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【摘要】血小板膜糖蛋白Ⅵ（GPⅥ）是血小板表面重要的膠原受體，能介導(dǎo)血小板與膠原的初期黏附，產(chǎn)生信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，提高整合蛋白受體親合力，引起血小板聚集和血栓形成。抑制GPⅥ功能可顯著抑制膠原誘導(dǎo)的血小板黏附、聚集和血栓形成，故GPⅥ已成為研制新型抗血小板藥物的主要靶點(diǎn)。過去幾年中，對血小板和膠原相互作用的研究取得很大進(jìn)展,本文就GPⅥ的結(jié)構(gòu)，GPⅥ的功能，GPⅥ功能相關(guān)因素，GPⅥ與臨床等作一綜述。

【關(guān)鍵詞】血小板膜糖蛋白Ⅵ；膠原；血栓形成

AdvancesintheStudiesofplateletglycoproteinⅥ（GPⅥ）——Review

AbstractplateletglycoproteinⅥ（GPⅥ）isamajorreceptorforcollagenontheplateletsurface.Itmediatestheinitialplateletcontactwithcollagen,generatesintracellularsignals,increasestheaffinityofintegrinreceptor,andcausesplateletaggregationandthrombosis.SuppressionofGPⅥfunctioncansignicantlyinhibitcollagen-inducedplateletadhesion,aggregationandthrombosis,soGPⅥhasbecomeanoveltargetforantiplatelettherapy.Withinthelastfewyears,majoradvanceshavebeenmadeinunderstandingplatelet-collageninteractions.Inthispaper,theadvancesofstudyonGPⅥ,includingcompositionofGPⅥ,functionsofGPⅥ,factorsrelatedwithfunctionsofGPⅥ,GPⅥandclinicweresummarized.

KeywordsGPⅥ;collagen;thrombosis

血小板與血管損傷部位暴露的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellularmatrix，ECM）接觸是形成血栓、修復(fù)損傷組織和止血的第一道防線。在ECM的大分子組成成分中膠原起主要作用,它不但可以通過直接和間接的途徑與血小板黏附，還可引起血小板聚集及促凝活性的表達(dá),在存在高切應(yīng)力的動脈或損傷血管處血小板與膠原的相互作用尤為重要。目前研究認(rèn)為，血小板表面有兩類膠原受體即整合蛋白α2β1(GPⅠa/Ⅱa)和血小板膜糖蛋白Ⅵ（GPⅥ）。α2β1可直接與膠原結(jié)合,但需要經(jīng)過由內(nèi)向外的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)變?yōu)楦哂H和力狀態(tài)才能實(shí)現(xiàn)，而GPⅥ在介導(dǎo)血小板與膠原黏附、快速信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、血小板活化及促凝活性表達(dá)等復(fù)雜過程中處中心位置［1］。近年來對GPⅥ的研究取得很大進(jìn)展，現(xiàn)綜述如下。

GPⅥ的結(jié)構(gòu)

1982年,應(yīng)用2-D凝膠電泳，GPⅥ首次被確認(rèn)。1999年，Clemetson等［2］首先報(bào)道人GPⅥ克隆為Ⅰ型單鏈跨膜糖蛋白,屬免疫球蛋白超家族成員。GPⅥ基因定位于19號染色體長臂(19q13.4)，含有8個(gè)外顯子，分子量為62kD，其cDNA克隆全長1017bp,編碼319個(gè)氨基酸殘基和20個(gè)氨基酸信號肽，分子結(jié)構(gòu)分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。胞外區(qū)有2個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域和含多個(gè)O糖基化位點(diǎn)的黏蛋白樣富含絲／蘇氨酸區(qū)域，為分子的空間活動提供一定的柔韌度；位于GPⅥ跨膜區(qū)19個(gè)氨基酸中第3位帶正電荷的精氨酸與免疫球蛋白Fc受體γ鏈跨膜區(qū)的天門冬氨酸殘基以鹽鍵相連，組成受體復(fù)合物；胞內(nèi)區(qū)含51個(gè)氨基酸，不含酪氨酸殘基，但含有2個(gè)獨(dú)特序列，一是靠近跨膜區(qū)富含堿性氨基酸的區(qū)域，能與鈣調(diào)蛋白結(jié)合；另一個(gè)是位于中部的富含脯氨酸基序，可選擇性與Src家族酪氨酸激酶Fyn和Lyn的SH3區(qū)結(jié)合［3］。

GPⅥ的功能

GPⅥ介導(dǎo)血小板與膠原的初期黏附，產(chǎn)生信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，提高整合蛋白受體親合力，引起血小板聚集、釋放和血栓形成［4］。

膠原、合成膠原及GPⅥ特異性配體

在人類基因組上，有20余種膠原基因，其中9種被證實(shí)表達(dá)于血管壁上，纖維膠原Ⅰ、Ⅲ型是血管壁ECM的重要組成成分，而Ⅳ型網(wǎng)狀膠原是內(nèi)皮細(xì)胞基底膜的組成形式。血小板可被不溶性纖維膠原激活，可溶性膠原不結(jié)合靜止?fàn)顟B(tài)的血小板，而與另一膠原受體，活化的整合蛋白α2β1結(jié)合，它只有轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維膠原時(shí)才能激活血小板［5］。膠原含有重復(fù)的GPO基序（G，甘氨酸；P，脯氨酸；O，羥脯氨酸），約占Ⅰ、Ⅲ型膠原的10％，是血小板與ECM接觸的重要結(jié)構(gòu)形式，也是與GPⅥ免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域的結(jié)合基序。膠原相關(guān)肽（collagen-relatedpeptide，CRP）是含有串聯(lián)的GPO基序的人工合成肽段，是GPⅥ的誘導(dǎo)劑。許多蛇毒肽可通過GPⅥ發(fā)揮作用，其中C型凝集素convulxin是最早被證實(shí)的，它通過使受體叢集誘導(dǎo)血小板活化。

GPⅥ與免疫球蛋白Fc受體γ鏈復(fù)合物

Jarvis等［6］發(fā)現(xiàn)，缺乏FcRγ鏈的血小板對膠原的刺激無反應(yīng)，提示GPⅥ和FcRγ鏈以非共價(jià)鍵結(jié)合的蛋白復(fù)合物是所有類型膠原的關(guān)鍵受體，兩者在結(jié)構(gòu)和功能上密切相關(guān)。Yoshiki等［7］也實(shí)驗(yàn)證實(shí)，GPⅥ只有和FcRγ鏈組成異源二聚體，才能與膠原結(jié)合，而且只結(jié)合不溶性纖維膠原。FcRγ鏈含有免疫受體酪氨酸活化基序（immunoreceptortyrosinebasedactivationmotif，ITAM），是該復(fù)合物的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)部分。

GPⅥ與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

膠原通過其特異性GPO序列與GPⅥ／FcRγ鏈?zhǔn)荏w復(fù)合物結(jié)合后，使2個(gè)GPⅥ復(fù)合物交聯(lián)而活化。GPⅥ胞內(nèi)富含脯氨酸的基序選擇性與Src家族酪氨酸激酶Fyn和Lyn的SH3區(qū)結(jié)合，使FcRγ鏈的ITAM磷酸化，ITAM磷酸化為Syk家族酪氨酸激酶提供了結(jié)合位點(diǎn)，可特異結(jié)合在其串聯(lián)的SH2區(qū)而使Syk酪氨酸磷酸化。擁有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)的Syk底物，接頭蛋白LAT和SLP-76等可募集其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體，引發(fā)下游許多效應(yīng)酶包括磷脂酰C－γ2,小G蛋白和磷脂酰肌醇3激酶等活化，從而使信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)擴(kuò)大，導(dǎo)致胞內(nèi)鈣離子濃度升高，纖維蛋白原受體活化，細(xì)胞骨架重排，最終血小板發(fā)生聚集、釋放和促凝活性表達(dá)。GPⅥ在體內(nèi)分布有明顯的空間限制性,僅分布于巨核細(xì)胞和血小板,在其他組織細(xì)胞未見表達(dá),被認(rèn)為是血小板膠原特異的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白。GPⅥ基因剔除小鼠血小板表現(xiàn)出對膠原刺激無反應(yīng)，但無明顯出血傾向［8］。

GPⅥ功能相關(guān)的影響因素

整合蛋白α2β1的作用

整合蛋白α2β1（也被稱作為GPⅠa/Ⅱa或淋巴細(xì)胞VLA-2）是血小板上第一個(gè)被確認(rèn)的膠原受體，依賴于Mg2與膠原結(jié)合，但不能誘導(dǎo)酪氨酸激酶活化。GFOGER序列是α2β1特異性螺旋肽，支持α2β1介導(dǎo)的黏附［9］。α2β1在體內(nèi)多種組織上表達(dá)，是膠原和層黏連蛋白的受體，但在血小板上只和膠原結(jié)合。上個(gè)世紀(jì)80年代后期及90年代早期，α2β1被認(rèn)為是血小板表面最主要的膠原受體，在血小板與膠原的黏附、活化中起關(guān)鍵作用，但后來對α2β1作用的研究出現(xiàn)爭議。Jung和Moroi［10］的研究認(rèn)為，整合蛋白與膠原的親合力受細(xì)胞內(nèi)信號的調(diào)整，即GPⅥ介導(dǎo)與膠原最初的結(jié)合，導(dǎo)致整合蛋白α2β1和αⅡbβ3的活化，反過來它們又介導(dǎo)了與膠原的穩(wěn)定結(jié)合并加強(qiáng)了GPⅥ的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。但另有研究證實(shí)α2β1在血小板與膠原的最初黏附中起著重要作用［11］。Auger等［12］應(yīng)用特異性抗α2β1和GPⅥ抗體以及Src家族酪氨酸激酶抑制劑研究發(fā)現(xiàn)，α2β1和GPⅥ是通過不同途徑介導(dǎo)血小板與膠原的結(jié)合，提示這兩種膠原受體可能相互協(xié)作增加血小板與膠原的結(jié)合而刺激血小板活化。最近，Sarratt等［13］應(yīng)用藥理學(xué)和基因?qū)W方法研究證實(shí)，α2β1和GPⅥ這兩個(gè)結(jié)構(gòu)各異的膠原受體在血小板與膠原的結(jié)合中發(fā)揮同等重要的作用，都能產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致血小板聚集，并且兩者有密切的合作關(guān)系。

GPⅠb-Ⅴ－Ⅸ復(fù)合體的作用

內(nèi)皮下膠原最初俘獲血小板需要血漿蛋白vWF，它能同時(shí)結(jié)合膠原和GPⅠb-Ⅴ－Ⅸ。vWF依賴的膠原結(jié)合作用可快速終止，使血小板僅在vWF表面滾動但不能形成穩(wěn)定的血栓，這種結(jié)合能被膠原和膠原受體更穩(wěn)定的結(jié)合而取代。vWF和GPⅠb-Ⅴ－Ⅸ結(jié)合后刺激鈣的動員和細(xì)胞骨架重排，上調(diào)αⅡbβ3親合力，使其與VWF結(jié)合，增加黏附，結(jié)合纖維蛋白原而形成血栓。vWF和GPⅠb-Ⅴ－Ⅸ結(jié)合后也可刺激血小板信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，引起血小板顆粒釋放，上調(diào)整合蛋白親合力，其具體途徑可能類似于GPⅥ在血小板內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。GPⅠb-Ⅴ－Ⅸ和GPⅥ兩者的關(guān)系一般認(rèn)為，在低切應(yīng)力狀態(tài)下，GPⅥ啟動血小板聚集，而GPⅠb-Ⅴ－Ⅸ復(fù)合物則引發(fā)高切應(yīng)力條件下的血小板聚集。但最近對GPⅠb-Ⅴ－Ⅸ及GPⅥ功能和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究顯示兩者有許多共同特征，從而推測它們在細(xì)胞表面可能相互關(guān)聯(lián)［14］。Arthur等［15］最近也研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用GPⅠb特異性單克隆抗體SZ2，可明顯阻斷GPⅥ特異性誘聚劑CRP所誘導(dǎo)的血小板聚集，并證實(shí)在靜止和活化的血小板表面，GPⅥ和GPⅠb-Ⅴ－Ⅸ復(fù)合物均存在相互作用。

αⅡbβ3（GPⅡb/Ⅲa）的作用

αⅡbβ3作為纖維蛋白原受體是血小板血栓形成的最后步驟。當(dāng)血管壁受損暴露血管內(nèi)皮下基質(zhì),血小板通過GPⅠb及GPⅥ介導(dǎo)黏附于內(nèi)皮下膠原組織,黏附的血小板隨后發(fā)生一系列反應(yīng),包括花生四烯酸代謝,產(chǎn)生血栓烷A2和釋放細(xì)胞顆粒內(nèi)容物ADP等,導(dǎo)致αⅡbβ3復(fù)合物構(gòu)型改變和纖維蛋白原受體的暴露,并通過與纖維蛋白原的結(jié)合而使血小板之間相互黏附、聚集成團(tuán),在血管破損處形成血栓。αⅡbβ3由內(nèi)向外的活化依賴于鈣離子而αⅡbβ3與配體結(jié)合后還會產(chǎn)生由外向內(nèi)的信號傳遞引起血小板的第二次活化反應(yīng)，促進(jìn)顆粒釋放，以正反饋增強(qiáng)活化過程；同時(shí)，血小板膜磷脂的翻轉(zhuǎn)促進(jìn)了血液的凝固過程［16］。

第二介質(zhì)在膠原引發(fā)血小板聚集的作用

細(xì)胞活化是血小板與膠原黏附的必要條件,GPⅥ在此過程中起主要作用,但是GPⅥ介導(dǎo)的活化可被ADP和血栓烷等第二介質(zhì)強(qiáng)化。這些可溶性活化誘導(dǎo)劑激活血小板并非與膠原直接接觸，而是通過激活血小板上黏附膠原的整合蛋白α2β1和αⅡbβ3，促進(jìn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。研究證明ADP是通過與G蛋白偶聯(lián)的受體P2Y1和P2Y12激活血小板，當(dāng)血小板被其他的誘聚劑激活，致密顆粒分泌ADP作用于P2Y1／P2Y12受體以自分泌和旁分泌機(jī)制促進(jìn)血小板穩(wěn)定聚集，這個(gè)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑協(xié)同GPⅥ信號促進(jìn)整合蛋白活化。P2Y1偶聯(lián)于Gαq，調(diào)節(jié)鈣依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，引起血小板形狀改變和快速、可逆的αⅡbβ3依賴性血小板聚集；P2Y12偶聯(lián)于Gαi通過抑制腺苷酸環(huán)化酶產(chǎn)生cAMP來激活αⅡbβ3，這兩個(gè)受體的相互關(guān)系是P2Y1啟動聚集，P2Y12起加強(qiáng)作用［17］。當(dāng)血小板通過α2β1途徑結(jié)合膠原時(shí)，并不依賴于ADP和血栓烷等介質(zhì)［18］。

GPⅥ活化途徑的負(fù)性調(diào)節(jié)因子

血小板活化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)能被血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1（plateletendothelialcelladhesionmolecule1,PECAM-1）抑制［19］。表達(dá)于血細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的PECAM-1(也稱為CD31)參與白細(xì)胞跨膜遷移，調(diào)節(jié)細(xì)胞活化及凋亡等多個(gè)過程。當(dāng)PECAM-1被激活后，通過Src家族酪氨酸激酶使其免疫受體酪氨酸抑制基序（immunoreceptortyrosinebasedinhibitionmotif，ITIM）磷酸化，募集酪氨酸、絲氨酸／蘇氨酸或磷酯酶，隨后抑制激酶依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。黏附受體的活化信號及PECAM-1抑制信號的平衡可調(diào)整血栓形成的刺激閾值，決定血栓大小和穩(wěn)定度，防止血栓形成失控。

其他有爭議的膠原受體

CD36（或GPⅣ）在上個(gè)世紀(jì)80年代晚期被認(rèn)為是膠原受體，近來認(rèn)為它是Ⅴ型膠原的特異性受體而非膠原的功能性受體，因?yàn)槿狈D36的人或鼠，血小板對Ⅰ－Ⅴ型膠原的反應(yīng)均正常［6］。另一個(gè)膠原受體是GPⅤ，它以非共價(jià)鍵與GPⅠb/Ⅸ相連，但其功能卻不甚明了，不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異較大［1］，所以是否真正存在第三個(gè)功能性的膠原受體尚存在爭議。綜上所述，血小板與膠原的黏附模式為：循環(huán)血流中血小板黏附到受損血管壁的第一步是vWF分子的A3區(qū)與暴露的膠原結(jié)合，vWF分子的A1區(qū)發(fā)生構(gòu)象的改變，而與血小板GP-Ⅳ-Ⅴ復(fù)合物結(jié)合，使血小板間接黏附于膠原纖維，同時(shí)GPⅥ介導(dǎo)血小板與膠原直接結(jié)合；第二步，GPⅥ－膠原的相互作用產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)信號將β1、β3整合蛋白轉(zhuǎn)為高親合力狀態(tài)，并誘發(fā)可溶性誘導(dǎo)劑的釋放（主要是ADP和血栓素）放大整合蛋白的活化，通過活化更多的血小板而介導(dǎo)血栓形成［20］。GPⅠb介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可放大GPⅥ誘發(fā)的活化信號；最后，血小板通過活化的整合蛋白α2β1（直接作用）和αⅡbβ3（通過vWF或其他配體間接作用）與膠原牢固黏附。整合蛋白介導(dǎo)的黏附加強(qiáng)了GPⅥ與膠原的相互作用，引起信號轉(zhuǎn)導(dǎo)增加，更上調(diào)整合蛋白活性，增加釋放和促凝活性的表達(dá)，最終導(dǎo)致血栓形成。

GPⅥ與臨床

GPⅥ在止血和血栓中的臨床意義

盡管細(xì)胞外基質(zhì)成分復(fù)雜，但血小板和膠原的黏附在體內(nèi)啟動止血和血栓起重要作用。抑制GPⅥ功能可在體外高切應(yīng)力下顯著抑制膠原誘導(dǎo)的血小板黏附、聚集和血小板血栓形成［21］。GPⅥ缺乏最重要的特點(diǎn)是患者血小板對膠原誘導(dǎo)的聚集無反應(yīng)，但對其他誘聚劑反應(yīng)正常。Boylan等［22］報(bào)道在一例ITP患者血漿中檢測到抗GPⅥ自身抗體，雖然其GPⅥ基因正常，但血小板表面GPⅥ和FcRγ鏈幾乎喪失，證實(shí)是其自身抗體特異性結(jié)合GPⅥ陽性血小板，清除血漿中可溶性GPⅥ，導(dǎo)致血小板不能結(jié)合膠原，也不能形成血栓。Samaha等［23］用流式細(xì)胞技術(shù)直接測定血小板表面的膠原受體密度，發(fā)現(xiàn)心肌梗死患者受體密度較正常對照增高，提示血小板膠原受體密度增高可能是心肌梗死患者新的危險(xiǎn)因素。Bellucci等［24］報(bào)道2例惡性血液病患者膠原誘導(dǎo)的血小板功能障礙是由于GPⅥ偶聯(lián)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受損。Nurden等［25］報(bào)道1例灰色血小板綜合癥患者伴有獲得性GPⅥ缺乏，其膠原誘導(dǎo)的血小板聚集功能受損。

新型抗血小板藥物的研究進(jìn)展

血栓栓塞性疾病是當(dāng)前危害人類健康的主要原因之一,血小板異常活化在血栓形成中起重要作用,因而研制開發(fā)抑制血小板黏附、釋放、聚集功能和血小板活化的抗血小板藥物是抗血栓治療的一個(gè)重要策略。如抗血小板GPⅡb/Ⅲa單克隆抗體阿昔單抗能有效預(yù)防冠狀動脈閉塞患者溶栓治療和冠狀動脈腔內(nèi)成型術(shù)后的冠狀動脈再栓塞，但存在治療窗口狹小和并發(fā)出血等不良反應(yīng)。血小板與膠原之間的相互作用是血小板黏附、聚集和活化的始動因素,因而成為研制新型抗血小板藥物的主要靶點(diǎn)［26］。在小鼠體內(nèi)動脈損傷模型中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)抗GPⅥ抗體處理的血小板不與損傷的動脈內(nèi)膜發(fā)生黏附，也不在局部形成血栓［27］。體外試驗(yàn)也表明，抗小鼠GPⅥ單克隆抗體JAQ1對膠原誘導(dǎo)的血小板聚集有一定的抑制效應(yīng)［13］，它可使循環(huán)血小板表面的GPⅥ內(nèi)化和降解,產(chǎn)生GPⅥ基因剔除樣現(xiàn)象，但不影響其他血小板受體如GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/Ⅸ等,表明JAQ1是特異性阻斷GPⅥ依賴性血小板活化通路。Qian等［28］應(yīng)用組合抗體文庫技術(shù)制備人源抗GPⅥ抗體,其中A10克隆可特異性抑制膠原誘導(dǎo)的血小板聚集。

Smethurst等［29］應(yīng)用噬菌體抗體庫技術(shù)篩選出抗GPⅥScFv抗體(10B12),可顯著抑制膠原與GPⅥ的結(jié)合。因GPⅥ僅在血小板和巨核細(xì)胞上表達(dá)，針對GPⅥ為靶點(diǎn)的抗體對抑制血小板活化具有特異性的阻斷作用,且GPⅥ缺乏患者僅表現(xiàn)為輕微的出血傾向，更容易耐受，故目前人們正積極尋找有效的GPⅥ拮抗劑，聯(lián)合不同作用機(jī)制的抗血小板藥物可能是抗栓治療的一個(gè)方向。

結(jié)語

近年來，對血小板及膠原相互作用以及在啟動止血及血栓作用的研究取得很大進(jìn)展。GPⅥ作為主要的膠原受體參與血小板的初期黏附,并誘發(fā)一系列血小板由內(nèi)到外的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),活化血小板膜表面整合蛋白受體,導(dǎo)致血小板聚集和血小板血栓形成，故血小板GPⅥ結(jié)構(gòu)和功能的完整性對正常止血功能的發(fā)揮和動脈血管內(nèi)高切應(yīng)力條件下的病理性血栓形成有重要影響。開發(fā)GPⅥ高度特異性抑制劑對基礎(chǔ)研究很有價(jià)值并具有臨床應(yīng)用潛力。

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