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摘要：疼痛是醫(yī)學界的一個重要課題，許多疾病和創(chuàng)傷都伴隨有疼痛存在。特別是晚期癌痛和慢性頑固性疼痛，醫(yī)藥論文不僅給患者帶來軀體和精神上的痛苦，也給家庭和社會帶來沉重的負擔。有效的止痛治療，尤其是對于晚期癌癥和慢性頑固性疼痛病人的治療，已經(jīng)成為目前迫切需要解決的問題。對于晚期癌痛患者，靜脈或口服阿片類藥物是唯一能夠部分緩解疼痛的方法，但是這樣又帶來了諸多的副作用，如起過度鎮(zhèn)靜、呼吸抑制、便秘以及成癮等。

關鍵詞：慢性疼痛基因治療定義

病人自控鎮(zhèn)痛(PCA)技術(shù)的出現(xiàn)，給癌痛患者帶來了福音，但是它同樣存在著難以長期維持、增加感染機會、費用較高等問題。尋找更方便、有效、作用持久且經(jīng)濟、安全的鎮(zhèn)痛方法，成為人們關注的課題。克隆細胞移植川和異種組織細胞移植的出現(xiàn)，為慢性疼痛的治療開辟了一條新的途徑。近年來，又提出了用基因治療的方法來處理慢性疼痛問題的新思路工，并且已有許多科學家開始對這方面進行了深人細致的研究。

一、基因治療的基本概念

美國FDA(美國食品和藥物管理局)在1993年給人類基因治療下的定義為：“通過對活細胞遺傳物質(zhì)的改變而進行的醫(yī)學治療。這種改變可在活體外進行，然后應用于人體，或者直接在人體內(nèi)進行”。從該定義可知，存在兩種基因治療方式：即間接體內(nèi)法(exvivo)和體內(nèi)法(invivo)。前者是通過選擇適當?shù)陌屑毎隗w外進行基因轉(zhuǎn)移，篩選可表達外源基因的細胞，再將這些細胞轉(zhuǎn)移至體內(nèi)。這是基因治療前期最常用的方法，其優(yōu)點在于將細胞移植回體內(nèi)前，可以對細胞進行檢查和優(yōu)化。但該方法僅局限于可移植細胞，如淋巴細胞和骨髓細胞等，同時仍需對可能發(fā)生的免疫反應進行檢查。該方法的另一缺陷是細胞移植回體內(nèi)后其基因表達關閉，必須開發(fā)和尋找合適的啟動子。另外該法還面臨著如何長期保持移植細胞功效的問題。體內(nèi)法則是直接在體內(nèi)改變與修復遺傳物質(zhì)。目前對其研究日益增多，可能將成為基因治療最有前途的方法。基因治療中要將某一目的基因轉(zhuǎn)移到靶細胞，就必須通過一定的載體。

基因治療載體可分為病毒型和非病毒型兩類。病毒型載體包括：逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關病毒和疤疹病毒。目前最有效的方法是使用經(jīng)過改造的、具有穿膜特性的病毒作為載體，定向地將目的基因?qū)爰毎Ｈ欢捎谌梭w自身具有抗病毒的免疫系統(tǒng)，使用病毒載體作為媒介來傳遞DNA時就不得不面對宿主的免疫反應。非病毒型載體包括：脂質(zhì)體、裸露DNA和DNA包裝顆粒，范圍從裸DNA顯微注射、電激法、基因槍技術(shù)等各類物理學方法到聚陽離子賴氨酸或陽離子脂質(zhì)體。

二、慢性疼痛基因治療的原理

最近關于疼痛方面的研究絕大部分都已深入到基因、細胞和分子生物學的水平。正是基于對慢性疼痛產(chǎn)生的分子生物學機理有了更加深入的了解，才使得人們有可能在基因水平上探討對慢性疼痛的治療。

1.慢性疼痛的痛覺過敏現(xiàn)象(HyPeralgesia)

對于慢性疼痛，人們已逐漸認識到其主要是由于炎癥或神經(jīng)損傷所導致的痛覺神經(jīng)細胞高反應性的一種表現(xiàn)，與急性疼痛是完全不同的。外周傷害性刺激或組織損傷引起初級傳人神經(jīng)末梢釋放興奮性的氨基酸(EAA，)和其他一些神經(jīng)遞質(zhì)到脊髓后角。這些興奮性氨基酸(EAA)如N一甲基一D一天冬氨酸(NMDA)可以通過其受體而介導脊髓后角及其他神經(jīng)中樞部位的突觸后興奮性傳遞。Yu和saher[61發(fā)現(xiàn)NMDA受體_L調(diào)可以引起細胞內(nèi)鈉離子濃度升高，導致突觸間興奮性傳遞增強，從而產(chǎn)生痛覺中樞敏感性增高。因此，通過阻斷NMDA受體而抑制NMDA的神經(jīng)興奮性遞質(zhì)作用，可以阻斷痛覺的中樞興奮性傳導，治療慢性疼痛。但是，目前的NMDA受體阻斷劑如MK一801和APV，都有很強的毒副作用，不能在臨床上使用。所以Garry等川提出可以利用基因技術(shù)干擾NMDA受體基因的表達來治療神經(jīng)性疼痛。Finegokl等〔8〕發(fā)現(xiàn)將一種編碼NMDA受體亞單位的非敏感性基因片段(As一NMDA一Rl)加人到可以正常表達NMDA受體的基因中時，NMDA受體的表達就受到影響。因此，F(xiàn)inegold利用病毒載體轉(zhuǎn)染技術(shù)，將攜帶有AS一NMDA一Rl基因片段的腺病毒直接注人鼠的脊髓實質(zhì)內(nèi)，發(fā)現(xiàn)運動神經(jīng)元的NMDA受體表達缺失。

另外EAA還可以導致脊髓后角的神經(jīng)元中即刻早期基因(immediateearlygenes，IEGs)的表達〔9〕，這一過程可通過細胞內(nèi)信使包括CaZ+和多種蛋白激酶等激活。目前發(fā)現(xiàn)的即刻早期基因如c-fos，jun基因等在脊髓后角神經(jīng)元中表達時具有時間依從性。這些基因的蛋白表達產(chǎn)物作為轉(zhuǎn)錄因子，可以介導中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)元的細胞結(jié)構(gòu)重塑[9]。zimmerman。等發(fā)現(xiàn)慢性疼痛過程中痛覺感受神經(jīng)元細胞結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，與痛覺過敏現(xiàn)象有關[’o三。在另外一項研究中，waxman等t川認為神經(jīng)損傷后，DRG內(nèi)神經(jīng)元興奮性異常升高，從而產(chǎn)生自發(fā)性動作電位或其他異常高頻電活動，這與慢性疼痛有關。DRG內(nèi)神經(jīng)元自發(fā)性動作電位的產(chǎn)生依賴于電壓一門控鈉通道。DRG神經(jīng)元可以表達六種鈉通道，并且有些只表達于感覺神經(jīng)元上。外周神經(jīng)損傷后，表現(xiàn)為DRG神經(jīng)元上一些鈉通道上調(diào)，而另一些鈉通道下調(diào)，從而導致DRG神經(jīng)元興奮性異常升高。Waxman認為如果能夠控制這些神經(jīng)元上的Na+通道的異常表達，就可以為慢性疼痛治療提供新的有效方法。

2.慢性疼痛的中樞

調(diào)控疼痛是一個很復雜的生理過程，機體內(nèi)許多生化物質(zhì)包括無機離子，多種神經(jīng)遞質(zhì)，神經(jīng)膚還有多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的受體都參與疼痛的產(chǎn)生、調(diào)節(jié)及整合過程。閘門控制學說曾是最經(jīng)典的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疼痛調(diào)控機制理論。而且我們已知中樞神經(jīng)系統(tǒng)的內(nèi)源性嗎啡樣物質(zhì)(MLF)如壓內(nèi)啡膚、強啡膚、腦啡膚、內(nèi)嗎啡膚等是控制痛傳導的重要物質(zhì)，在傷害性刺激時體內(nèi)含量增高，特別是快痛型刺激尤為顯著。這些內(nèi)源性嗎啡樣物質(zhì)在中樞系統(tǒng)內(nèi)通過阿片受體而起作用，它們可以在脊髓后角以突觸前方式抑制傷害性沖動物質(zhì)神經(jīng)元)的傳導。但是在慢性疼痛中，中樞的調(diào)控機制發(fā)生了改變。在動物模型中，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)慢性疼痛可以伴隨有脊髓的初級痛覺傳人神經(jīng)元中內(nèi)源性阿片類物質(zhì)減少。不僅如此，zhang等還發(fā)現(xiàn)在外周神經(jīng)損傷后造成的慢性疼痛動物鼠和猴模型中，脊髓后根神經(jīng)節(jié)(dorsalrootganglia，DRG)以及脊髓后角中阿片類受體琳受體免疫陽性的神經(jīng)元的數(shù)量及密度都大大降低，并且在猴的模型中這種狀態(tài)持續(xù)的時間要明顯長于鼠的模型。利用基因技術(shù)，調(diào)控神經(jīng)中樞內(nèi)源性嗎啡類鎮(zhèn)痛物質(zhì)的表達合成，是慢性疼痛基因治療的最主要的手段。Pohl和Braz就提到在利用基因技術(shù)治療疼痛的研究中，人們最初的目標就是將阿片類物質(zhì)前體基因轉(zhuǎn)人疼痛病人體內(nèi)，使它們在脊髓水平過量的表達，從而產(chǎn)生持久的鎮(zhèn)痛效果。并且在動物實驗研究中，這種基因治療手段的鎮(zhèn)痛效果已經(jīng)得到證實。除了利用內(nèi)源性阿片類物質(zhì)作為治療慢性疼痛的基因調(diào)控物質(zhì)之外，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)還有許多參與疼痛發(fā)生的神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)質(zhì)可被用于基因調(diào)控。丫一氨基丁酸(GABA)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的一種抑制性遞質(zhì)，在動物實驗模型中有改善傷害性刺激所致的疼痛反應的作用。在慢性疼痛的治療中可以通過調(diào)控GABA的表達來改善疼痛。GABA是由谷氨酸在谷氨酸脫梭酶(GAD)的作用下生成的。New等通過基因技術(shù)，將攜帶有谷氨酸脫竣酶cD-NA的單純疤疹病毒(HSV)轉(zhuǎn)染神經(jīng)中樞細胞，結(jié)果神經(jīng)中樞細胞表達GAD增多，從而使GABA合成增多〔”〕。Eato。等則采用基因治療的間接體內(nèi)技術(shù)，首先在體外將谷氨酸脫梭酶cDNA導人中樞神經(jīng)細胞，再將這些細胞移植到體內(nèi)，使GABA產(chǎn)生增多從而達到鎮(zhèn)痛的目的。

3.慢性疼痛基因治療的方法

經(jīng)典的基因治療一般都要包含以下幾個內(nèi)容：目的基因的選擇;目的基因的克隆、測序;目的基因轉(zhuǎn)移傳遞系統(tǒng)的選擇;靶組織的選擇;目的基因的表達調(diào)控;療效及安全性評價。目前慢性疼痛基因治療的研究才剛剛起步，各種基因治療方法還處于探索階段，一切都還不成熟。因此當前關于慢性疼痛基因治療的研究的重點還只是集中在目的基因的選擇、傳遞以及靶組織的選擇三方面。我們將分為三部分加以討論。

(1)目的基因的選擇

正如上文中所提到的，慢性疼痛基因治療的原理主要是抑制中樞的痛覺高敏性和調(diào)整中樞的痛覺調(diào)控分子機制。因此，就目前而言，研究較多的治療慢性疼痛的目的基因，其表達產(chǎn)物主要集中在阿片類物質(zhì)、抑制性氨基酸遞質(zhì)GABA以及興奮性氨基酸NMDA。阿片類物質(zhì)是中樞內(nèi)最主要的內(nèi)源性鎮(zhèn)痛物質(zhì)，因此利用基因技術(shù)增加其內(nèi)部的表達成為人們基因治療慢性疼痛的首先考慮到的方法。p一內(nèi)啡膚(p一endo甲hin)[”」及腦啡膚(。nkephali。)前體基因是經(jīng)常被用到的目的基因。GABA屬于氨基酸類，它是由谷氨酸脫梭酶(GAD)作用于底物谷氨酸而合成的，其本身不是基因編碼的產(chǎn)物。但是GAD屬于蛋白質(zhì)類，它是由基因編碼誘導產(chǎn)生的。因此研究中將谷氨酸脫梭酶CDNA作為目的基因?qū)思毎麅?nèi)。NMDA為興奮性氨基酸，它可以增加神經(jīng)中樞細胞的痛覺敏感性。與前兩種物質(zhì)要求過量產(chǎn)生不同的是，慢性疼痛治療中要求減少NMDA的產(chǎn)生或減弱其作用。在基因治療中通過基因調(diào)控，使其受體不表達而達到基因治療的目的。所以慢性疼痛基因治療中，選擇的目的基因可以直接表達膚類鎮(zhèn)痛物質(zhì)，可以編碼某種酶，還可以編碼某種受體。

(2)載體的選擇

將病毒作為傳遞目的基因的載體，是目前研究中應用最多的。單純疤疹病毒(HSV)和腺病毒是目前慢性疼痛基因治療中最常應用的病毒載體。HSV是一種親神經(jīng)性的DNA病毒，所以用它來將目的基因轉(zhuǎn)染給神經(jīng)細胞是最合適的。而且它的病毒基因組很大(巧Zkl))，包含70一80個基因。野生型病毒既可以感染細胞并裂解之，也可以在某些細胞類型如神經(jīng)元中進入潛伏期。它不整合到宿主染色體上，但可在神經(jīng)細胞核內(nèi)持續(xù)存在。早期基因ICP4基因突變后，病毒就喪失了自主復制能力，只能在輔助細胞的幫助下進行增殖，這就是最初的HSV載體。HSV載體的一大優(yōu)點就是載體容量很大，為各種病毒載體之最，可容納高達50kb的外源DNA，因此可以同時裝載多個目的基因。腺病毒(Ad)是一種線性雙鏈DNA病毒，基因組長約30-SOKb，由非結(jié)構(gòu)性早期基因(E1一E4)、編碼結(jié)構(gòu)蛋白的晚期基因和RNA聚合酶111轉(zhuǎn)錄子組成。去除El后就成為第一代Ad載體。它不能自主復制，只有在能反式提供El基因的包裝細胞如293細胞的幫助下，才能進行繁殖。目的基因插人到El基因的位置上，其轉(zhuǎn)錄可受El啟動子或外源啟動子控制。在慢性疼痛的基因治療中，Li等還發(fā)現(xiàn)用電造孔法可將外源性基因直接轉(zhuǎn)移到脊髓神經(jīng)細胞中去。電造孔基因轉(zhuǎn)移法是應用電場在細胞質(zhì)膜內(nèi)引起可逆性造孔，外源性基因即可由此引人。Li是通過直接向鼠的蛛網(wǎng)膜鞘內(nèi)注人pE一GFPCI載體，同時鞘內(nèi)施加以20OV的五個電脈沖持續(xù)50ms的時間。結(jié)果在1天、3天或7天后，在脊髓組織內(nèi)可以檢測到有外源性基因GFP，而GFP蛋白的表達在3到7天內(nèi)達到高峰，14天后明顯下降。并且未發(fā)現(xiàn)脊髓神經(jīng)損傷和動物行為的改變。

(3)靶組織的選擇

目前慢性疼痛基因治療的靶組織主要集中在中樞神經(jīng)系統(tǒng)：腦和脊髓。一種方法是將載體直接注人腦和脊髓的實質(zhì)內(nèi)，讓載體轉(zhuǎn)染神經(jīng)細胞，但是這樣實質(zhì)表達的外源性基因產(chǎn)物的分布就很局限且不均勻，不能達到良好的基因治療的目的。還有一種方法是將載體直接注人到神經(jīng)中樞周圍的鞘內(nèi)，通過轉(zhuǎn)染非神經(jīng)細胞如鞘膜細胞而發(fā)揮外源基因表達的作用。比如Finegold等仁將攜帶有p一內(nèi)啡肚的腺病毒載體分別注人側(cè)腦室和脊髓鞘內(nèi)，結(jié)果腦脊液中p一內(nèi)啡膚的含量增加，可以明顯加強中樞鎮(zhèn)痛作用。

4.慢性疼痛基因治療的缺陷

慢性疼痛的基因治療是近幾年才提出的概念，現(xiàn)在還處于實驗室研究的階段。因為基因治療這一新的治療手段本身存在的技術(shù)缺陷，比如缺少高效的基因傳遞系統(tǒng)、缺少持續(xù)穩(wěn)定的表達和寄生產(chǎn)生免疫反應，特別是目的基因體內(nèi)表達的調(diào)控這一關鍵問題未能很好解決。早期基因治療的疾病主要選擇如肺囊性纖維化、ADA一SCID等遺傳缺陷性疾病，治療基因?qū)梭w內(nèi)后即使不進行精確的調(diào)控也可獲得較好療效。而在慢性疼痛的治療中，目的基因表達的組織、時序和水平等都需要嚴格加以控制，這是慢性疼痛基因治療進人臨床前必須解決的問題。具體來講就是要從目的基因的靶向性、可誘導性以及安全性三方面加強攻關，從技術(shù)上滿足治療的要求。另外一方面，慢性疼痛的發(fā)病機理的研究也處于一種不斷在加以完善的狀況。因此就決定了目前慢性疼痛基因治療的目的基因的范圍選擇還主要是局限于阿片類物質(zhì)前體，方法比較單一，不能滿足臨床各種疼痛治療的要求。

5.慢性疼痛基因治療的展望

基因治療由Anderson在20世紀80年代初首先提出，1990年在美國成功進行了ADA(腺昔脫氨酶)缺陷患兒的人體基因治療。以后基因治療從遺傳性疾病擴展到腫瘤、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)性疾病、傳染病，包括AIDS病等領域。慢性疼痛由于本身涉及到很復雜的中樞調(diào)控機理及中樞神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)重塑，在各種普通治療手段及普通藥物對頑固性疼痛越來越束手無策時，要從根本上解決慢性疼痛問題，基因治療手段有著廣闊的應用前景。

隨著人們從細胞凋亡、細胞周期、細胞信號轉(zhuǎn)導和反義核酸等角度對基因治療研究的深人，以及逐步建立起安全有效的基因調(diào)控體系后，基因治療將可能成為處理慢性疼痛的一種更為有效和安全的治療手段。