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【摘要】目的研究溪黃草多糖含量及其對羥自由基的清除作用和抑菌作用。方法從溪黃草中提取精制多糖，測定出溪黃草多糖對葡萄糖的換算因子，用蒽酮硫酸法比色測定計算多糖的含量；采用Fenton反應(yīng)體系為模型，研究多糖對羥自由基的抑制作用；采用濾紙片法研究多糖的體外抑菌作用。結(jié)果溪黃草多糖含量為4.18%，重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和回收率較好；活性測試結(jié)果表明溪黃草多糖對羥自由基有較好的清除作用，對金黃色葡萄球菌和枯草桿菌有一定的抑菌效果。結(jié)論溪黃草多糖含量測定方法簡單可行，具有一定清除自由基和抑菌活性。

【關(guān)鍵詞】溪黃草；多糖；含量測定；羥自由基；抑菌作用

Abstract：ObjectiveTostudythecontentofpolysaccharidefromRabdosiaserra(Maxim.)Haraanditseffectonhydroxylfreeradicalandantibacteriostaticeffect.MethodsPolysaccharidewasextractedfromRabdosiaserra(Maxim.)Hara,anditscontentwasmeasuredbywayofanthronesulphuricacid.ItsinhibitoryeffectonhydroxylfreeradicalwasstudiedbyFentonreactionsystemasamodel.Itsantibacteriostaticeffectwasalsostudied.ResultsTheresearchshowedthatpolysaccharidecontentofRabdosiaserra(Maxim.)Harareached4.18%.Ithadinhibitoryeffectonhydroxylfreeradical，staphylococcusaureusandB.subtili.ConclusionThemethodofmeasuringpolysaccharidecontentissimpleandreliable.Thepolysaccharidehassomeactivities.

Keywords：Rabdosiaserra(Maxim.)Hara；Polysaccharide；Contentdetermination;Hydroxylfreeradical；Antibacteriostaticeffect

溪黃草Rabdosiaserra(Maxim.)Hara為唇形科香茶菜屬植物，是一種多年生小草本。具有清熱袪濕、涼血散淤之功效，民間用于治療急性肝炎、急性膽囊炎、跌打淤腫等癥［1］。多糖是一類免疫活性物質(zhì)，具有抗菌、抗病毒、抗寄生蟲、抗腫瘤、抗輻射、抗衰老等作用［2～5］。目前對溪黃草多糖的研究未見報道。本文建立石油醚去脂80%乙醇去雜熱水提取氯仿、正丁醇去蛋白質(zhì)活性炭去色素乙醇沉淀的提取工藝，從溪黃草中提取多糖，測得溪黃草多糖對葡萄糖的換算因子，用蒽酮硫酸比色法測定并計算出溪黃草多糖含量，根據(jù)實驗條件研究了其對羥自由基的清除作用和體外抑菌作用，期望為肇慶山區(qū)中藥材的綜合開發(fā)利用提供一些參考。

1器材

1.1儀器DJ10A傾倒式粉碎機、A2004N和FA2004N電子天平、RE52AA旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器、HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋、低溫冰柜、脂肪抽出裝置、電熱恒溫真空干燥箱、752分光光度計、UVProbe2550型紫外可見光光度計、電熱手提壓力蒸氣消毒器、水式熱恒溫培養(yǎng)箱。

1.2材料溪黃草購于肇慶中藥材市場；大腸桿菌（Escherichiacoil）、枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）、金黃色葡萄球菌（Stapphylocacusaureus）、黑曲霉（Aspergillusniger）、酵母菌(Yeastfungus)均由肇慶學(xué)院生物學(xué)系微生物室提供。（細菌于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上活化（37℃，24h）；霉菌于查氏培養(yǎng)基上活化（28℃，48h）；酵母菌于無菌水中活化（28℃，4h）。

1.3試劑蒽酮、濃硫酸、硫脲、水楊酸、過氧化氫、硫酸亞鐵、無水乙醇、丙醇、石油醚、乙醚、氯仿、正丁醇等為國產(chǎn)分析純。

2方法與結(jié)果

2.1溪黃草多糖的提取與精制稱取溪黃草粉末60g，置脂肪抽出裝置中，加入石油醚（60～90℃）250ml，回流脫脂。濾渣揮干溶劑后，加入80%乙醇回流提取2次（1.5h/次）。將濾渣揮干溶劑后加蒸餾水400ml，回流提取1h。取濾液，濾渣再加蒸餾水300ml提1次，將兩次所得濾液合并，減壓濃縮至一定體積。加入氯仿正丁醇液（4∶1）輕搖，靜置取多次，除去蛋白質(zhì)。水溶液中加入適量活性碳60℃保溫30min，過濾，濾液冷卻后加入乙醇，使乙醇濃度達85%，放置4℃冰箱中過夜。抽濾，沉淀依次用95%乙醇、丙醇、乙醚各洗3次，真空干燥至恒重，即得精制溪黃草多糖，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2樣品中溪黃草多糖含量測定

2.2.1標準溶液的配制精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖標準品0.2000g，置100ml容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度；搖勻，制成2.000mg/ml的標準溶液，然后分別移取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml標準溶液。置于10ml容量瓶中，以蒸餾水定容至刻度，搖勻、配成系列標準溶液。

2.2.2蒽酮

硫酸試液的配制稱取0.2000g蒽酮和1.000g硫脲，加入100ml濃硫酸，置于棕色瓶中，混合搖勻至暗處備用（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

2.2.3標準曲線的繪制分別準確移取系列標準溶液1ml于具塞試管中（各平行3份），以1ml蒸餾水作空白，各加入5ml蒽酮試劑（立即搖勻，置冰水浴中），加完后一起沸水浴8min，取出流水冷卻，室溫靜置10min，于620nm處測定吸光值，以吸光值（A）對葡萄糖濃度（C）作回歸處理，得回歸方程：A=3.359C－0.01119，r=0.9998。

2.2.4換算因子的測定精密稱取2.1項下所得精制多糖10mg，置100ml容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密吸取此液1.0ml置10ml容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度搖勻作貯備液。精密吸取貯備液2.0ml，用標準曲線項的方法測吸光值，從回歸方程中求出多糖供試液中葡萄糖濃度，按下式計算，測得換算因子F＝5.364。

換算因子F=w/c×d［w為多糖含量（mg），c為多糖稀釋液中葡萄糖濃度mg/ml，d為多糖的稀釋因素］

2.2.5樣品溶液的制備精密稱取溪黃草粉末0.5g（過60目篩、平行3份）置三角瓶中，加80%乙醇30ml，回流提取1h，趁熱過濾，殘渣用熱乙醇洗滌（8ml×3次）。殘渣連同濾紙置三角瓶中，加入40ml蒸餾水回流提取1h，趁熱過濾，殘渣用熱水洗滌（8ml×3次），洗液并入濾液中，置冷后定容于100ml容量瓶中，搖勻備用。

2.2.6樣品中溪黃草多糖含量測定精密吸取樣品溶液2.0ml同

2.2.3項方法操作，測定供試液中葡萄糖含量。按下式計算樣品中多糖的含量：多糖含量（%）＝C.D.F/W×100［C為供試液中葡萄糖濃度（mg/ml），D為供試液的稀釋因素，F(xiàn)為換算因子，W為供試樣品重量（mg）］。其結(jié)果見表1。表1溪黃草中多糖含量測定結(jié)果（略）

2.2.7重現(xiàn)性實驗

精密稱取過60目篩的溪黃草粉末0.5g5份，按2.2.5項方法制取5份樣品溶液。精密吸取樣品液2.0ml，同2.2.3項方法測定吸光值，計算其多糖含量。結(jié)果見表2。表2溪黃草多糖含量測定重現(xiàn)性實驗結(jié)果（略）

2.2.8穩(wěn)定性實驗精密吸取2.2.5項中樣品溶液2.0ml于具塞試管中，按2.2.3項方法測定吸光值，每隔1h測定1次，連續(xù)4次考察其穩(wěn)定性。結(jié)果見表3。表3溪黃草多糖穩(wěn)定性實驗結(jié)果（略）

2.2.9回收率的測定精密稱取溪黃草粉末0.5g3份，各加入精制多糖20mg，按2.2.5項樣品溶液的制備和2.2.3項方法測定吸光值。計算回收率，結(jié)果見表4。表4加樣回收率測定（略）

2.3溪黃草多糖活性研究

2.3.1溪黃草多糖對羥自由基的清除作用將2.1項下溪黃草多糖配制成不同濃度的水溶液，采用固定反應(yīng)時間法，在相同體積的反應(yīng)體系（8.8mmol/LH2O21ml，9mmol/LFe2+1ml,9mmol/L水楊酸-乙醇溶液1ml）中分別加入一系列不同濃度的多糖液。并以蒸餾水為參比，與試劑空白液比較，在λ=510nm處測量各濃度下的吸光度。計算被測物對羥自由基的清除作用。結(jié)果見圖1。

清除率（%）=（A0-Ax）/A0×100

2.3.2溪黃草多糖的抑菌作用采用濾紙片法：將濾紙片滅菌、烘干，放到不同濃度的溪黃草多糖水溶液中浸泡2h。將活化好的各供試菌種用無菌水分別稀釋制成含菌數(shù)約1000cfu/ml菌懸液，于固體培養(yǎng)基上制成含菌平皿，放置10min，待菌液稍滲入培養(yǎng)基后，每個平皿呈“+”形對稱放置5片圓濾紙片，正中間的濾紙片浸雙蒸水作為參照，其余4片浸多糖水溶液，每個濃度每種菌平行做4個樣，每個皿做3次重復(fù)。然后把培養(yǎng)皿放到培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后測定各供試菌的抑菌圈直徑大小。結(jié)果見表5。表5溪黃草多糖水溶液的抑菌效果（略）

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基pH為7.0；麥氏瓊脂培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基pH為自然；表中數(shù)據(jù)為3次（每次4個樣）重復(fù)平行實驗的平均值。

3討論

實驗2.1項中醇沉下來的白色物質(zhì)，經(jīng)紫外光譜檢測在260～280nm處未見到核酸和蛋白質(zhì)的吸收峰；在280nm處吸光值低于0.03，說明所提物中基本不含蛋白質(zhì)雜質(zhì)。經(jīng)硫酸苯酚顏色反應(yīng)為棕紅色，與硫酸－蒽酮試劑反應(yīng)呈深綠色，證明所提物質(zhì)為多糖。實驗2.2.5項中首先用80%乙醇回流以除去醇溶性的干擾成分防止其成為多糖中的雜質(zhì)，再用水提取多糖成分，提取效果較好。

多糖是中草藥的有效成分之一，而多糖多無法直接測定。本文利用多糖在硫酸的作用下水解成單糖分子，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與蒽酮生成深綠色化合物，以比色法測定其含量。結(jié)果表明，此方法簡便，供試液顯色穩(wěn)定、重現(xiàn)性好。

在羥自由基產(chǎn)生體系中加入多糖溶液時，有色產(chǎn)物的生成量會隨著多糖濃度的增大而不斷減少，即隨著多糖濃度的增大清除率也增大。實驗結(jié)果表明溪黃草多糖對羥自由基有一定清除作用，且與溪黃草多糖的濃度成正相關(guān)性。由于本文所采用的自由基模型體系所產(chǎn)生的自由基濃度遠大于體內(nèi)該自由基的濃度，可見它是良好的自由基清除劑。

采用濾紙片法研究不同濃度的溪黃草多糖水溶液對金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸桿菌、酵母菌和黑曲霉的抑菌作用。從表5中可以看出該多糖水溶液對金黃色葡萄球菌和枯草桿菌有一定的作用,并且濃度越高抑菌效果越好；5.0%濃度時對大腸桿菌有作用，2.5%濃度時對面包酵母有作用，5.0%濃度時對黑曲霉有作用。

【參考文獻】

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