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【摘要】1998年6月至2004年7月，廣州臍血庫向國內21家移植中心54例患者提供了非親緣性異基因臍血。為了探討非親緣性臍血移植供/受者hla等位基因及其亞型與臍血移植GVHD發(fā)生率的關系，對54例非親緣性臍血移植病例中，半年后有反饋隨訪資料的48例，利用鹽析或柱提法提取移植的非親緣性臍血的DNA及移植病例的全血DNA，采用HLA-SBT方法分別對HLA-A、B、DRB1位點進行了高分辨分型，并與我?guī)炷氀占Ｒ?guī)采用的HLA-SSP（HLA-Sequencingspecificprimers）低分辨結果進行了比較分析。結果發(fā)現(xiàn)，HLA不合位點不多于2個和HLA不合位點不少于3個的病例GVHD的發(fā)生率具有統(tǒng)計學顯著性差異（P<0.05）。在對HLA-A、B、DRB1等位基因高分辨單因素分型結果中，HLA-B和HLA-DRB1等位基因匹配全相合的病例GVHD發(fā)生率顯著低于不完全相合病例GVHD的發(fā)生率（P=0.000，P=0.005）。結論：PCR-SBT技術在非親緣性臍血移植HLA配型方面具有重要的臨床應用價值。

【關鍵詞】非親緣性臍血移植；HLA配型;HLA測序技術；HLA-SBT；臍血

ClinicalApplicationofHLASequencinginUnrelatedUmbilicalCordBloodTransplantation

AbstractFromJune1998toJuly2004,Guangzhouumbilicalcordbloodbankprovidedunrelatedumbilicalcordbloodfor54patientstomorethan21transplantationcenters.HLAsequencing-basedtyping(SBT)wasusedtore-analyzetheresultsofHLAantigensandallelessoastoinvestigatetherelationshipbetweenHLAallelesandGVHD.Theinformationabout48outof54patientswasobtainedafter6monthsoffollowup.SBTwasusedtoidentifyHLA-A,B,DRB1allelesin48patientsreceivedtheunrelatedumbilicalcordbloodunits,andtheobtainedresultswerecomparedwiththeresultsofHLA-SSPLowResolutionTyping.TheresultsshowedthatthedifferenceofGVHDincidencebetweenlessthan2mismatchedHLAsitesandlessthan3siteswasstatisticallysignificant(P<0.05).Intheresultsfromsinglefactoranalysisandhigh-resolutiontypingofHLA-A,BandDRB1alleles,themismatchbetweenHLA-BandHLA-DRB1alleleswasfoundtobeasignificantfactorfortheoccurenceofGVHD.ItisconcludedthatSBTplaysanimportantroleinumbilicalcordbloodtransplantation,andtheincidenceofGVHDishigherinthetransplantationwithHLA-DRB1allelesmismatching.

Keywordsunrelatedumbilicalcordbloodtransplantation;HLAmismatch;HLAsequencing;HLAsequencingbasedtyping;umbilicalcordblood

HLA高分辨分型技術不僅可以對HLA血清學配型起到積極的校正作用，對研究哪些HLA等位基因相合可以明顯減弱GVHD，哪些等位基因不相合可以耐受等方面以及制定相對個體化的HLA配型策略都具有重要的臨床應用價值。在骨髓造血干細胞移植中，HLA測序分型技術得到了廣泛的應用和發(fā)展，在預防GVHD方面具有十分重要的意義。本研究采用以測序為基礎的HLA分型技術（HLA-sequencingbasedtypingHLA-SBT）對可隨訪的48例非親緣性臍血移植病例HLA配型結果進行回顧性分析，以探討HLA-A/B/DRB1等位基因匹配程度對非親緣性臍血移植GVHD的影響。

材料和方法

臍血來源

臍血樣本全部來自廣州臍血庫，臍血分離、冷凍、保存以及相關檢測參考相關文獻［2］。

移植供受體選擇

54例非親緣性臍血移植供受者樣本及隨訪資料由國內21家移植中心提供，其中6例待隨訪，選擇48例非親緣性臍血移植病例進行回顧性分析，移植受者一般情況見表1。Table1.Generalcharacteristicsof48UCBTrecipients（略）

急性移植抗宿主?。╝GVHD）的預防

48例移植病人均采用環(huán)孢霉素甲基強的松龍方案預防aGVHD。

移植供/受體的DNA提取

移植供/受體DNA提取均采用G&TDNA提取試劑盒。

HLA-SSP分型

采用OneLambda公司的HLA-SSP分型試劑盒、PE9700PCR儀進行分型，采用OneLambda公司提供的HLA分型格局表判讀結果。

HLA-SBT分型

應用ABIPRISM3100型測序儀進行分型。DNA4μl與PCRMix（Forensic公司提供）16μl混合，再加入金牌酶0.3μl進行擴增反應。PCR條件如下：95℃10分鐘；96℃20秒，60℃30秒，72℃3分鐘，36個循環(huán)；4℃forever。取PCR產物5μl在2%瓊脂糖凝膠中電泳，確定是否擴增。向PCR產物中加入3μlExoSAP-IT,進行消化反應：37℃20分鐘，80℃15分鐘。消化后產物與SequencingMix混合后，進行測序反應：96℃20秒，60℃2分鐘，共25個循環(huán)。測序反應產物用NaOAc/EDTA去除多余的SequencingMix，并用100%及80%EtOH沉淀和純化DNA。加入15μl甲酰胺，置于ABTPrism3100測序儀中進行電泳。利用MatchTools及MTNavigator軟件對電泳結果進行分析，得出HLA高分辨配型結果。

統(tǒng)計學分析

數(shù)據用SPSS10.0統(tǒng)計軟件包處理，行chi-squaretest分析。結果

PCR-SBT技術分型

48例非親緣性臍血移植供受者HLA-A/B/DR采用PCR-SBT技術分型全部成功，SBT分型結果在低分辨水平（HLA基因型星號后2位數(shù)）與SSP分型結果完全一致。48例非親緣性臍血移植供受者中，HLA等位基因6/6相合4例（8.3%），5/6相合37例（77.1%），4/6相合7例（14.6%）；HLA等位基因亞型匹配5/6相合5例（10.4%），4/6相合16例（33.3%），3/6相合19例（39.6%），2/6相合8例（16.7%），未發(fā)現(xiàn)HLA等位基因亞型配型全相合病例。

SBT分型結果與GVHD發(fā)生率

48例非親緣性臍血移植供/受者HLA等位基因分型結果中，HLA等位基因匹配6/6、5/6和4/6位點相合的移植受者GVHD分別發(fā)生4/4例、18/37例（48.6%）和5/7例（71.4%），統(tǒng)計分析（chi-squaretest），HLA匹配程度與GVHD發(fā)生率之間無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。48例非親緣性臍血移植受者中，植入33例，HLA等位基因亞型匹配5/6相合的2例移植病例均未發(fā)生GVHD，而4/6、3/6、2/6位點相合的移植病例GVHD發(fā)生率分別為54.5%（6/11）、91.7%（11/12）和75.0%（6/8），統(tǒng)計分析（chi-squaretest），HLA等位基因亞型不合位點不多于2個和HLA不合位點不少于3個的病例GVHD發(fā)生率具有統(tǒng)計學顯著性差異（P<0.05）。在HLA-A等位基因亞型分型結果中，HLA-A等位基因亞型匹配0/2、1/2和2/2相合病例分別為11、28和9例，GVHD發(fā)生率分別為27.3%（3/11）、57.1%（16/28）和55.6%（5/9），統(tǒng)計分析未發(fā)現(xiàn)HLA-A等位基因亞型匹配完全相合與不完全相合GVHD發(fā)生率具有統(tǒng)計學顯著差異（P=0.061）（表2）。Table2.RelationshipbetweenHLAmismatchandoccurrenceofGVHDin48UCBTrecifients（略）

在HLA-B等位基因亞型分型結果中，HLA-B等位基因亞型匹配0/2、1/2和2/2位點相合病例分別為11、33、4例，GVHD發(fā)生率分別為72.7%（8/11）、45.5%（15/33）和50%（2/4），統(tǒng)計分析未發(fā)現(xiàn)HLA-B等位基因亞型匹配完全相合與不完全相合GVHD發(fā)生率具有統(tǒng)計學顯著差異（P=0.000）（表2）。在HLA-DRB1等位基因亞型分型結果中，HLA-DRB1等位基因亞型匹配0/2、1/2和2/2位點相合病例分別為16、25和7個，其GVHD發(fā)生率分別為25%（4/16）、64.0%（16/25）和71.4%（5/7）。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，HLA-DRB1等位基因亞型相合與否與GVHD發(fā)生率具有強相關性（P=0.003）（表2）。在38例HLA-DRB1等位基因全相合病例中，HLA-DRB1等位基因亞型匹配0/2、1/2和2/2位點相合病例分別為16、18和4個，GVHD發(fā)生率分別為25%（4/16）、61.1%（11/18）和50%（2/4）；經統(tǒng)計學分析，比較HLA-DRB1等位基因亞型相合與不相合與GVHD發(fā)生率具有顯著的統(tǒng)計學相關性（P=0.008）。

與GVHD相關的HLA等位基因亞型

在本回顧性研究中，HLA-A常見等位基因型為HLA-A*02、A*11和A*24，HLA-B常見等位基因型為HLA-B*15、B*40和B*46，HLA-DRB1常見等位基因型為HLA-DRB1*09、DRB1*12和DRB1*15（表3）。

Table3.HLA-A/B/DRB1matchingandoccurrenceofGVHDbyPCR-SBT（略）

剔除兩點不合的樣本，選擇受體與供體一個位點相合而另一位點不合的病例，比較其GVHD發(fā)生率。HLA-A*02、A*11和A*24基因型分別有19例、21例和13例；HLA-B*15、B*40和B*46基因型分別有20例、13例和14例；HLA-DRB1*09、DRB1*12和DRB1*15基因型分別有11例、10例和13例（表3）。經統(tǒng)計分析，HLA-A*11匹配與不匹配樣本GVHD發(fā)生率分別為28.6%和64.3%，HLA-B各等位基因型匹配情況GVHD發(fā)生率未見明顯差異，HLA-DRB1*12相合3例病例均未發(fā)生GVHD，而不相合的7例病例中有2例發(fā)生了GVHD。經統(tǒng)計分析（chi-squaretests）HLA-A/B/DRB1各個等位基因匹配程度與GVHD發(fā)生率未見統(tǒng)計學相關性。

討論

有研究表明，單個等位基因的不匹配（如白種人HLA-A*0201和HLA-A*0205亞型）可以引起嚴重的GVHD；也有報道DRB1等位基因不同與GVHD之間存在強相關性，而且DRB1不合與存活期縮短密切相關［2］。但是現(xiàn)在的研究表明，并不是所有等位基因不同與它的不相合是一致的，有些HLA等位基因的不相合是可以耐受的。在Nicholson等［3］對HLA-DP抗原的報道中，采用混合淋巴細胞培養(yǎng)（mixedlymphocyteculture,MLC）方法觀察到最強烈的MLR反應與DPB1*0301和DPB1*0201有關，低MLR與DPB1*0401和DPB1*0402有關。提高HLA基因分型的分辨率，有助于尋找HLA完全相合的造血干細胞供者，也有助于針對供、受間HLA差異程度制定相應的防治策略。因此，有人提出界定供、受者HLA相合的標準。找出究竟哪些HLA基因座位（及其產物）在決定異基因造血干細胞移植預后中起關鍵作用，哪些HLA（等位基因）型別不相合為臨床所容許，甚至可能對病例的預后有益［9］。本研究采用HLA-SBT方法對48例非親緣性臍血移植供/受體HLA等位基因亞型進行分析，HLA低分辨配型結果中，HLA等位基因匹配程度與GVHD發(fā)生率無顯著統(tǒng)計學相關性。對HLA-A、B、DRB1等位基因亞型分別進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，HLA-B和HLA-DRB1等位基因亞型完全相合和不相合的病例GVHD發(fā)生率具有非常顯著的差別。需要特別指出的是，在本研究結果中，HLA不相合等位基因亞型不多于2個和HLA不相合位點不少于3個的病例GVHD的發(fā)生率差異具有統(tǒng)計學顯著性（P<0.05）。以上結果從兩方面給我們以提示：①HLA等位基因亞型水平的匹配對預防GVHD具有積極的作用；②一定存在某些HLA等位基因亞型，其相合與否對臍血移植病例來說在某種程度上是可以耐受的。從結果中我們可以看到，在HLA高分辨配型結果中，HLA-B和HLA-DRB1等位基因亞型匹配與否與GVHD發(fā)生率具有強相關性（P=0.000，P=0.003）。HLA-A等位基因亞型匹配全相合病例GVHD發(fā)生率（27.3%）明顯低于HLA匹配不全相合病例(59.4%)。這說明在非親緣性臍血移植中，采用高分辨方法進行HLA-B和HLA-DRB1配型可以明顯減弱GVHD的發(fā)生率。由于樣本數(shù)較少，因此對以上結論仍然需要進行隨訪分析。從本結果中可以推測，HLA等位基因匹配與否對非親緣性臍血移植者GVHD的發(fā)生具有重要作用，臍血移植者GVHD的發(fā)生率低，究其原因可能與臍血中免疫細胞的抗原性低有關。因此，非親緣性臍血移植時對HLA采用高分辨分型是有必要的。本研究的另一個目的是試圖尋找出與GVHD發(fā)生密切相關的HLA等位基因型，但由于病例數(shù)較少，無法對HLA所有等位基因型在非親緣性臍血移植的作用進一步深入分析。我們選擇了HLA-A/B/DRB1位點中比較常見的亞型進行統(tǒng)計分析，從統(tǒng)計結果中我們未發(fā)現(xiàn)與GVHD具有明顯相關性的等位基因型。在本研究結果中，HLA-A*11等位基因相合病例的GVHD發(fā)生率（25%）明顯低于不相合病例的GVHD發(fā)生率（58.3%），由于病例數(shù)少，無法進一步分析HLA-A*11等位基因亞型對GVHD的影響。但我們可以設想，如果將來在移植前HLA復核時對HLA-A11采用HLA高分辨方法，可能會降低移植后GVHD發(fā)生率。雖然我們發(fā)現(xiàn)HLA-DRB1等位基因與GVHD發(fā)生率具有強相關性，但是我們未能找到與GVHD明顯相關的等位基因亞型，其原因也是由于病例數(shù)太少的緣故。

致謝：感謝中山醫(yī)科大學孫逸仙醫(yī)院、廣州市第一人民醫(yī)院、廣州市婦嬰醫(yī)院、北大人民醫(yī)院、北京兒童醫(yī)院、安徽省立醫(yī)院、河南省腫瘤醫(yī)院、南方醫(yī)院、暨大華僑醫(yī)院、第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院、第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院、廣東省人民醫(yī)院、四川大學華西醫(yī)院、上海兒童醫(yī)學中心、北大深圳醫(yī)院、?？谑腥嗣襻t(yī)院、廣州市第十二人民醫(yī)院、佛山人民醫(yī)院和廣東省117醫(yī)院給予的支持和協(xié)作。

【參考文獻】

1SantamariaP,Boyce-JacinoMT,LindstromAL,etal.HLAclassⅡ“typing”:directsequencingofDRB,DQBandDQAgenes.HumImmunol,1992;33:69-81

2PetersdrfEW,LongtonGM,AnasettiC,etal.ThesignificanceofHLA-DRB1matchingonclinicaloutcomeafterHLA-A,B,DRidenticalunrelateddonormarrowtransplantation.Blood,1995;86:1605-1613

3LoiseauP,EsperouH,BussonM,etal.DPB1disparitiescontri-butetosevereGVHDandreducedsurvivalafterunrelateddonorbonemarrowtransplantation.BoneMarrowTransplant,2002;30:497-502

4楊文莉.HLA配型在異基因骨髓移植中的研究進展.西安醫(yī)科大學學報,2000;21:611-614

5PetersdorfEW,AnasettiC,MartinPJ,etal.Tissuetypinginsupportofunrelatedhematopoieticcelltransplatation.TissueAntigens，2003;61:1-11

6HurleyCK.HLAdiversity:detectionandimpactonunrelatedhematopoieticstemcelldonorcharacterizationandselection.IntJHematol,2002；76(Suppl2):152-154

7MickelsonEM,PetersdorfE,AnasettiC,etal.HLAmatchinginhematopoieticcelltransplantation.HumImmunol,2000;61:92-100

8MorishimaY,SasazukiT,InokoH,etal.Theclinicalsignificanceofhumanleukocyteantigen(HLA)allelecompatibilityinpatientsreceivingamarrowtransplantfromserologicallyHLA-A,HLA-BandHLA-DRmatchedumrelateddonors.Blood,2002;99:4200-4206

9PapassavasAC,BarnardoMC,BunceM,etal.IsthereMHCclassⅡrestrictionoftheresponsetoMHCclassⅠintransplantationpatients?Transplantation,2002;73:642-651