導(dǎo)語：羥基磷灰石涂層材料制備論文一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

〔摘要〕目的：觀察含鑭羥基磷灰石作為涂層材料的細(xì)胞相容性。方法：將原代培養(yǎng)的成骨細(xì)胞接種到涂層表面，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)觀察第1、7、14、21天細(xì)胞在材料表面的附著、增殖情況，采用SEM觀察細(xì)胞在材料表面的形態(tài)變化，并且對(duì)21d內(nèi)細(xì)胞的堿性磷酸酶活性進(jìn)行檢測。結(jié)果：成骨細(xì)胞在材料表面的細(xì)胞增殖數(shù)與對(duì)照組間無顯著性差異，細(xì)胞在材料表面伸展良好，粘附牢固，并具有良好的細(xì)胞形態(tài)及增殖率，堿性磷酸酶活性逐漸增加。結(jié)論：含鑭羥基磷灰石涂層材料具有良好的細(xì)胞相容性。

關(guān)鍵詞鑭；羥基磷灰石類；涂層；成骨細(xì)胞；堿性磷酸酶

鈦合金表面的生物陶瓷涂層以其優(yōu)良的生物學(xué)性能已作為種植體材料廣泛應(yīng)用于臨床，目前常用的涂層材料為羥基磷灰石（HA），但已有文獻(xiàn)報(bào)道由于涂層工藝及HA穩(wěn)定性的問題，使HA涂層在體內(nèi)迅速溶解而導(dǎo)致種植體的失敗〔1,2〕。本研究在HA中添加了稀土元素鑭，使其晶體更加穩(wěn)定〔3〕，同時(shí)采用新的涂層工藝，使其在鈦合金表面形成穩(wěn)定和牢固的涂層。在對(duì)該涂層材料的細(xì)胞毒性進(jìn)行研究的基礎(chǔ)上〔4〕，為進(jìn)一步觀察用含鑭羥基磷灰石涂層后材料的細(xì)胞相容性，本實(shí)驗(yàn)在體外研究了該涂層材料與成骨細(xì)胞間的相互作用，為進(jìn)一步的體內(nèi)研究提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1含鑭羥基磷灰石涂層材料的制備

在直徑為10mm，厚1.5mm的鈦表面制備含鑭羥基磷灰石涂層材料La-HA（西安交通大學(xué)金屬材料強(qiáng)度實(shí)驗(yàn)室提供），將涂層圓片用體積分?jǐn)?shù)(φ)為75%乙醇超聲振蕩清洗后，再用三蒸水超聲振蕩清洗3遍，烘干，60Co輻射滅菌后備用。

1.2成骨細(xì)胞的培養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的成骨細(xì)胞來自大鼠顱蓋骨，其培養(yǎng)方法見文獻(xiàn)〔4〕。

1.3細(xì)胞在材料表面附著、增殖

將La-HA涂層圓片放入24孔板內(nèi)，加入1ml的DMEM培養(yǎng)液浸泡24h后，將細(xì)胞接種于材料表面，濃度為5×107/L。無涂層圓片的培養(yǎng)板作為對(duì)照組（Con）；37℃，φ(CO2)=5%的條件下用礦化液（含10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉、50mg/L維生素C的DMEM培養(yǎng)液）培養(yǎng)21d，細(xì)胞分別在接種后第1、7、14和21天用0.25g/L胰酶0.3ml消化15min,再加0.7ml的DMEM終止消化，充分吹打后，收集消化液。定量后在倒置顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，每組重復(fù)3次，取平均值。

1.4細(xì)胞在材料表面的堿性磷酸酶活性

將上述實(shí)驗(yàn)中各時(shí)間段的細(xì)胞懸液離心、棄上清，加入體積分?jǐn)?shù)為0.3%Triton-X100100μl，4℃過夜，將其移入96孔板內(nèi)，再加入100μl堿性磷酸酶底物液，37℃孵育40min，加入50μl的1mol/LNaOH終止反應(yīng)，在酶聯(lián)免疫儀上用410nm波長測吸光度（A），統(tǒng)計(jì)分析。

1.5細(xì)胞在材料表面的形態(tài)學(xué)觀察

將培養(yǎng)至第1、7、14、21天的涂層圓片分別取出，用0.01mol/L的PBS（pH7.4）洗3遍，體積分?jǐn)?shù)為0.3%戊二醛固定，乙腈梯度脫水，臨界點(diǎn)干燥，噴金，掃描電鏡觀察。

2結(jié)果

2.1細(xì)胞在材料表面的附著與增殖

圖1顯示出第1、7、14、21天成骨細(xì)胞在材料表面附著及增殖的數(shù)量統(tǒng)計(jì)?？梢钥闯龀晒羌?xì)胞在材料表面附著及增殖情況良好。第21天細(xì)胞增殖的數(shù)量幾乎是第1天細(xì)胞附著數(shù)量的6倍。各時(shí)間段材料表面的細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組之間無顯著差異（P≥0.05）。

2.2細(xì)胞在材料表面的堿性磷酸酶活性

通過測量成骨細(xì)胞分泌的堿性磷酸酶活性的相對(duì)強(qiáng)弱來表示成骨細(xì)胞在材料表面的功能。從第7、14、21天測試的堿性磷酸酶的吸光度（A）（圖2）可以看出隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加堿性磷酸酶的活性逐漸增強(qiáng)，各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組之間無顯著差異（P≥0.05）。

圖1成骨細(xì)胞在材料表面附著及增殖數(shù)

圖2成骨細(xì)胞在材料表面的堿性磷酸酶活性

2.3成骨細(xì)胞在材料表面形態(tài)學(xué)觀察

圖3顯示掃描電鏡下第1、7、14、21天成骨細(xì)胞在材料表面的形態(tài)。細(xì)胞接種在材料表面的第1天（圖3a）伸展良好，多個(gè)細(xì)胞突起牢固附著在材料表面。培養(yǎng)至第7天（圖3b）細(xì)胞突起伸展到材料表面的顆粒間，胞漿伸展并包裹材料表面的顆粒，在細(xì)胞表面也有磷酸鈣顆粒形成。第14天（圖3c）細(xì)胞分泌基質(zhì)并連接成網(wǎng)狀，牢固附著在材料表面及顆粒間。第21天（圖3d）細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)更加豐富，貫穿于材料的顆粒間，材料表面也有再結(jié)晶形成。

圖3掃描電鏡下成骨細(xì)胞在材料表面的形態(tài)學(xué)觀察

3討論

含鑭的羥基磷灰石是本實(shí)驗(yàn)室新研究合成的鈣磷陶瓷材料。在對(duì)其理化性能及細(xì)胞毒性進(jìn)行研究的基礎(chǔ)上，將其作為涂層材料進(jìn)行應(yīng)用基礎(chǔ)研究，對(duì)發(fā)展和完善種植材料具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)研究將成骨細(xì)胞接種在材料表面，使植入材料與骨組織的主要功能細(xì)胞--成骨細(xì)胞相接觸，不僅可以考察材料對(duì)細(xì)胞的影響，而且有助于考察材料與細(xì)胞間的相互作用，從更深層次探討材料-細(xì)胞界面結(jié)合機(jī)制，使其結(jié)果與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)更加吻合。

細(xì)胞在材料表面的附著是成骨細(xì)胞在材料表面發(fā)揮功能的前提。體外觀察成骨細(xì)胞與材料間的反應(yīng)是有益的，因?yàn)轶w外實(shí)驗(yàn)研究可以較容易觀察材料對(duì)細(xì)胞附著生長的影響，而不易受到其他系統(tǒng)因素的影響〔5，6〕。本實(shí)驗(yàn)研究即采用體外實(shí)驗(yàn)研究的方法，觀察到成骨細(xì)胞可以在含鑭羥基磷灰石涂層材料表面附著并增殖良好。掃描電鏡觀察可以看到成骨細(xì)胞在該涂層材料表面伸展良好并牢固附著在材料表面，細(xì)胞突起伸展到材料表面的顆粒間，并且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)并連接成網(wǎng)。同時(shí)在材料表面及細(xì)胞表面有新的鈣磷結(jié)晶形成。這說明成骨細(xì)胞與該涂層材料間具有良好的相容性。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)還對(duì)成骨細(xì)胞在材料表面的功能進(jìn)行了研究。堿性磷酸酶是成骨細(xì)胞分化的主要特征酶之一，以往常用檢測堿性磷酸酶活性來鑒別成骨細(xì)胞〔7〕，觀察成骨細(xì)胞的功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明隨著細(xì)胞的增殖，堿性磷酸酶的活性逐漸增強(qiáng)，說明成骨細(xì)胞在該涂層材料表面能發(fā)揮良好的功能。通過以上實(shí)驗(yàn)研究可以初步認(rèn)為含鑭羥基磷灰石作為涂層材料具有良好的細(xì)胞相容性。進(jìn)一步的工作需結(jié)合體內(nèi)種植實(shí)驗(yàn)觀察來綜合評(píng)價(jià)該涂層材料的應(yīng)用前景?！?/p>

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目：59872026

作者單位：張玉梅（西安交通大學(xué)金屬材料強(qiáng)度國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室710049）

傅濤（西安交通大學(xué)金屬材料強(qiáng)度國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室710049）

徐可為（西安交通大學(xué)金屬材料強(qiáng)度國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室710049）

王勤濤（第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院）

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［3］張玉梅，傅濤，徐可為.含鑭羥基磷灰石的合成及性能研究.牙體牙髓牙周病學(xué)雜志，2000,10(3):149

［4］張玉梅，傅濤，徐可為.含鑭羥基磷灰石的細(xì)胞毒性研究.牙體牙髓牙周病學(xué)雜志,2000,10(3):152

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