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【論文關(guān)鍵詞】缺血再灌注；凋亡；丹參；中藥；綜述

【論文摘要】細(xì)胞過(guò)度凋亡參與了缺血再灌注損傷(Ischimiareperfusioninjury,IRI)的發(fā)生。我國(guó)傳統(tǒng)中藥丹參可在細(xì)胞、分子、基因水平調(diào)控IRI時(shí)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，從而對(duì)IRI具有良好的防治作用。

在肝、腎、腦等器官缺血再灌注損傷(Ischimiareperfusioninjury,IRI)造成的細(xì)胞死亡形式中，凋亡也是一種常見(jiàn)而重要的形式[1-4]。組織細(xì)胞一旦壞死，目前人們尚無(wú)辦法干預(yù)；但細(xì)胞凋亡是受一系列程序控制的過(guò)程，人們有可能通過(guò)干預(yù)死亡程序加以挽救。丹參經(jīng)現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)技術(shù)證實(shí)，對(duì)IRI時(shí)細(xì)胞過(guò)度凋亡有抑制作用，本文就此方面的內(nèi)容予以綜述。

1丹參對(duì)IRI時(shí)細(xì)胞凋亡的抑制作用

Wu.W等[5]利用原位細(xì)胞凋亡標(biāo)記(terminaldeoxynucleotidyltransferasemediateduridinenucleotideendlabeling,TUNEL)實(shí)驗(yàn)觀察到：左大腦中動(dòng)脈結(jié)扎后24h大鼠大腦皮層、尾狀核、豆?fàn)詈巳毖獏^(qū)出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞，24~48h達(dá)到高峰；預(yù)先給予丹參則在相應(yīng)部位只見(jiàn)到少量凋亡細(xì)胞；且與對(duì)照組比較，24h時(shí)間段組織損傷明顯減輕。提示丹參可能通過(guò)減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡對(duì)腦IRI發(fā)揮保護(hù)作用。丹參是否對(duì)其他器官也有類似作用目前尚未明了。

2丹參抑制IRI時(shí)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制

2．1減少蛋白酶表達(dá)

細(xì)胞發(fā)生凋亡的中心環(huán)節(jié)是激活以蛋白酶-白介素-1轉(zhuǎn)化酶(interleukin-1β-convertingenzyme,ICE)組成的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。ICE可在天冬氨酸殘基之后將33KD的IL-1前體裂解為17．5KD的IL-1β，屬于ICE蛋白酶超家族。

目前已發(fā)現(xiàn)13個(gè)成員，根據(jù)其序列同源性分為3個(gè)亞家族：ICE-樣、ICE-1樣和CPP32樣蛋白酶。它們具有保守的底物結(jié)合和酶促序列，在天冬氨酸后將底物降解，故該酶現(xiàn)被稱為半胱天冬蛋白酶(cysteineapartate-specificproteinase,caspase)，并把上述三個(gè)亞家族分別稱為caspase-1、caspase-2和caspase-3亞家族。它們的過(guò)度表達(dá)將導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生[6]。

張金濤等[7]利用S-P免疫組化法發(fā)現(xiàn)，前腦IRI后1d，大鼠海馬CA1、CA4區(qū)出現(xiàn)明顯的ICE免疫陽(yáng)性反應(yīng)，第3天達(dá)高峰，第5天后明顯減少；腦皮質(zhì)也呈現(xiàn)出與海馬區(qū)類似的現(xiàn)象，ICE免疫陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞散在分布。與此相反，丹參組ICE的表達(dá)明顯減少，特別是大腦皮層區(qū)和海馬CA1區(qū)。因此，作者認(rèn)為ICE在腦缺血中可能發(fā)揮重要的凋亡調(diào)節(jié)作用；丹參能下調(diào)腦缺血區(qū)ICE表達(dá)，從而發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用。

2．2阻斷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

大多數(shù)情況下，來(lái)自于細(xì)胞外的誘導(dǎo)因素，如自由基、細(xì)菌、病毒等作用于細(xì)胞后轉(zhuǎn)化為細(xì)胞凋亡信號(hào)，并通過(guò)胞內(nèi)不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑最終激活細(xì)胞死亡程序，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此，凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是連接凋亡誘導(dǎo)因素與核DN段化斷裂及細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白降解的中間環(huán)節(jié)[6]。丹參經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，可干預(yù)下列已知的凋亡相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而實(shí)現(xiàn)其抗凋亡作用。

2．2．1死亡因子及其受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

腫瘤壞死因子(TNF)家族中的TNF、Fas配體、TNF-相關(guān)凋亡誘導(dǎo)性配體(TNF-relatedapoptosisinducingligand,TRAIL或Apo2L)和Apo3L能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，因此被稱為死亡因子[6]。介導(dǎo)它們誘導(dǎo)凋亡的受體為死亡受體。在體內(nèi)，TNF主要由巨噬細(xì)胞(Mφ)分泌。大量體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明，丹參不僅可有效抑制Mφ分泌TNF-α，還可以在基因水平抑制TNF-α在肝、腎、心等組織中的蛋白表達(dá)[8,9,10,18]。所以，丹參可能通過(guò)抑制TNF-α的生成和釋放，減少IRI時(shí)細(xì)胞凋亡。但其具體受體后途徑是抑制NF-κB還是JNF/AP-1則目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。

2．2．2第二信使鈣誘導(dǎo)的凋亡

Ca2+是細(xì)胞凋亡發(fā)生過(guò)程中重要的信息分子。［Ca2+］i持續(xù)升高可使核酸內(nèi)切酶激活，DN段化。應(yīng)用膜聯(lián)蛋白熒光素(Annexin-V-Fluos)、碘化丙啶(PI)雙標(biāo)記及流式細(xì)胞術(shù)、全細(xì)胞膜片鉗放大系統(tǒng)顯微熒光測(cè)定術(shù)同步觀察H2O2誘導(dǎo)人類肝細(xì)胞(LO2細(xì)胞)、內(nèi)皮細(xì)胞(EVC304)凋亡時(shí)不同時(shí)限Ca2+流變化和丹參提取物Rxa的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)：①H2O2作用后0．5h即出現(xiàn)Ca2+躍升現(xiàn)象；當(dāng)［Ca2+］i>400nmol/L后1h出現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡膜翻轉(zhuǎn)現(xiàn)象，即磷脂酰絲氨酸從細(xì)胞膜內(nèi)層轉(zhuǎn)移到外層；此后，［Ca2+］i持續(xù)升高，早期凋亡細(xì)胞(Annexia-V+)、死亡細(xì)胞(PI+)指數(shù)均上升；熒光顯微鏡下出現(xiàn)大量綠色熒光的早期凋亡細(xì)胞和胞漿或胞核紅染的死亡細(xì)胞。同時(shí)［Ca2+］i上升了一個(gè)數(shù)量級(jí)；②在Rax處理組H2O2作用8h后［Ca2+］i尚未超過(guò)400nmol/L，與對(duì)照組比較差異顯著(P<0．01)。其余各指標(biāo)也相應(yīng)降低，細(xì)胞凋亡數(shù)減少[11]。這一實(shí)驗(yàn)表明，H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可能主要是Ca2+依賴性的，且［Ca2+］i>400nmol/L很可能是細(xì)胞凋亡啟動(dòng)的早期信號(hào)。Rax有效阻抑了第二信使Ca2+跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，由此可能減少其在核內(nèi)促進(jìn)凋亡基因信號(hào)傳遞中的作用及其后引起的細(xì)胞凋亡，減輕細(xì)胞損傷。分析其機(jī)理可能是：①作為咖啡?？s酚酸衍生物之一的Rax富含酚羥基，可和H2O2發(fā)生氧化反應(yīng)，接受O-生成羧基-COOH，從而直接減輕H2O2對(duì)細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜的損傷，減少Ca2+經(jīng)細(xì)胞膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滲漏入細(xì)胞內(nèi)；②因肝細(xì)胞Ca2+內(nèi)流由鈣-鈣調(diào)蛋白復(fù)合物和IP3敏感鈣池共同調(diào)節(jié)。故Rax對(duì)LO2極顯著的Ca2+阻滯作用可能是直接作用于鈣-鈣調(diào)節(jié)蛋白受體，阻止受體操縱性鈣通道開(kāi)放所致[11]。

2．2．3由線粒體損傷后啟動(dòng)的細(xì)胞凋亡新近的研究證實(shí)，由活性氧(ROS)、細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載或缺血缺氧等病理因素也是誘發(fā)細(xì)胞凋亡的重要觸發(fā)機(jī)制[11,12]。當(dāng)這些死亡信號(hào)到達(dá)線粒體后，首先引起線粒體滲透性轉(zhuǎn)換并釋放凋亡相關(guān)蛋白，包括細(xì)胞色素C(cyt-C)及caspase-3等，cyt-C而后參與激活凋亡激活因子與caspase-9的結(jié)合及caspase-9的激活，后者繼而激活caspase-3，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。IRI時(shí)ROS生成過(guò)多，細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，線粒體受損，誘導(dǎo)細(xì)胞過(guò)度凋亡[6]。丹參具有強(qiáng)大的清除自由基、減輕鈣超載、保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)和功能的完整等作用，因而可切斷上述誘導(dǎo)因素的產(chǎn)生，阻斷了此通路啟動(dòng)的細(xì)胞凋亡[13-15,17]。

2．3調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因表達(dá)

細(xì)胞凋亡是級(jí)聯(lián)式基因表達(dá)的結(jié)果。目前已知細(xì)胞凋亡相關(guān)基因多達(dá)數(shù)十種，根據(jù)功能不同分為三類：抑制凋亡基因，如EIB、ZAP、Bcl-2，其中對(duì)Bcl-2的研究最為詳細(xì)而系統(tǒng)；促進(jìn)凋亡基因，如Fas、Bax、ICE、P53等；雙向調(diào)控基因，如J-myc、Bclk等。正常情況下，促進(jìn)凋亡基因與抑制凋亡基因處于協(xié)調(diào)的對(duì)立統(tǒng)一狀態(tài)，IRI時(shí)這種平衡被打破，組織細(xì)胞凋亡增多[2]。

張金濤等[7]報(bào)道BcL-2在前腦缺血2h就有表達(dá)，于6h達(dá)高峰，其后減少。此變化以海馬CA1區(qū)最為顯著。說(shuō)明BcI-2主要在細(xì)胞凋亡早期發(fā)揮作用。丹參在缺血30min給予后，BcL-2的表達(dá)明顯增加。趙明中等[15]采用心肌IRI模型，以TUNEL及S-P免疫組化法進(jìn)一步證實(shí)復(fù)方丹參滴丸不僅可以使BcL-2蛋白的陽(yáng)性表達(dá)數(shù)(PEI)明顯增加，還可使心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)及Fas蛋白PEI下降。且隨著復(fù)方丹參滴丸的劑量加大而進(jìn)一步降低(P<0．05；P<0．01),說(shuō)明丹參可恢復(fù)各凋亡基因之間的平衡，從而發(fā)揮其保護(hù)作用。

綜上所述，丹參作用廣泛，對(duì)IRI細(xì)胞凋亡各環(huán)節(jié)都有調(diào)節(jié)作用，從細(xì)胞、分子及基因水平阻斷了IRI發(fā)生發(fā)展過(guò)程中因細(xì)胞凋亡引起的一系列“惡性循環(huán)”，從而表現(xiàn)出對(duì)IRI顯著的保護(hù)作用。因此，丹參對(duì)減輕IRI來(lái)說(shuō)是一種十分理想的藥物，在臨床上具有廣闊的應(yīng)用前景；同時(shí)丹參的抗凋亡作用也為臨床上治療因凋亡過(guò)度引起的疾病提供了一條新思路。

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