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引言

HBV感染患者和幾乎全部HCV攜帶者有可能發(fā)展為肝硬化，亦是造成肝硬化發(fā)病率居高不下的主要原因，而肝硬化中約30%患者可并發(fā)肝癌［1］.AFP升高、肝硬化伴細(xì)胞不典型增生或細(xì)胞增殖活性增高成為肝癌發(fā)病的高危因素［2］，因而慢性肝病、肝硬化的防治十分重要論文.如何延緩肝纖維化形成進(jìn)程或逆轉(zhuǎn)至正常，已成為肝硬化及肝癌防治的中心問(wèn)題.因此，研制有效且可長(zhǎng)期服用的預(yù)防制劑也越來(lái)越引起人們的關(guān)注.健脾扶正法是中醫(yī)臨床防治肝硬化與肝癌常用的方法之一［3］.本科室根據(jù)中醫(yī)基礎(chǔ)理論及臨床實(shí)踐研制的以健脾益氣立法，由淮山藥、山楂、大棗等藥食同源中藥組成的肝復(fù)健沖劑，在臨床肝硬化防治過(guò)程中取得較好療效.

1材料和方法

1.1材料SD雄性大鼠，體質(zhì)量150~180g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供.二乙基亞硝胺(DEN)購(gòu)自Sigma公司.天狼紅（解放軍第475醫(yī)院贈(zèng)送）.PCNA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自DAKO公司.中藥飼料：肝復(fù)健沖劑按30.4g・kg-1均勻混合于基礎(chǔ)飼料中壓制而成（第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）.

1.2方法

1.2.1模型建立大鼠適應(yīng)環(huán)境3d隨機(jī)分為模型組（Model）及中藥組(Ganfujian，GFJ)，每組各30只，分別以0.1g・L-1DEN自由飲水，同時(shí)分別給予基礎(chǔ)飼料或含中藥的飼料喂養(yǎng).16wk時(shí)停用DEN飲水及中藥飼料.考慮到造模過(guò)程大鼠有一定死亡率，分別于建模開始后每4wk兩組各處死5只大鼠，剩余大鼠留繼續(xù)觀察.取肝組織固定于100g・L-1甲醛溶液，石蠟包埋，切片厚4μm.常規(guī)HE染色、切片膠原特殊染色及免疫組化染色.

1.2.2切片膠原染色按天狼紅飽和苦味酸法［4］.普通石蠟切片,厚4μm;常規(guī)脫蠟至水,0.1mol・L-1天狼紅飽和苦味酸,避光室溫孵育20min;不洗,950mL・L-1乙醇脫水,二甲苯透明,封片.

1.2.3PCNA免疫組織化學(xué)染色取材肝組織固定于100mL・L-1緩沖甲醛溶液24h，常規(guī)石蠟包埋，切4μm厚切片，二甲苯、梯度乙醇脫蠟至水；染色方法為免疫ABC法.以0.1mol・L-1PBS取代一抗作陰性對(duì)照，以正常大鼠肝組織作正常對(duì)照.

1.2.4染色結(jié)果判定及計(jì)算機(jī)圖像分析肝臟背景為淡黃色，膠原陽(yáng)性著色呈紅色,采用HPIAS1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng),隨機(jī)選擇5個(gè)匯管區(qū)進(jìn)行染色膠原的定量分析(面積占視野面積),取其均值.PCNA陽(yáng)性著色為覆蓋胞核的棕黃色顆粒.用網(wǎng)格（10×10）測(cè)試法計(jì)數(shù)陽(yáng)性肝細(xì)胞.切片各選擇10個(gè)按同一方向移行、不重疊的高倍鏡視野（×40），記數(shù)陽(yáng)性及陰性細(xì)胞數(shù)（100個(gè)細(xì)胞）.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)所獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行組間秩和檢驗(yàn).

2結(jié)果

2.1大鼠肝纖維化過(guò)程組織形態(tài)學(xué)變化模型組大鼠使用DEN4~8wk時(shí)肝表面由平滑逐漸變?yōu)榇植?，可見小顆粒，呈局灶性.光鏡下肝細(xì)胞腫脹，空泡變性，局灶性壞死，伴炎細(xì)胞浸潤(rùn)，并逐漸出現(xiàn)纖維組織增生.12wk時(shí)40%大鼠已出現(xiàn)明顯肝硬化，肝表面更加粗糙，肝臟增大、腫脹，色暗或淡.16wk時(shí)大鼠均有肝硬化表現(xiàn)，結(jié)節(jié)增多變大，肝臟縮小，組織學(xué)有大量形態(tài)不一，大小排列不齊的假小葉形成.部分大鼠肝臟已出現(xiàn)早期癌結(jié)節(jié)，鏡下可見少量癌細(xì)胞增生.中藥組大鼠各時(shí)期肝臟損害均較單純誘導(dǎo)組輕，12wk無(wú)肝硬化大鼠，16wk50%大鼠出現(xiàn)肝硬化，但未發(fā)現(xiàn)癌變.

2.2大鼠肝纖維化過(guò)程肝內(nèi)膠原沉積變化模型組大鼠4wk肝內(nèi)即出現(xiàn)少量紅色膠原陽(yáng)性染色，多集中于匯管區(qū).隨著肝內(nèi)病變加重，假小葉的形成，肝臟沉積的膠原逐漸增多，16wk病變以結(jié)節(jié)性肝硬化為主，切片膠原沉積量亦達(dá)到頂峰.中藥組大鼠肝內(nèi)病變較模型組明顯減輕，肝硬化發(fā)生晚，肝內(nèi)膠原沉積量少，在4wk及12wk兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,Tab1).

表1兩組大鼠肝臟膠原沉積的比較(略)

2.3大鼠肝纖維化過(guò)程肝細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)PCNA情況在模型初期即可見少量肝細(xì)胞PCNA陽(yáng)性著色，隨著模型進(jìn)展，大鼠肝臟PCNA陽(yáng)性表達(dá)的肝細(xì)胞數(shù)目逐漸增加，并在12～16wk呈明顯攀升趨勢(shì).中藥組大鼠PCNA陽(yáng)性的肝細(xì)胞數(shù)在各期均低于模型組，其中12～16wk差異顯著(P<0.05,Tab2).

表2大鼠肝細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)PCNA的比較(略)

3討論

肝纖維化是許多慢性肝病重要的中間環(huán)節(jié)，是由于肝內(nèi)纖維生成與降解失衡，致使過(guò)多的膠原在肝內(nèi)沉積，常伴于炎癥并可發(fā)展為肝硬化.肝纖維化形成作為肝硬化發(fā)展過(guò)程中的一個(gè)重要現(xiàn)象，與肝硬變的發(fā)展是平行的［5］,因此肝纖維化程度的精確了解是慢性肝病研究不可少的.然而常用的血清學(xué)指標(biāo)和組織學(xué)纖維化分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)卻難以直接、準(zhǔn)確反映肝臟內(nèi)

膠原沉積變化.本文采用切片膠原圖像定量處理方法具有準(zhǔn)確、客觀、數(shù)據(jù)可信度高等特點(diǎn)，能精確反映肝內(nèi)膠原沉積（主要為I,III型膠原）變化［4］.本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用該法檢測(cè)DEN誘導(dǎo)大鼠肝纖維化過(guò)程中肝內(nèi)膠原沉積的變化，結(jié)果顯示隨著肝細(xì)胞變性、炎癥高峰到橋接性壞死、肝硬化形成，肝臟形態(tài)學(xué)改變與膠原沉積呈同步變化.

細(xì)胞的異常增殖是癌變發(fā)生的主要特征.PCNA是一種從細(xì)胞核中分離純化出來(lái)的多肽鏈，直接參與細(xì)胞增殖過(guò)程中的DNA復(fù)制，其含量和陽(yáng)性表達(dá)是反應(yīng)G1晚期和S早期肝細(xì)胞增殖的常用指標(biāo)［6-8］.在本模型中初期即出現(xiàn)少量肝細(xì)胞PCNA陽(yáng)性著色，而隨著模型進(jìn)展，尤其在12~16wk（肝硬化期）PCNA陽(yáng)性肝細(xì)胞數(shù)明顯增加，與肝內(nèi)病變進(jìn)展呈一致變化.即隨著肝硬化的形成，異常增殖肝細(xì)胞數(shù)目呈明顯增加趨勢(shì)，提示從肝臟炎性改變、肝纖維化至肝硬化的形成，異常增殖的肝細(xì)胞數(shù)目不斷增加，癌變的可能性亦逐漸增加.

近年來(lái)中醫(yī)藥防治肝纖維化取得了不少進(jìn)展，也積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，從單味藥、復(fù)方及其有效成份等入手，初步發(fā)現(xiàn)活血化瘀與扶正補(bǔ)虛兩類中藥具有良好的防治肝纖維化作用.由于采用中草藥治療慢性肝病在臨床上有肯定療效，且又具有無(wú)明顯毒性反應(yīng)或副作用的優(yōu)點(diǎn)，因此，是防治肝纖維化較有希望的治療手段，已引起國(guó)內(nèi)外肝病研究人員的極大興趣［9］.健脾扶正法是防治肝硬化與肝癌最常用的方法之一，曾證明對(duì)肝硬化和DEN致大鼠肝癌前病變的發(fā)生可能有一定的預(yù)防作用［10-12］.肝復(fù)健沖劑以健脾益氣立法，組方均為藥食同源中藥，具有低毒、可長(zhǎng)期服用的特點(diǎn).本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該沖劑可明顯減少肝內(nèi)膠原沉積，延緩化學(xué)致癌物DEN所致大鼠肝纖維化過(guò)程，同時(shí)對(duì)肝硬化形成期陽(yáng)性表達(dá)PCNA的肝細(xì)胞數(shù)目亦有顯著抑制作用.提示該沖劑可通過(guò)減輕化學(xué)物質(zhì)引起的肝內(nèi)炎性病變，減少肝內(nèi)以I、III型為主的膠原沉積，延緩和減輕肝纖維化過(guò)程，同時(shí)可抑制肝硬化形成及演變期肝細(xì)胞可能的惡性增殖，達(dá)到阻抑肝硬化形成及其繼續(xù)發(fā)展為肝癌的作用.

【參考文獻(xiàn)】

［1］WangJ,WangN.Hepaticfibrosisandmedicaltreatment［J］.GuowaiYixueWaikeFence(ForeMedSci),2001;28(1):27-29.

［2］WangQH,LiuXF.Studyonmonitoringofhighriskpopulationsoflivercancer［J］.GuowaiYixueZhongliuFence(ForeMedSci),2002;29(6):449-451.

［3］WangWQ.StudyoneffectofTCMonhepaticfibrosis［J］.ShandongZhongyiyaoDaxueXuebao(JShandongUnivofTCM),2003;27(1):75-78.

［4］WangGY,CaiWM,WangJQ.Experimentalstudyofhistologicalquantitativemethodindiagnosinghepaticfibrosis［J］.ZhongxiyiJieheGanzangbingZazhi(ComchinandwestJHepato),1999;9(1):26-28.

［5］HepaticFibrosisstudyGroupofChineseliverdiseasesAssociation.Consensusonevaluationofthediagnosisandefficacyofhepaticfibrosis［J］.ZhonghuaGanzangbingZazhi(ChinJHepato),2002;10(5):327-329.

［6］LuS,ZhanAH,HuangXX.RenYJ.ExpressionandsignificanceofproliferatingcellnuclearantigeninresistanceoflithiumcarbonatetoAflatoxinB1inducedhepatocarcinogenesisinrats［J］.AibianTubianJibian(CarciTeraMut),2002;14(2):84-86.

［7］WeiW,GongJP,QiuFZ.Relationshipbetweencellproliferationandapoptosisduringthenormalandabnormallivertissueprolferation［J］.ZhongguoshiyanwaikexueZazhi(ChinJExpSurg),2001;18(2):156-158.

［8］ZhangXL,ShiJQ.QuantitativestudyonmorphologicfeaturesandprolifertiveactivityduringDENinducedhepatocarcinogenesisinrats［J］.ACTA,2001;23(3)：304-307.

［9］JiG,CaoCL,LiuP,HuWY,LiuC.PathologyandimmunochemistryresearchoneffectsofFuzhengHuayuprescriptiononhepatocyteproliferationofcirrhosisrats［J］.ZhongguoZhongyiJichuYixueZazhi(ChinJBasMedTCM),2001;7(2):29-32.

［10］ZhuB,LiuDW,FangWL,YangX.EffectofantifibrosisherbsonexpressionoftypeI,IIIcollagenandtransforminggrowthfactorβmRNAinliverofratswithhepaticfibrosis［J］.ZhongguoZhongyiJichuYixueZazhi(ChinJBasMedTCM),2003;9(1):21-24.

［11］JangXL,JinYH,PenCE.ExperimentalstudyofhistochemistryandimmunohistochemistryonpreventionandtreatmentofhepaticfribrosiswiththesecondDecoction［J］.ZhongguoZhongyiJichuYixueZazhi(ChinJBasMedTCM),2002;8(11):48-50.

［12］QianY,LingCQ,YuCQ,ZhangYN,WangYZ.OberstructiveeffectofthreetraditionalChineseprescriptionsonliverpreneoplasticlesioninrats［J］.DisiJunyiDaxueXuebao(JFourthMilMedUniv),1999;20(1):916-918.