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作者：吳林青,許偉群,張秋玉,胡海霞,祝先進,蘇東輝

【摘要】目的觀察鱟抗脂多糖因子(LALF)對小鼠巨噬細胞晚期炎癥因子高遷移率族蛋白1(HMGB1)功能的拮抗效應,探討LALF對晚期內(nèi)毒素血癥動物的保護機制。方法用HMGB1刺激小鼠腹腔巨噬細胞,加入或不加LALF,遷移實驗檢測巨噬細胞趨化作用,ELISA檢測培養(yǎng)上清液中腫瘤壞死因子(TNF)α濃度。結(jié)果巨噬細胞遷移指數(shù)的增加呈HMGB1劑量依賴性,HMGB1刺激后巨噬細胞培養(yǎng)上清液TNFα濃度顯著增高。LALF與HMGB1預混合顯著降低巨噬細胞的遷移指數(shù)和培養(yǎng)上清液TNFα濃度。結(jié)論LALF可能通過抑制HMGB1而發(fā)揮其對晚期膿毒癥動物的保護作用。

【關(guān)鍵詞】高遷移率族蛋白;膿毒癥;鱟抗脂多糖因子；趨化作用

ABSTRACT:ObjectiveToinvestigatetheeffectsoflimulusantilipopolysaccharidefactor(LALF)onthelateproinflammatorycytokineofhighmobilitygroupbox1(HMGB1).MethodsTheprimarymousemacrophageswereculturedandstimulatedbyHMGB1.Macrophagemigrationwasdeterminedbytheuseofchemotaxischamber.ELISAquantitatedtheculturesupernatantsforTNFαproduction.LALFwasaddedtoexploretheeffectsofHMGBIandTNFαproductioninculture.ResultsThechemotacticindexofmacrophagesandtheconcentrationofTNFαintheculturesupernatantsevidentlyincreasedindosedependentmannerinHMGB1groupsandprominentlydecreasedbytheLALFcoincubated.ConclusionHMGB1wasfirstlyindicatedinthisstudytobedirectlyinhibitedbyLALFinlatecourseofendotoxemia.

KEYWORDS:highmobilitygroupproteins;sepsis;macrophage;horseshoecrabs;lipopolysaccharides;tumornecrosisfactoralpha;inflammation

膿毒癥是重癥監(jiān)護病房病人常見的死因。腫瘤壞死因子(TNF)α、白細胞介素(IL)1等促炎癥因子曾被普遍認為是引起膿毒癥死亡的“核心因子”[1],以往認為在這些促炎癥因子達峰以后再給予抗內(nèi)毒素的治療難以逆轉(zhuǎn)膿毒癥的病程。具有重要意義的是,Levin實驗室給致死量細菌內(nèi)毒素即脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)攻擊后4，10h甚至24h的Swiss小鼠注射天然鱟抗脂多糖因子(limulusantilipopolysaccharidefactor,LALF)，實現(xiàn)了對動物晚期膿毒癥的有效保護[2],提示LALF可能對促炎癥因子消退后的某個或某些晚期介質(zhì)起拮抗作用。1999年,Wang等發(fā)現(xiàn)高遷移率族蛋白1(highmobilitygroupbox1,HMGB1或HMG1)是膿毒癥致死性全身反應的一種重要的晚期促炎性因子[3]。本研究以體外培養(yǎng)的小鼠巨噬細胞為實驗對象,觀察LALF對HMGB1部分生物學活性的影響,探討LALF對膿毒癥晚期的實驗動物發(fā)揮保護作用的機制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動物昆明種小鼠,雄性,體質(zhì)量20～25g[福建醫(yī)科大學實驗動物中心,許可證號scxk(閩)20050003]。飼以標準飼料,隨意飲水。

1.1.2主要試劑RPMI1640培養(yǎng)基、PBS平衡鹽溶液(美國Hyclone公司)。E.coliO55:B5LPS、重組HMG1(美國Sigma公司)。48孔微遷移板(AP48,美國NeuroProbe公司)。TNFαELISA試劑盒(深圳晶美生物工程有限公司)。LALF（美國麻薩諸塞州Woodhole海洋生物實驗室Wainright博士惠贈）。大鼠抗小鼠TLR2(IgG)FITC及正常大鼠IgGFITC(美國SantaCruz公司)。

1.2方法

1.2.1小鼠腹腔巨噬細胞制備頸椎脫臼處死小鼠,以PBS腹腔灌洗法收集腹腔巨噬細胞懸液,1500r/min(4℃)離心10min,棄上清,洗滌1次,用含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為1×106mL-1,根據(jù)需要接種于24孔(1mL/孔)或6孔(2mL/孔)細胞培養(yǎng)板中,置37℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h后去除未貼壁細胞換液繼續(xù)培養(yǎng)備用。

1.2.2趨化實驗參照文獻[45]方法。將含不同濃度HMGB1的無血清培養(yǎng)液25μL加入下室,同時以細胞稀釋液作為陰性對照。另一組在趨化板下室的細胞中加入不同濃度LALF與HMGB1預混合培養(yǎng)液,同時設(shè)單獨培養(yǎng)液、單獨LALF和單獨HMGB1對照組。再將1片5μm孔徑的聚碳酸酯膜覆蓋在小室上,最后將巨噬細胞(1×106mL-1)50μL加入到上室中,置于37℃、體積分數(shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中孵育90min。孵育后聚碳酸酯膜用甲醇固定并進行考馬斯亮藍染色。在光學顯微鏡下用高倍鏡計數(shù)5個視野下的遷移細胞數(shù),結(jié)果用遷移指數(shù)表示:

遷移指數(shù)＝試驗組遷移的細胞數(shù)/對照組遷移的細胞數(shù)

一式3份,重復3次實驗。

1.2.3ELISA檢測培養(yǎng)上清液的TNFα濃度小鼠腹腔巨噬細胞接種于24孔細胞培養(yǎng)板,在不同時間加入含1μg/mLHMGB1的培養(yǎng)液,設(shè)單獨培養(yǎng)液的對照組。另一組細胞加入不同濃度LALF與HMGB11μg/mL預混合培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)8h,設(shè)單獨培養(yǎng)液、單獨LALF、單獨HMGB1的對照組。吸取培養(yǎng)上清,用雙抗體夾心ELISA法檢測TNFα含量,操作方法按說明書進行。一式3份,重復3次。

1.3統(tǒng)計學處理測定結(jié)果數(shù)據(jù)以x±s表示,采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行分析,組間差異以單因素方差分析進行檢驗,P<0.05為差別具有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1LALF對HMGB1誘導巨噬細胞趨化作用的影響

2.1.1HMGB1對巨噬細胞趨化作用的誘導HMGB1顯著提高小鼠腹腔巨噬細胞的遷移指數(shù),其峰值所對應的HMGB1濃度為1μg/mL。在0.1～1μg/mL濃度區(qū)間,HMGB1的效應呈劑量依賴性(圖1)。

HMGB1:晚期炎癥因子高遷移率族蛋白1.與HMGB10μg/mL對照組比較,☆:P<0.01.

圖1不同濃度HMGB1對巨噬細胞遷移的作用（略）

Fig1EffectofHMGB1onmacrophagemigration

2.1.2LALF對HMGB1誘導趨化作用的影響不同濃度LALF(5,10,15μg/mL)與1μg/mLHMGB1預混合巨噬細胞遷移試驗顯示,LALF顯著降低巨噬細胞的遷移指數(shù),這種抑制效應呈LALF劑量依賴性。單獨LALF對巨噬細胞的遷移指數(shù)無影響(圖2)。

2.2LALF對HMGB1誘導巨噬細胞分泌TNFα的影響

2.2.1HMGB1對巨噬細胞分泌TNFα的誘導對照組單獨使用培養(yǎng)液刺激小鼠腹腔巨噬細胞產(chǎn)生TNFα(35±5)pg/mL。加入1μg/mLHMGB14,8,24h測定值分別為(725±35),(839±30),(586±40)pg/mL,各組與對照組比較,差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

A:單獨培養(yǎng)液;B:LALF15μg/mL;C:HMGB11μg/mL;D:HMGB11μg/mL+LALF5μg/mL;E:HMGB11μg/mL+LALF10μg/mL;F:HMGB11μg/mL+LALF15μg/mL.與C組比較,☆:P<0.05,☆☆:P<0.01.

圖2LALF對HMGB1誘導巨噬細胞遷移作用的影響（略）

Fig2RoleofLALFonmacrophagemigrationinducedbyHMGB1

2.2.2LALF對HMGB1誘導巨噬細胞分泌TNFα的影響LALF(5,10,15μg/mL)與1μg/mLHMGB1預混合后可劑量依賴性地降低TNFα的釋放,與單獨HMGB1的對照組比較,差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。單獨培養(yǎng)液和單純LALF刺激小鼠腹腔巨噬細胞產(chǎn)生TNFα量極低(圖3)。

HMGB1:晚期炎癥因子高遷移率族蛋白1.TNFα：腫瘤壞死因子α.A:單獨培養(yǎng)液;B:LALF15μg/mL;C:HMGB11μg/mL;D:HMGB11μg/mL+LALF5μg/mL;E:HMGB11μg/mL+LALF10μg/mL;F:HMGB11μg/mL+LALF15μg/mL.與C組比較,☆:P<0.01.

圖3LALF對HMGB1誘導巨噬細胞分泌TNFα的影響（略）

Fig3EffectofLALFonTNFαsecretioninducedbyHMGB1

3討論

3.1LALF對實驗動物晚期膿毒癥的保護作用膿毒癥指的是由感染引起的全身炎癥反應,LPS等成分刺激免疫細胞釋放過量的炎癥因子是膿毒癥死亡的主要原因[6]。鱟抗脂多糖因子是從北美馬蹄蟹(美洲鱟)變形細胞提取純化的一種蛋白質(zhì),已知它具有中和內(nèi)毒素的作用,因此稱為內(nèi)毒素中和蛋白。資料顯示,經(jīng)典的促炎癥因子TNFα和IL1等在LPS攻擊后1～3h達峰并迅速衰減,6h基本回落至正常水平[7]。動力學研究也表明,在腹腔注射LPS后24h時TNFα血漿濃度下降到峰值的1/10[8]。在促炎癥因子消退后給予LALF顯然對已知促炎癥因子的產(chǎn)生及其直接效應不起對抗作用。因此有理由推測除了具有中和內(nèi)毒素的活性外LALF可能對某種或某些晚期介質(zhì)、凝血系統(tǒng)、補體系統(tǒng)等的產(chǎn)生和效應起拮抗作用。

3.2HMGB1對內(nèi)毒素致死性的晚期介質(zhì)作用HMGB1是一種相對分子質(zhì)量30kD的蛋白,長期以來對其認識主要局限于它是一種DNA結(jié)合蛋白,起著維持核小體結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的作用。由于其介導炎癥反應、參與細胞因子網(wǎng)絡調(diào)節(jié)的效應不斷被發(fā)現(xiàn),現(xiàn)在許多學者已經(jīng)將HMGB1作為一個特殊成員歸屬于促炎性細胞因子。與經(jīng)典的促炎癥因子相比,HMGB1具有分泌晚、持續(xù)時間長的特點,因而被界定為晚期炎癥介質(zhì)。許多實驗證實HMGB1在膿毒癥休克中的重要性：(1)膿毒癥動物模型、感染及膿毒癥引起的器官功能障礙的病人血清中HMGB1水平明顯升高[9]。(2)給小鼠注射重組HMGB1,出現(xiàn)膿毒癥的典型臨床癥狀,包括發(fā)熱、不適、腸上皮屏障功能紊亂以及多器官功能障礙等[10]。(3)給予HMGB1抗體能有效預防膿毒癥的發(fā)生,甚至逆轉(zhuǎn)膿毒癥的病理過程[11]。

3.3LALF對HMGB1體外效應的拮抗作用巨噬細胞是白細胞中功能最為活躍的細胞之一,對內(nèi)毒素具有強烈的反應性,是機體產(chǎn)生細胞因子及炎癥介質(zhì)的主要細胞。膿毒癥時,LPS及TNFα均可促進單核巨噬細胞等免疫細胞分泌晚期介質(zhì)HMGB1。本研究用體外實驗顯示,HMGB1可進一步反作用于巨噬細胞引起TNFα分泌,構(gòu)成了炎癥因子間的正反饋調(diào)節(jié),擴大和促進了炎癥反應。大量研究已經(jīng)證實,HMGB1是引起死亡的晚期介質(zhì),在膿毒癥發(fā)病過程中具有重要作用?？梢栽O(shè)想,體內(nèi)HMGB1促進炎癥細胞的趨化作用可能是動物死亡的重要原因之一。同樣,推想LALF控制晚期炎癥反應的作用機制可能在于LALF對HMGB1這一致死性介質(zhì)的效應具有抑制作用,表現(xiàn)為LALF可抑制HMGB1誘導的巨噬細胞的趨化作用,以及HMGB1誘導巨噬細胞分泌TNFα等,從而產(chǎn)生對實驗動物的保護作用。這些推想有待實驗動物的體內(nèi)實驗加以證實。

本研究發(fā)現(xiàn)LALF可在體外抑制HMGB1的效應,提示其在動物晚期膿毒癥中的保護作用的一個可能的機制。這些研究結(jié)果為進一步發(fā)現(xiàn)、研究LALF在調(diào)節(jié)免疫防御方面的功能提供了啟發(fā),同時也可能為細菌感染時調(diào)節(jié)天然免疫和炎癥反應提供了新的治療策略。

(鳴謝:美國馬薩諸塞州Woodhole海洋生物實驗室Wainright博士惠贈本實驗關(guān)鍵試劑LALF,舊金山加州大學Levin博士對本課題的指導與支持。)

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