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摘要目的：探討雷公藤紅素對(duì)HMC-1細(xì)胞表達(dá)Fas、Fas-L的影響及與凋亡的關(guān)系。方法：用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡和Fas、Fas-L的表達(dá)。結(jié)果：HMC-1細(xì)胞能自發(fā)表達(dá)Fas，不表達(dá)Fas-L。經(jīng)雷公藤紅素作用，F(xiàn)as呈先升后降的變化，F(xiàn)as-L低水平表達(dá)。Fas陽(yáng)性率下降與凋亡率增加相關(guān)。結(jié)論：Fas可能是雷公藤紅素誘導(dǎo)HMC-1細(xì)胞凋亡的途徑之一。

關(guān)鍵詞雷公藤紅素HMC-1細(xì)胞FasFas-L凋亡

FasmaybeoneofthemoleculeswhichmediatesHMC-1cellapoptosisinducedbytripterine

BAOYi-Xiao,ZHANGLing-Zhen,LILietal.

ClinicalImmunologyCenterofPLA,ChangzhengHospital,theSecondMilitaryMedicalUniversity,

Shanghai200003

AbstractObjective:ThispaperreportstheeffectoftripterineontheexpressionFasandFas-LinHMC-1cellsandtherelationtoapoptosis.Methods:TheexpressionofFas/Fas-Landapoptosiswereassayedbyflowcytometry.Results:HMC-1cellsconstituantlyexpressFas(22.7%),butnotFas-L.Onexposuretotripterineattheconcentrationof1.0μmol/L,Faspositiverateincreasedto57.5%at2h,thendecreasedto12.5%at4hand2.3%at6h.Fas-Lexpressedatlowerlevel.ThereweresignificantrelationbetweenthedecreaseofFaspositiverateandincreaseapoptosis.Conclusion:FasisoneofthemoleculeswhichmediatesHMC-1cellapoptosisinducedbytripterine.

KeywordsTripterineHMC-1cellFasFas-LApoptosis

雷公藤紅素是雷公藤單體之一，屬三萜類(lèi)色素［1］。它能誘導(dǎo)人肥大細(xì)胞系HMC-1細(xì)胞凋亡［2］，但誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制尚不清楚［3］。Fas抗原（CD95）是一種膜受體，屬TNFR/NGFR家族成員，表達(dá)于多種類(lèi)型的細(xì)胞表面，其配體（Fasligand,Fas-L)主要表達(dá)于活化的淋巴細(xì)胞。Fas與FasL結(jié)合能迅速地啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。本文研究雷公藤紅素誘導(dǎo)HMC-1細(xì)胞凋亡過(guò)程中Fas及Fas-L表達(dá)的變化及與凋亡的關(guān)系，以探討雷公藤紅素誘導(dǎo)HMC-1細(xì)胞凋亡的機(jī)制。

1材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)HMC-1細(xì)胞培養(yǎng)于5％CO2,37℃孵箱中。培養(yǎng)基IMDM(GIBCOBRL)含10%熱滅活小牛血清，0.1U/L青霉素，0.1U/L鏈霉素。培養(yǎng)細(xì)胞密度為0.5×106～1.0×106ml-1,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞待用。

1.2細(xì)胞凋亡的檢測(cè)

1.2.1形態(tài)觀(guān)察HMC-1細(xì)胞呈圓或橢圓形。凋亡時(shí)細(xì)胞膜內(nèi)陷，核濃縮，形成凋亡小體。

1.2.2流式細(xì)胞儀(FCM)DNA含量分析1×106個(gè)細(xì)胞加50μl含0.1%Triton-X100的碘化丙啶(PI)(5μg/ml)染色，避光放置5min,加0.5mlPBS,上流式細(xì)胞儀檢測(cè),Multicycles軟件分析結(jié)果。

1.2.3DNA瓊脂糖電泳1×106細(xì)胞加100μlTBE緩沖液，0.25%NP-40,0.1mg/mlRnase，50℃水浴30min；再加1mg/ml蛋白酶K,50℃水浴30min，即獲得需要的DNA溶液。取30μlDNA溶液于1.8%瓊脂糖凝膠電泳,細(xì)胞凋亡時(shí)可出現(xiàn)梯形條帶。

1.3Fas和Fas-L的測(cè)定0.5×106個(gè)HMC-1細(xì)胞，加鼠抗人anti-Fas或anti-Fas-L單克隆抗體20μl，加同型非特異性IgG為陰性對(duì)照(ImmunoTech公司),4℃共育30min；加FITC-anti-鼠IgM20μl,4℃共育30min。FCM檢測(cè)（COULTE，EPICSXL），計(jì)數(shù)10000個(gè)細(xì)胞。

1.4凋亡細(xì)胞群中Fas的測(cè)定中晚期凋亡細(xì)胞膜透性可以增加，不加Triton-X100的PI可滲入細(xì)胞著色。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行Fas標(biāo)記后，加0.1%PI染色，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行雙標(biāo)記分析。

1.5數(shù)據(jù)處理t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1雷公藤紅素誘導(dǎo)HMC-1細(xì)胞凋亡在雷公藤紅素作用下HMC-1細(xì)胞可出現(xiàn)細(xì)胞皺縮，核濃縮，形成凋亡小體的形態(tài)改變（圖1)。作用24h,DNA瓊脂糖電泳可見(jiàn)梯形條帶(圖2）。

2.2HMC-1細(xì)胞Fas和Fas-L的表達(dá)HMC-1細(xì)胞大小不等，在流式細(xì)胞儀上根據(jù)前向散射程度可將其分為大、中、小三群，三群細(xì)胞分別占37.5％,12.1%,23.7%，三群細(xì)胞Fas的陽(yáng)性率分別為20.0%,37.1%和6.5%；整群細(xì)胞表達(dá)Fas的陽(yáng)性率為22.7％，不表達(dá)Fas-L。

圖1HMC-1細(xì)胞在雷公藤紅素作用下呈凋亡形態(tài)改變(HE染色，×400)

Fig.1Tripterineinducedmorphologicalchangescharacteristicofapoptosis(HEstain,×400)

Note:CondensationofchromatinandapoptoticbodyformationinHMC-1cells

圖2雷公藤紅素作用24hHMC-1細(xì)胞DNA瓊脂糖電泳顯示梯形條帶

Fig.2AgarosegelelectrophoresisofDNAfromHMC-1cellstreatedwithtripterinefor24hours

Note:Marker:657,458,328,289,176bp

2.3雷公藤紅素對(duì)HMC-1細(xì)胞表達(dá)Fas和Fas-L的影響在雷公藤紅素作用下Fas陽(yáng)性率呈先升后降的變化，升高的程度和下降的速率與藥物的劑量相關(guān)（圖3）。Fas-L在1.000μmol/L作用下，0,4,6h分別為0,3.3%,1.8%。0.125,0.250,0.500,1.000μmol/L雷公藤紅素作用4h,Fas-L陽(yáng)性率分別為3.4%,4.0%,5.7%和1.8%。

2.4PI染色陽(yáng)性細(xì)胞群中Fas陽(yáng)性率增高1.000μmol/L雷公藤紅素作用4h，PI染色陽(yáng)性細(xì)胞為21.4%±5.0%（n＝5），PI陽(yáng)性細(xì)胞群中Fas陽(yáng)性率為29.1%±3.9%，PI陰性細(xì)胞群中Fas陽(yáng)性率為5.7%±1.2%，兩者相比有顯著差異，P＜0.01。

2.5Fas陽(yáng)性率與凋亡率變化的關(guān)系HMC-1細(xì)胞與1.000μmol/L雷公藤紅素共育，在0，2，4，8h同時(shí)測(cè)定Fas陽(yáng)性率和細(xì)胞凋亡率，分析兩者的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)Fas陽(yáng)性率自2h開(kāi)始呈下降趨勢(shì)，細(xì)胞凋亡率自2h開(kāi)始呈上升趨勢(shì)。至6h,Fas陽(yáng)性率僅為2.3%，趨于0，細(xì)胞凋亡率繼續(xù)上升，見(jiàn)圖4。

圖3在雷公藤紅素作用下流式細(xì)胞儀測(cè)定HMC-1細(xì)胞Fas陽(yáng)性率的變化

Fig.3FaspositiveratechangesmeasuredonflowcytometryintripterinetreatedHMC-1cellsFig.4Fasandapoptoticpositiveratechangesin1μmol/LtripterinetreatedHMC-1cells

3討論

雷公藤紅素能以時(shí)間和劑量依賴(lài)方式誘導(dǎo)肥大細(xì)胞系HMC-1細(xì)胞凋亡，提示雷公藤紅素抗炎癥［4］、治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎［5］等與肥大細(xì)胞相關(guān)疾病的作用與此有關(guān)。

既往的研究已經(jīng)表明，F(xiàn)as廣泛地表達(dá)于胸腺細(xì)胞，活化T、B淋巴細(xì)胞，NK細(xì)胞，單核細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面，是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，維持細(xì)胞數(shù)量穩(wěn)定的重要分子［6］。本實(shí)驗(yàn)的研究表明HMC-1細(xì)胞也能表達(dá)Fas，提示Fas在介導(dǎo)肥大細(xì)胞凋亡、維持肥大細(xì)胞數(shù)量穩(wěn)定方面發(fā)揮重要的作用。HMC-1細(xì)胞大小不等，可能與其分化階段不同有關(guān)。它們表達(dá)Fas的水平也不相同，提示不同分化階段的細(xì)胞對(duì)凋亡的敏感性不同。

多種因素可影響Fas的表達(dá)，其表達(dá)水平的變化會(huì)影響到細(xì)胞對(duì)凋亡的敏感性。如外周血T細(xì)胞在超抗原作用下高水平地表達(dá)Fas和Fas-L，由此促進(jìn)T細(xì)胞的凋亡［7］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素使HMC-1細(xì)胞表達(dá)Fas增高，同時(shí)誘使Fas-L呈低水平表達(dá)。雷公藤紅素的這一作用可能與其誘導(dǎo)HMC-1細(xì)胞凋亡有關(guān)。因?yàn)镕as的高表達(dá)提高了HMC-1細(xì)胞凋亡的敏感性，尤其在體內(nèi)接觸到Fas-L陽(yáng)性淋巴細(xì)胞即可以引起凋亡；在體外接觸到Fas-L陽(yáng)性的HMC-1細(xì)胞也可引起凋亡。凋亡細(xì)胞群中Fas陽(yáng)性率增高。凋亡率的增加伴隨Fas陽(yáng)性率的下降，二者在啟動(dòng)時(shí)間上一致。這些均支持雷公藤紅素促進(jìn)Fas表達(dá)與其誘導(dǎo)HMC-1細(xì)胞凋亡有關(guān)。

但是，雷公藤紅素誘導(dǎo)HMC-1細(xì)胞凋亡并非均由Fas介導(dǎo)。1.000μmol/L雷公藤紅素作用8h，F(xiàn)as陽(yáng)性細(xì)胞幾乎消失，而凋亡率繼續(xù)升高，48h可達(dá)90％，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于Fas陽(yáng)性細(xì)胞比例，因此雷公藤紅素誘導(dǎo)HMC-1細(xì)胞凋亡還存在其它途徑，F(xiàn)as只是其途徑之一。

Fas可能是雷公藤紅素誘導(dǎo)HMC-1細(xì)胞凋亡的途徑之一國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào)39400123)

作者簡(jiǎn)介：鮑一笑，男，34歲，臨床免疫學(xué)博士，主要研究哮喘的免疫機(jī)理

作者單位：(第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院全軍臨床免疫中心，上海200003)

4參考文獻(xiàn)

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3鮑一笑，孔憲濤，李莉etal.雷公藤紅素誘導(dǎo)HMC-1細(xì)胞凋亡及與細(xì)胞周期的關(guān)系.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志,1998;18(基礎(chǔ)理論研究特集):198

4徐維敏，張羅修，程彰華etal.雷公藤紅素對(duì)IL-1和IL-2活性及PGE2釋放的抑制作用.藥學(xué)學(xué)報(bào),1991;10(9):641

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6KrammerPH,DanielJ,WalaczakHetal.TheroleofAPO-1-mediatedapoptosisinimmunesystem.ImmunolRev，1994;142:175

7RennoT,HahneM,TschoppJetal.PeripheralTcellsundergoingsuperantigen-inducedapoptosisinvivoexpressB220andupregulateFasandFasligand.JExpMed，1996;183(2):431