yīng)的強(qiáng)弱有直接關(guān)系。如圖4(彩圖見(jiàn)第557頁(yè))示低濃度(625μmol/L)的GCV能殺傷70%以上的100%B16/tk細(xì)胞,提示B16/tk具有生物活性,B16細(xì)胞株對(duì)GCV敏感。但是轉(zhuǎn)染效率低下卻是臨床上應(yīng)用基因治療面臨的主要難題,在tk轉(zhuǎn)染低效率的情況下能獲得較強(qiáng)的旁觀者效應(yīng)將為自殺基因的應(yīng)用帶來(lái)更廣闊的前景。

為了更好地觀察六味地黃丸對(duì)旁觀者效應(yīng)的增效作用,我們將B16/tk與B16細(xì)胞以不同比例混合后檢測(cè)其對(duì)GCV的敏感性,發(fā)現(xiàn)B16/tk所占比例在40%及以上時(shí)低濃度的GCV(625μmol/L)即可發(fā)揮極強(qiáng)的旁觀者效應(yīng),聯(lián)合殺傷時(shí)中藥沒(méi)有發(fā)揮藥效的空間;而B(niǎo)16/tk所占比例在10%時(shí)高濃度GCV(200μmol/L)也未能顯示出明顯的殺傷效應(yīng),可能是10%B16/tk組tk+比例太低,旁觀者效應(yīng)太弱,另外考慮到B16/tk系統(tǒng)構(gòu)建時(shí)G418篩選后得到的tk+克隆并非單細(xì)胞克隆,即實(shí)際混合的10%B16/tk可能并未達(dá)到10%tk+,也可能是其未能觀察到旁觀者效應(yīng)的原因之一;20%B16/tk在GCV濃度為25μmol/L時(shí)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率為349%,能觀察到一定的旁觀者效應(yīng),并且還有足夠的殺傷空間,故此六味地黃丸和自殺基因聯(lián)合殺傷藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)選用20%B16/tk的混合細(xì)胞。公務(wù)員之家

本研究中采用的中藥血清藥理學(xué)方法不僅能反映中藥及其代謝產(chǎn)物的藥理作用,而且能反映可能由藥物誘導(dǎo)機(jī)體內(nèi)源性成分所產(chǎn)生的作用,更接近藥物在體內(nèi)環(huán)境產(chǎn)生的真實(shí)過(guò)程,對(duì)中藥復(fù)方的藥理學(xué)研究具有明顯優(yōu)勢(shì)。前期研究表明：大鼠血清本身對(duì)惡性黑色素瘤B16細(xì)胞有一定促生長(zhǎng)作用,血清濃度在10%以內(nèi)時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較好,隨血清濃度的增高細(xì)胞狀態(tài)變差。借鑒此結(jié)果,本實(shí)驗(yàn)選擇體積分?jǐn)?shù)25%、5%、10%的含藥血清作為工作濃度。無(wú)論是細(xì)胞培養(yǎng)用牛血清還是含藥血清,其成分復(fù)雜,為了減少實(shí)驗(yàn)中的影響因素,本研究在前期工作的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)。在細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)的基礎(chǔ)上添加含藥血清,用對(duì)照血清作為對(duì)照組,含藥血清采用10%總體積,為了排除大鼠血清本身對(duì)細(xì)胞的影響,藥物血清不足10%者,用大鼠對(duì)照血清補(bǔ)足體積。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與單獨(dú)自殺基因組(加對(duì)照血清)或單獨(dú)含藥血清組比較,聯(lián)合用藥明顯提高了對(duì)惡性黑色素瘤細(xì)胞的旁觀者效應(yīng),差異均有顯著性意義(P<001),協(xié)同性分析顯示聯(lián)合用藥組對(duì)惡性黑色素瘤細(xì)胞的殺傷作用是一種協(xié)同效應(yīng)(Q>115),這種協(xié)同效應(yīng)可能源于旁觀者效應(yīng)。旁觀者效應(yīng)的可能機(jī)制有縫隙連接機(jī)制、免疫介導(dǎo)機(jī)制、細(xì)胞凋亡機(jī)制、介質(zhì)機(jī)制等。體外實(shí)驗(yàn)無(wú)免疫介導(dǎo)機(jī)制,可見(jiàn)六味地黃丸可能通過(guò)縫隙連接機(jī)制或細(xì)胞凋亡機(jī)制介導(dǎo)旁觀者效應(yīng),達(dá)到協(xié)同增效作用,具體如何調(diào)節(jié)細(xì)胞縫隙連接通訊或細(xì)胞周期與凋亡從而增強(qiáng)旁觀者效應(yīng)還有待于進(jìn)一步深入研究。

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