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摘要】本研究觀察激活的供、受者NK細胞能否減輕骨髓移植后gvhd和增加移植成活率。以C57BL/6小鼠作為供者，將接受6.5Gy60COγ射線全身照射的BALB/c受鼠隨機分為4組，對照1組（無任何處理）、對照2組（骨髓移植）、實驗1組（骨髓移植同時輸注激活的受者NK細胞）和實驗2組（骨髓移植同時輸注激活的供者NK細胞），觀察每組小鼠的活存期、嵌合率、GVHD臨床和病理改變。結果表明：對照1組全部活存，實驗1組比對照2組活存期短（P<0.05），實驗2組比對照2組活存期延長（P<0.01）。實驗1組GVHD臨床及病理評分高于對照2組（P<0.05），實驗2組GVHD臨床及病理評分明顯低于對照2組（P<0.01）。實驗1組和實驗2組嵌合率均較對照2組高（P<0.05），實驗2組的嵌合率比實驗1組明顯增加（P<0.01）。結論：激活的供者NK細胞能延長實驗小鼠的活存期，降低GVHD嚴重程度，增加移植成活率；而激活的受者NK細胞卻縮短實驗小鼠的活存期，加重GVHD嚴重程度。受者NK細胞也增加移植成活率，但比供者NK細胞作用小。

【關鍵詞】骨髓移植;NK細胞;GVHD;移植成活率

ExperimentalStudyofDonorNaturalKillerCellsReducingGraft-versus-hostDiseaseandEnhancingEngraftment

AbstractThepurposeofthisstudywastoinvestigatewhetherpretransplantinfusionofreactivenaturalkillercells（NKcells）fromdonororrecipientcanreducegraft-versus-hostdisease（GVHD）andenhanceengraftmentinbonemarrowtransplantation（BMT）.RecipientBALB/cmiceweredividedinto4groupsafterreceived6.5Gytotal-bodyirradiation(TBI):controlgroup1wastreatedwithnothing,controlgroup2receivedBMTalone,experimentgroup1receivedBMTandautoreactiveNKcells,experimentgroup2receivedBMTandalloreactiveNKcells.Lifespan,clinicalandpathologicchangesofGVHDandchimerismrateofeachgroupwereevaluated.Theresultsshowedthatallmiceweresurvivalincontrolgroup1.Thelifespanwasshorterinexperimentgroup1thanthatincontrolgroup2（P<0.05）andlongerinexperimentgroup2thanthatincontrolgroup2（P<0.01）.GVHDwashigherinscoreofexperimentgroup1thanincontrolgroup2（P<0.05）butlowerinexperimentgroup2thanthatincontrolgroup2（P<0.01）.Thedonorchimerismrateinbothtwoexperimentgroupswerehigherthanthatincontrolgroup2（P<0.05）,however,thedonorchimerismratewashigherinexperimentgroup2thanthatinexperimentgroup1（P<0.01）.ItisconcludedthatpretransplantinfusionofalloreactivedonorNKcellscanprolonglifespan,reducethedegreeofGVHDandenhanceengraftment.ButautoreactiverecipientNKcellscanshortenlifespan,aggravatethedegreeofGVHDandalsoenhanceengraftment,whichisweakerthanthatusingalloreactivedonorNKcells.

Keywordsbonemarrowtransplantation;naturalkillercell;GVHD;engraftment

骨髓移植是目前根治惡性血液腫瘤的主要方法，但其主要致死性并發(fā)癥——移植物抗宿主?。╣raft-versus-hostdisease,GVHD）卻制約著其應用?；仡櫺?a href="http://www.eimio.cn/lunwen/jiaoyue/yixue/200903/170572.html" target="_blank">研究發(fā)現(xiàn),在骨髓移植中受者體內(nèi)天然殺傷細胞（naturalkillercells,NK）增加的同時GVHD發(fā)生率降低，移植成活率增加，復發(fā)率減少［1］。我們利用動物模型分別研究了供、受者來源的NK細胞能否減輕GVHD和增加移植成活率，探索NK細胞在骨髓移植中的應用及機制。

材料和方法

實驗動物

C57BL/6（H-2b）小鼠作為供者，BALB/c（H-2d）小鼠作為受者，均為雄性，鼠齡8周，體重18-20g，均為清潔級動物（四川大學華西校區(qū)實驗動物中心提供和飼養(yǎng)）。

實驗分組

將接受6.5Gy60COγ射線全身照射的BALB/c受鼠隨機分為4組：對照1組（不予以任何處理）、對照2組（予以骨髓移植）、實驗1組（骨髓移植同時輸注激活的受者NK細胞），實驗2組（骨髓移植同時輸注激活的供者NK細胞）。每組用10只小鼠觀察生存期和GVHD，用20只小鼠檢測嵌合率。

NK細胞分離、純化、檢測及體外活化

分別取供、受鼠脾臟和骨髓細胞，用抗CD49b（DX5）MicroBeads（MiltenyiBiotec公司產(chǎn)品）分離NK細胞，用rhIL-2體外培養(yǎng)及激活，標記CD49b抗體（BioLegend公司產(chǎn)品），用流式細胞儀（Coulter公司產(chǎn)品）檢測NK細胞含量。LAC-1細胞作為靶細胞，MTT法檢測培養(yǎng)后的NK細胞殺傷活性。

小鼠骨髓移植模型

參照Ruggeri等［2］的方法，各組受鼠在移植前飲用含慶大霉素滅菌水（32×104U/L），移植前1天行亞致死劑量60COγ射線全身照射（TBI6.5Gy）。照射后4小時在無菌條件下，用頭皮針沿受鼠鼠尾靜脈輸注含量大于90%、活細胞數(shù)大于95%、殺傷活性大于90％的NK細胞（5×105/只）。照射后1天，無菌條件下摘眼處死供鼠，取股骨，用無菌培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，收集細胞沖洗液，溶解紅細胞后，作為移植的骨髓細胞。取供鼠脾臟，研磨后用200目篩網(wǎng)制成單個細胞懸液，溶解紅細胞后，作為輸注的供鼠淋巴細胞。在無菌條件下，用頭皮針沿受鼠鼠尾靜脈輸注供鼠骨髓細胞（1×107/只）和供鼠淋巴細胞（1×107/只）。術后于二級動物房層流床飼養(yǎng)。

存活期和GVHD臨床表現(xiàn)的觀察

活存超過30天為長期活存［3］。移植后，每周稱重1次，觀察小鼠有無體重下降、腹瀉和脫毛，有無弓背、聳毛、活動度差等精神表現(xiàn)。GVHD臨床評分（0-10分）由體重下降、活動度、姿勢、聳毛、皮膚潰瘍5項相加組成。體重下降＜10％為0分，下降10％-25％為1分，下降＞25％為2分。無活動度下降、姿勢異常、聳毛為0分，輕度活動度下降、聳毛、姿勢異常判為1分，重度活動度下降、聳毛、姿勢呈弓背樣改變?yōu)?分。皮膚完整無脫毛為0分，小片淺潰瘍、輕度潰瘍?yōu)?分，大片潰瘍、脫毛為2分［4］。

GVHD病理學觀察

對死亡小鼠及活存超過30天處死的小鼠，取肝、脾、腸和皮膚組織，用4％的多聚甲醛液固定，石蠟切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察。GVHD病理評分標準（0-10分）：肝臟根據(jù)匯管區(qū)有無淋巴細胞浸潤、膽管有無炎癥、阻塞分為Ⅰ-Ⅴ級；小腸按有無隱窩細胞壞死、粘膜缺失分為Ⅰ-Ⅴ級［5］。

嵌合體檢查

從死亡小鼠以及移植前和移植后1、2、3、4周各組處死的小鼠中，取出脾臟并研磨，溶解去掉紅細胞。用FITC連接的供鼠MHCⅠ單克隆抗體（H-Kb抗體）和PE連接的受鼠MHCⅠ單克隆抗體（H-Kd抗體）標記，上流式細胞儀檢測嵌合率。

統(tǒng)計學分析

采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件包處理，計量資料用均數(shù)±標準差（X±SD）表示，計數(shù)資料用百分率（％）表示。用單因素方差分析（one-wayANOVA）對各組均數(shù)作顯著性檢驗，如多組比較有顯著性差異，進一步采用Student-Newmen-Keulstest作各樣本之間的兩兩比較。等級資料用秩和檢驗。對小鼠生存期繪制Kaplan-Meier存活曲線，用時序檢驗和log-ranktest檢驗比較生存期及死亡率。

結果

生存期及死亡率觀察

對照1組全部存活，對照2組、實驗1組、實驗2組存活期分別為25.6±1.2天、19.4±1.8天和33.7±1.5天，30天死亡率分別為100％、100％和20％。各組Kaplan-Meier生存率曲線見圖1。實驗2組和對照2組差異顯著（χ2＝13.5，P＝0.0002）。實驗1組和對照2組差異顯著（χ2＝4.94，P＝0.03）。

GVHD臨床表現(xiàn)

對照1組沒有GVHD臨床表現(xiàn)。對照2組和實驗1組出現(xiàn)明顯GVHD臨床表現(xiàn)：體重下降明顯（下降10％-25％）、活動度降低、弓背體位、聳毛、脫毛、腹瀉等現(xiàn)象，評分分別為7.2±1.3和8.5±1.0分；兩組比較有差異（H值＝-2.09，P＝0.037）。實驗2組GVHD出現(xiàn)晚（25天后才出現(xiàn)）、程度輕，表現(xiàn)為輕度體重下降（下降<10％）、輕度脫毛和弓背體位，活動度輕度降低，沒有腹瀉，評分3.1±1.2分，與對照2組比較有顯著差異（H值=-3.766，P=0.0000）（表1）。Table1.ScoredseverityofGVHDmanifestationingroups(略)

GVHD病理表現(xiàn)

對照1組小鼠肝、脾、腸和皮膚組織均正常。對照2組和實驗1組小鼠肝臟結構被破壞，肝細胞索排列紊亂，肝細胞彌漫性大片壞死，中央靜脈和肝血竇擴張、淤血，膽小管增生、淤膽，壞死區(qū)由增生的結締組織所取代，伴大量枯否氏細胞和淋巴細胞浸潤。小腸粘膜層被覆上皮壞死脫落，為一層紅染的壞死組織、變性的白細胞和纖維素交織成的假膜所覆蓋；粘膜和粘膜下層明顯水腫、充血，伴大量淋巴細胞浸潤。脾臟萎縮，正常結構破壞，有巨噬細胞和淋巴細胞浸潤。皮膚結構破壞，局部有淋巴細胞浸潤，有纖維細胞增生。評分分別7.5±1.1和8.8±1.0分，兩組比較有差異（H值為-2.330，P＝0.020）。實驗2組小鼠肝細胞排列整齊，形態(tài)完整，肝血竇和匯管區(qū)有少量枯否氏細胞和淋巴細胞浸潤，中央靜脈輕度淤血。小腸各層結構完整，沒有壞死脫落，粘膜和粘膜下層伴少量淋巴細胞浸潤。脾臟結構正常，沒有巨噬細胞和淋巴細胞浸潤。皮膚僅見真皮層毛細血管輕度擴張，未見淋巴細胞浸潤。評分2.5±1.1分，與對照2組比較差異顯著（H值為-3.808，P＝0.0000）(表2和圖2)。Table2.ScoredseverityofGVHDpathologyfeatureingroups(略)

嵌合體檢查

對照1組沒有供者嵌合體，對照2組、實驗1組、實驗2組在第2周供者嵌合率最高，分別為63.2％、81.7％、96.4％，以后逐漸下降，第4周供者嵌合率分別為3.7％、29.4％、52％（P<0.05）（圖3）。

討論

單純照射組全部存活，說明我們使用的是亞致死劑量照射，實驗動物均能耐受預處理，其他組小鼠死亡可以排除照射原因。由于沒有移植供鼠骨髓，單純照射組病理檢測無GVHD改變，也沒有供者嵌合體。我們采用骨髓移植聯(lián)合輸注供鼠淋巴細胞，在單純骨髓移植組均出現(xiàn)了嚴重的GVHD臨床和病理改變，構建了異基因骨髓移植GVHD模型；由于使用的是亞致死劑量照射預處理，其嵌合率最高為63.2％，4周時下降到3.7％，移植物被排斥。該模型被用于進一步研究NK細胞對GVHD的作用。輸入激活的供者NK細胞能克服移植物被排斥，使嵌合率高達96.4％，4周時保持52％，增加了移植成活率。同時GVHD并沒有加重，反而明顯減輕，從7.2分降到3.1分，生存期從25.6天延長到33.7天，該結果與國外研究結果一致［2］，說明激活的供者NK細胞能延長生存期，降低GVHD臨床及病理程度，增加嵌合率，為臨床減少GVHD和提高移植成活率提供了切實可行的新思路和新方法。NK細胞具有兩種不同的受體，一種是激活NK細胞殺傷作用的受體（KAR），另一種是抑制NK細胞殺傷作用的受體（KIR）。如果KIR與其配體MHCⅠ不匹配，NK細胞將破壞含有這種配體的細胞［6］。我們使用C57BL/6（H-2b）和BALB/c（H-2d）兩個不同品系的近交系小鼠，它們的NK細胞KIR基因和MHCⅠ基因是不同的，供鼠KIR與受鼠MHCⅠ不匹配，供鼠NK細胞會殺傷受者細胞，比如殺傷受者抗原遞呈細胞等。因為自體NK細胞和自身MHCⅠ是匹配的，不會殺死自身細胞，所以我們將自體NK細胞設為異體NK細胞的對照。結果激活的自體NK細胞加重GVHD，小鼠死亡時間從25.6天縮短到19.4天，但嵌合率卻增加，對此，目前還沒有類似結果報道。這些結果不能完全用KIR-MHCⅠ的匹配關系解釋。是否自體NK細胞激活后其KAR功能和活性發(fā)生了變化，KAR殺傷作用遠遠大于KIR的抑制作用，誤殺了自身正常組織，從而加重GVHD。有報道體外NK細胞能溶解同源性未成熟樹突狀細胞（iDC）［7］，由于iDC起免疫抑制作用，自體NK細胞溶解自體iDC，也可以解釋自體NK細胞加重GVHD。我們的研究結果顯示，采用供鼠激活的NK細胞能夠減輕急性GVHD的嚴重程度，并且促進供鼠骨髓植入。其原理可能與供鼠NK細胞對受鼠體內(nèi)抗原呈遞細胞、淋巴細胞、吞噬細胞的殺傷和抑制作用有關，供鼠NK細胞在GVHD發(fā)病中對抗原識別和細胞效應階段的這種生物調控作用，值得進一步深入研究。

【參考文獻】

1DaviesSM,RuggieriL,DeForT,etal.EvaluationofKIRligandincompatibilityinmismatchedunrelateddonorhematopoietictransplants.Blood,2002;100:3825-3827

2RuggeriL,CapanniM,UrbaniE,etal.Effectivenessofdonornaturalkillercellalloreactivityinmismatchedhematopoietictransplants.Science,2002;295:2097-2100

3段連寧，郭坤元，袁進等．同種異基因Th2細胞移植對GVHD和GVL效應的作用.中國實驗血液學雜志,2000;8：57-60

4BrysonJS,JenningsCD,LoweryDM,etal.RejectionofanMHCclassIInegativetumorfollowinginductionofmurinesyngeneicgraft-versus-hostdisease.BoneMarrowTransplant,1999;23:363-72

5CookeKR,KobzikL,MartinTR,etal.Anexperimentalmodelofidiopathicpneumoniasyndromeafterbonemarrowtransplantation:I.therolesofminorHantigensandendotoxin.Blood,1996;8:3230-3239

6YoungNT.Immunobiologyofnaturalkillerlymphocytesintransplantation.Transplantation,2004;15,78:1-6

7CooperMA,FehnigerTA,FuchsA,etal.NkcellandDCinteractions.TrendsImmunol,2004;25:47-52.