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【摘要】本研究旨在探究mPEG修飾的紅細胞rh抗原的穩(wěn)定性。利用紅細胞膜蛋白SDS-PAGE電泳技術分析mPEG修飾后紅細胞膜蛋白與mPEG結合情況，用紅細胞血影凝集實驗及4℃CPD保養(yǎng)液保存的修飾紅細胞與匹配血液體外混血實驗，觀察mPEG修飾后紅細胞Rh抗原被遮蔽的穩(wěn)定性。結果發(fā)現(xiàn)：不同保存時間的mPEG修飾的紅細胞在模擬輸血（即混血前后）的血型保持不變，同時mPEG修飾的紅細胞在保存過程中游離血紅蛋白水平正常，并且混血后經37℃孵育的mPEG修飾的紅細胞游離血紅蛋白水平低于不混合的修飾的紅細胞。比較分析PEG特異的碘染和考馬斯亮藍染的顯色圖譜發(fā)現(xiàn)，特殊的碘染顯示出mPEG與紅細胞膜蛋白結合的條帶，mPEG-SPA與紅細胞膜蛋白結合后導致蛋白分子遷移速度發(fā)生改變。mPEG修飾的紅細胞血影凝集實驗證實，修飾紅細胞在質膜裂損后mPEG仍有效地遮蔽抗原。結論：mPEG-SPA不論在紅細胞膜蛋白被單獨提取后，還是膜破損后以及存活狀態(tài)下，均能與紅細胞膜蛋白穩(wěn)固結合。

【關鍵詞】mPEG修飾紅細胞；Rh抗原；紅細胞

RhAntigenStabilityofmPEGModifiedRedBloodCells

AbstractTheobjectiveofstudywastoinvestigatetheRhantigenstabilityofmPEG-modifiedRBC.RBCmembraneproteinSDS-PAGEtechnologywasusedtoanalyzethecombinationofthemPEGmodifiedRBCmembraneproteinwithmPEGmolecules;theRBCghostcoagulationtestand4℃CPD-preservedmodifiedRBCmixedwithmatchedbloodwereusedtoobservethestabilityofRBCRhantigencamouflagedbymPEG.TheresultsshowedthatthebloodgroupsofstoredmPEG-modifiedRBCwerekeptconsistencybeforeoraftersimulatingtransfusion,i.e.mixtureofmodifiedRBCwithmatchedbloods,whiletheplasmahemoglobinaftersimulatingtransfusionwasnotonlywithinthenormalrangeduringthestorage,butalsolessthanthatbeforesimulatingtransfusionevenafterincubationat37℃.TheelectrophoresispatternstainedwithiodineandCoomassiebluedisplayedthebandsofmPEGcombinedwithRBCmemberaneproteinandtheslowmobilityofmembraneprotein.ThehemagglutinationofPEGylationRBCghostsdidnottakeplaceandmPEGstillcoveredtheantigen.Inconclusion,mPEG-SPAcanbindtheerythrocytewithitsextractedmembraneproteininbothghostsandlivingerythrocytes.

KeywordsmPEGmodifiedredbloodcell;Rhantigen;redbloodcell

mPEG-SPA可以與蛋白質和多肽中的賴氨酸（K）、精氨酸(R)的胺基、組氨酸(H)的咪唑基以及酪氨酸(Y)的羥基發(fā)生化學反應，形成共價結合鍵，從而結合到蛋白質多肽上［1］，達到遮蔽抗原的作用。mPEG與紅細胞膜Rh抗原結合后是否穩(wěn)定，進入人體后是否會脫落，這些問題關系到修飾后紅細胞進入人體后的安全性。為此，我們采用mPEG修飾的紅細胞膜蛋白SDS-PAGE電泳、紅細胞血影凝集實驗以及用4℃CPD保養(yǎng)液保存的修飾紅細胞與匹配血液進行的體外混血實驗，對mPEG修飾后紅細胞Rh抗原被遮蔽的穩(wěn)定性進行了初步的研究。

材料和方法

樣品

20mmol/LmPEG-SPA修飾的AB、RhDEeCc紅細胞，AB、RhD-全血，RhD血液血漿。

試劑

CPD保養(yǎng)液、低滲磷酸緩沖液（20mOSM，pH7.4）、10mmol/LTris-鹽酸低滲緩沖液、等滲液、電泳緩沖液、30%聚丙烯酰胺凝膠溶液、分離膠緩沖液、濃縮膠緩沖液、10%分離膠、10%基層膠、0.25%考馬斯亮藍R-250、脫色液、樣品處理液、蛋白分子量標準物（marker）。

儀器

倒置顯微鏡、KUBOTA2100離心機（Japan）、EBA12RZentrifugen低溫高速離心機（Beckman公司產品，Germany）、XMTB數(shù)顯調節(jié)儀水浴鍋（浙江余姚工業(yè)儀表二廠產品）、Mini-ProteanⅡ型電泳儀（Bio-Rad公司產品，USA）、TS-1型脫色搖床（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司產品）。

mPEG修飾紅細胞體外穩(wěn)定性檢測

將CPD保存的血比容為35%的20mmol/LmPEG-SPA修飾的ABRhDEeCc紅細胞、ABRhD-全血、RhD血漿分裝，于2-6℃保存并在儲存第1、7、14、21天時取CPD保存的修飾的ABRhDEeCc紅細胞50μl，用間接抗人球蛋白試驗鑒定血型后，分別加入250μl的ABRhD-全血和RhD血漿，以CPD保存的血比容為35%的20mmol/LmPEG-SPA修飾的ABRhDEeCc紅細胞RhD-全血和RhD血漿作為對照，在37℃搖動孵育24小時后，再次檢測血型和血漿游離血紅蛋白。

mPEG修飾的紅細胞血影凝集實驗

取未修飾和修飾的紅細胞各40μl，加10倍體積的PBS（pH7.4），4℃放置30分鐘，3500×g/min離心10分鐘，棄上清，加入600μl的低滲磷酸緩沖液，4℃放置30分鐘，3500×g/min離心10分鐘，棄上清，低滲磷酸緩沖液洗滌4次，3500×g/min離心10分鐘，沉淀即為血影細胞。在血影細胞加入Rhanti-D多抗后，在倒置顯微鏡下觀察結果。

mPEG修飾的紅細胞膜蛋白的SDS-PAGE分析

紅細胞膜蛋白的提取取CPD抗凝血100μl，以2000×g/min10℃離心5分鐘，除去血漿和灰白色血細胞層；另取mPEG-SPA修飾紅細胞約40μl，加預冷的等滲液將沉淀RBC懸浮，以2000×g/min10℃離心5分鐘，除去上清液，如此重復洗滌3遍；按1∶10（v/v）向沉淀RBC中加入預冷的低滲液，混勻后4℃放置至紅細胞完全溶血；以1000×g/min，4℃離心10分鐘，除去上清液，將沉淀在4℃用低滲液6000×g/min離心5分鐘，洗滌3次，獲得白色的RBC膜樣品。

電泳分別配制10%分離膠和基層膠，灌分離膠，37℃放置40分鐘，待膠凝固，灌基層膠，放梳子組裝電泳裝置；將蛋白marker及取得的RBC膜樣品各10μl與5×樣品緩沖液在Eppendorf管中混合；95℃加熱5分鐘，將蛋白變性；用微量加樣槍將樣品加入樣品孔底部；180V恒壓電泳至溴酚藍指示劑移動至電泳膠外。

PEG碘染色［2］將電泳后的膠放入容器內，在搖床上緩慢振蕩的過程中加入20ml0.1mol/L的高氯酸，15分鐘后依次加入5ml5%氯化鋇，2ml0.1mol/L碘溶液。5分鐘后見到碘染的PEG條帶逐漸出現(xiàn)，拍照、記錄結果。

考馬斯亮藍染色將碘染的膠放在蒸餾水中漂洗約20分鐘，碘染條帶逐漸消失；將約20ml考馬斯亮藍染液放入盛膠的容器里，搖床緩慢振蕩約2小時，將染液棄去，再在水中漂洗數(shù)次，然后加入脫色液，脫色的條帶清晰，背景變淺，其中更換脫色液數(shù)次，拍照、記錄結果。

統(tǒng)計學處理

采用SPSS10.0軟件對檢測結果進行Chi-square檢驗。

結果

mPEG修飾紅細胞體外穩(wěn)定性

修飾的ABRhDEeCc紅細胞在儲存過程中和模擬輸血過程（即與全血和血漿混合后于37℃孵育24小時）,Rh血型D、E、e、Ch和c抗原未發(fā)生變化，mPEG修飾紅細胞在保存過程中血漿游離血紅蛋白水平正常，修飾的ABRhDEeCc紅細胞在模擬輸血過程后，游離血紅蛋白未見升高，反而降低，且1組和6組在統(tǒng)計學有顯著差異，1組和7組在統(tǒng)計學同樣有顯著差異（附表）。Table.Plasmafreehemoglobinchangeintheprocessofbloodmixture（略）

mPEG修飾的紅細胞血影凝集

mPEG-SPA修飾前后的紅細胞處理得到的血影和IgGMRhD多克隆抗體，用直接凝集實驗進行鑒定，結果表明mPEG修飾前的紅細胞發(fā)生了凝集，而mPEG-SPA修飾后的紅細胞未發(fā)生凝集（圖1）。

mPEG修飾的紅細胞膜蛋白的SDS-PAGE電泳分析

紅細胞膜蛋白經SDS-PAGE碘和鋇染色后，未修飾紅細胞膜蛋白和蛋白marker均未出現(xiàn)，只有2.0mmol/LmPEG-SPA修飾的紅細胞膜蛋白出現(xiàn)條帶，主要是血影蛋白、條帶3，條帶4.1和4.2及血型糖蛋白（圖2）；紅細胞膜蛋白經SDS-PAGE考馬斯亮藍染色后，蛋白marker、2.0mmol/LmPEG-SPA修飾的、未修飾的紅細胞膜蛋白均出現(xiàn)條帶；未修飾的紅細胞膜條帶3、條帶4.1、條帶4.2、肌動蛋白和血型糖蛋白條帶的遷移速度均快于修飾的紅細胞膜蛋白條帶（圖3）。

討論

mPEG與紅細胞膜只有穩(wěn)定結合，才能保證其輸入人體后不脫落，被修飾的抗原不會暴露，因而不會導致機體產生免疫應答反應。在對重組蛋白、酶、藥物等的應用和研究基礎上發(fā)現(xiàn)，PEG與蛋白分子共價結合后會進一步吸附水分子，使蛋白分子具有一個PEG和水分子包裹親水外殼，這個外殼能有效地遮蔽蛋白質表面的抗原［3］。已有研究結果顯示，Rh血型抗原膜外的1、2、3、4、5環(huán)上均存在與mPEG-SPA發(fā)生反應的氨基酸K、R、H和Y，后者是mPEG共價結合蛋白質氨基酸物質基礎。因此，從理論上講結合應是穩(wěn)定的。由于目前缺乏成熟的修飾紅細胞動物評價模型［4］，因此我們設計了mPEG修飾紅細胞體外穩(wěn)定性實驗，結果表明：不同保存時間的mPEG修飾的紅細胞在模擬輸血即混血前后的血型保持不變，這一結果不僅支持修飾的紅細胞血型在體外不變，而且也提示其進入體內應是穩(wěn)定的；同時mPEG修飾的紅細胞在保存過程中游離血紅蛋白水平正常，并且混血后經37℃孵育的mPEG修飾的紅細胞游離血紅蛋白水平低于不混合的修飾紅細胞，這不僅說明mPEG與紅細胞的結合是穩(wěn)固的，同時表明全血和血漿與保存期間的mPEG修飾紅細胞混合，不僅不會導致紅細胞結構和功能損傷，而且有利于mPEG修飾紅細胞功能維持和恢復，mPEG仍穩(wěn)固與紅細胞結合起著遮蔽抗原的作用。已知，SDS-PAGE電泳分析可以顯示紅細胞膜上分子量從15000-250000的15種主要蛋白，包括血影蛋白（spectrin，MW：240000；220000）、錨蛋白（ankyrin）、條帶3(MW：100000)、條帶4.1、條帶4.2、肌動蛋白（actin）和血型糖蛋白(glycophorin，MW:30000）［5］。

Scott等［6］研究結果表明，與mPEG結合的膜蛋白會由于分子量的改變使電泳的帶型發(fā)生變化，并且表現(xiàn)出劑量依賴性；而且已有的結果也表明，mPEG可以與紅細胞膜蛋白血影蛋白、條帶3、條帶4.1、條帶4.2、肌動蛋白和血型糖蛋白結合［7］。本研究中對保存期21天mPEG-SPA修飾的紅細胞膜蛋白經SDS-PAGE電泳后，先用碘染色，脫色后再用考馬斯亮藍染色，比較分析PEG特異的碘染和考馬斯亮藍染色顯色圖譜，發(fā)現(xiàn)特殊的碘染色可以顯示出mPEG與紅細胞膜蛋白結合的條帶，mPEG-SPA與紅細胞膜蛋白結合后導致蛋白分子遷移速度發(fā)生改變。這一結果證實了mPEG-SPA即使在紅細胞膜蛋白被單獨提取后仍與與紅細胞膜蛋白穩(wěn)固結合的。依據(jù)血影仍保持有抗原性，且可與相應抗體結合產生凝集現(xiàn)象的原理，我們的mPEG修飾的紅細胞血影凝集實驗不僅證實了修飾紅細胞在質膜裂損后血影抗原仍能與mPEG結合，而且mPEG仍可有效地遮蔽抗原，使抗原不與相應抗體結合而不發(fā)生凝集現(xiàn)象，這一結果進一步證實mPEG-SPA與紅細胞膜穩(wěn)固結合。

【參考文獻】

1Nektarcompany.PolyethyleneglycolandderivativesforadvancedPEGylation.MolEnginCatal,2003:1-19

2KurfurstMM.Detectionandmolecularweightdeterminationofpolyethyleneglycol-modifiedhirudinbystainingaftersodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis.AnalBiochem,1992;200:244-248

3AbuchowskiA,van-EsT,PalczukNC,etal.Alterationofimmunologicalpropertiesofbovineserumalbuminbycovalentattachmentofpolyethyleneglycol.JBiolChem,1977;252:3578-3581

4邱艷，檀英霞，李立立等.PEG修飾紅細胞的動物實驗.中國實驗血液學雜志，2006;14:816-821

5汪堃仁.細胞生物學.北京：北京師范大學出版社.1988：61-63

6ScottMD,MuradKL,KoumpourasF,etal.Chemicalcamouflageofantigenicdeterminants:stealtherythrocytes.ProcNatlAcadSciUSA,1997;94:7566-7571

7LuanneLP.GeneticControlofBloodFormation.4thInternationalWorkshoponMonoclonalAntibodiesagainstHumanredBloodCellsandRelatedAntigens,Paris2001：Section1B-RhFlowCytometry-Version1.1.