導(dǎo)語(yǔ)：當(dāng)歸注射液對(duì)免疫誘導(dǎo)再障小鼠骨髓微環(huán)境及IL一文來(lái)源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

【關(guān)鍵詞】再生障礙性貧血

再生障礙性貧血(aplasticanemia,AA)是血液系統(tǒng)常見(jiàn)疾病，傳統(tǒng)的治療方法效果欠佳，臨床死亡率高。因此，對(duì)AA發(fā)病機(jī)制的研究以及尋找有效的治療藥物具有重要的理論和實(shí)踐意義。目前對(duì)于AA，國(guó)內(nèi)多采用中西醫(yī)結(jié)合治療。當(dāng)歸是著名常用中藥，具有養(yǎng)血活血作用［1］，過(guò)去多用于治療腰腿痛和婦科疾病，隨著臨床研究的進(jìn)展，其應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大。作為補(bǔ)血中藥，其在血液系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用及研究也日漸增多。至目前為止，有關(guān)當(dāng)歸在血液系統(tǒng)的藥理作用基本歸納為：①抑制血小板聚集及抗血栓形成；②刺激骨髓造血；③促進(jìn)免疫功能恢復(fù)；④抗輻射損傷等。武漢大學(xué)人民醫(yī)院兒科從1991年起將當(dāng)歸注射液用于臨床治療AA，取得較好的療效［2］。但該藥治療AA的實(shí)驗(yàn)研究卻少有報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)用當(dāng)歸注射液對(duì)免疫誘導(dǎo)AA小鼠進(jìn)行干預(yù)治療，觀察其對(duì)AA小鼠體重、外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、骨髓單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)、骨髓微環(huán)境等的影響，并從分子水平研究其作用機(jī)制，進(jìn)一步為臨床應(yīng)用該藥治療AA提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

11材料

111動(dòng)物雌性Balb/c小鼠(H2a、MLSb)8~12周齡，17~20g，由武漢生物制品研究所提供。DBA/2小鼠(H2a、MLSa)8~10周齡，雌雄不拘，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。

112藥品、試劑及來(lái)源25%當(dāng)歸注射液由武漢大學(xué)中南醫(yī)院藥劑科提供，批號(hào)：0303131，每毫升含當(dāng)歸生藥0.25g。大鼠抗小鼠CD49dRPE單克隆抗體、CD49eFITC單克隆抗體、羊抗大鼠IgGFITC熒光抗體、大鼠抗小鼠細(xì)胞周期蛋白D2單克隆抗體、溴化丙啶(PI)、RnaseA、Triton100均購(gòu)自深圳晶美公司。Ficoll干粉、人淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

113試劑配制

(1)0.01mol/L磷酸生理鹽水(phosphatebuffersaline,PBS)的配制：

磷酸氫二鈉(Na2HPO4)：3.48g；氯化鉀(KCl)：0.2g；磷酸二氫鉀(KH2PO4)：0.2g；氯化鈉(NaCl)：8.0g。加入1L雙蒸水稀釋后濾紙過(guò)濾，消毒，4℃冰箱保存待用。

(2)小鼠淋巴細(xì)胞分離液的配制：

Ficoll干粉2.1g加入20ml雙蒸水，配成10.5%溶液，過(guò)濾待用，用人淋巴細(xì)胞分離液100ml加入配制好的10.5%Ficoll溶液7ml，配成小鼠淋巴細(xì)胞分離液。過(guò)濾消毒，4℃冰箱避光保存待用。

(3)臺(tái)盼藍(lán)的配制：

4%臺(tái)盼藍(lán)母液：取4g臺(tái)盼藍(lán)溶入100mlPBS中，過(guò)濾消毒，4℃冰箱保存待用。工作濃度為0.4%。

114主要儀器(1)AIRTECH超凈工作臺(tái)：江蘇安泰空氣凈化技術(shù)公司生產(chǎn)；(2)網(wǎng)格測(cè)微器：購(gòu)自上海森雄公司；(3)博賽酶標(biāo)儀。

12動(dòng)物模型的制備與分組

121免疫誘導(dǎo)再生障礙性貧血小鼠模型的建立參照姚軍等［3］方法，取DBA/2小鼠，斷頸處死，常規(guī)75%酒精消毒，無(wú)菌取出胸腺及頸部、頜下、腋窩、腹股溝、腸系膜等處淋巴結(jié)，加少量生理鹽水，輕輕磨碎，過(guò)濾后用1ml注射器抽取，并將此液沿管壁緩慢加入裝有配制好的小鼠淋巴細(xì)胞分離液的試管中，置水平離心機(jī)離心，轉(zhuǎn)速2000轉(zhuǎn)/分，20分鐘后取出，可見(jiàn)淋巴細(xì)胞懸液在中間層，用無(wú)菌吸管將淋巴細(xì)胞懸液吸出后，用PBS沖洗二遍，離心機(jī)離心，1500轉(zhuǎn)/分，5分鐘，棄上清，配成單細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)鑒定細(xì)胞活性，活性細(xì)胞達(dá)98%。計(jì)數(shù)后配成所需濃度備用。雌性Balb/c小鼠，經(jīng)60Co6Gyγ-射線亞致死量全身照射(空氣量7.39Gy，距離80cm，時(shí)間6.87min)。4小時(shí)內(nèi)由尾靜脈輸入取自DBA/2小鼠胸腺、淋巴結(jié)混合細(xì)胞，細(xì)胞量為每只1×106/0.2ml。

122分組與處理制模后小鼠分為4組，分別為模型對(duì)照組、當(dāng)歸注射液小劑量組、當(dāng)歸注射液大劑量組、丙酸睪丸酮組，每組8只，另設(shè)8只同批正常未經(jīng)任何處理Balb/c小鼠為正常對(duì)照組。①正常對(duì)照組：予無(wú)菌生理鹽水10ml/kg.d腹腔注射，連續(xù)12天。②模型對(duì)照組：于制模當(dāng)天腹腔注射無(wú)菌生理鹽水10ml/kg.d，連續(xù)12天。③、④當(dāng)歸注射液小劑量組、當(dāng)歸注射液大劑量組：分別于制模當(dāng)天給予當(dāng)歸注射液注射液2ml/kg.d及10ml/kg.d腹腔注射。⑤丙酸睪丸酮組：于制模當(dāng)天腹腔注射丙酸睪丸酮10mg/kg.d。所有小鼠均給予每升含紅霉素250mg及慶大霉素320萬(wàn)U的無(wú)菌水喂養(yǎng)。

13檢測(cè)的指標(biāo)及方法

131體重變化、外周血白細(xì)胞和骨髓單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)于制模第12天小鼠稱重后，經(jīng)尾靜脈采血，按常規(guī)方法行外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)后，斷頸處死，取右側(cè)股骨，用PBS沖出骨髓細(xì)胞，計(jì)數(shù)，即為1根股骨中的骨髓單個(gè)核細(xì)胞(mononucleatecells,MNC)。

132尺骨骨髓切片組織學(xué)觀察取尺骨固定，塑料包埋切片，HGE染色，采用浦權(quán)等［4］的方法，于高倍鏡下用網(wǎng)格測(cè)微器進(jìn)行骨髓造血組織容量百分率的測(cè)定，測(cè)其全片骨髓造血組織所占面積(不含骨小梁)的百分比，并觀察微血管和脂肪細(xì)胞。

造血組織面積(%)=各網(wǎng)格造血組織面積(%)之總和/測(cè)計(jì)全片骨髓的網(wǎng)格總數(shù)

133骨髓超微結(jié)構(gòu)樣本制備取尺骨中段，固定于4%戊二醛溶液中，經(jīng)磷酸緩沖液充分沖洗后再固定于1%四氧化鋨中，丙酮逐級(jí)脫水，環(huán)氧樹(shù)脂618包埋，超薄切片，硝酸鈷和醋酸鈉雙重染色，置于透射電鏡下觀察骨髓造血細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞變化。

134骨髓單個(gè)核細(xì)胞懸液il3的檢測(cè)制模后第12天斷頸處死小鼠，制備MNC懸液，調(diào)濃度為1×107/ml，培養(yǎng)72小時(shí)后收集上清液，采用雙抗體夾心ABCELISA法測(cè)IL3量。

14統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)以±s表示，均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05表示差別有顯著性。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

21小鼠體重、外周血白細(xì)胞及骨髓單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)改變

實(shí)驗(yàn)各組小鼠體重、外周血白細(xì)胞及骨髓單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯低于正常對(duì)照組(P<0.01)，但當(dāng)歸注射液大劑量組及丙酸睪丸酮組較模型對(duì)照組明顯增加(P<0.01)，且當(dāng)歸注射液大劑量組與丙酸睪丸酮組比較無(wú)顯著差異，而當(dāng)歸注射液小劑量組與模型對(duì)照組比較無(wú)顯著差異。見(jiàn)表1。表1當(dāng)歸注射液對(duì)免疫誘導(dǎo)再生障礙性貧血小鼠體重、外周血白細(xì)胞及骨髓單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響注：與正常對(duì)照組比較，#P<0.01；與模型對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01.

22尺骨骨髓切片組織學(xué)觀察

光鏡下觀察骨髓造血組織容量百分率，結(jié)果表明與正常對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)各組骨髓造血組織容量百分率均明顯降低(P<0.01)，但當(dāng)歸注射液大劑量組及丙酸睪丸酮組較模型對(duì)照組顯著增高(P<0.01)，且當(dāng)歸注射液大劑量組與丙酸睪丸酮組比較無(wú)顯著差異，而當(dāng)歸注射液小劑量組與模型對(duì)照組比較無(wú)顯著差異。見(jiàn)表2。表2當(dāng)歸注射液對(duì)免疫誘導(dǎo)再生障礙性貧血小鼠骨髓造血組織容量百分率的影響*注：與正常對(duì)照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型對(duì)照組比較，*P<0.01。

23骨髓單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清IL3的含量

采用ELISA法對(duì)正常對(duì)照組、模型對(duì)照組及當(dāng)歸注射液大劑量組骨髓MNC培養(yǎng)上清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常對(duì)照組IL3含量明顯高于模型對(duì)照組，而當(dāng)歸注射液大劑量組的IL3含量亦明顯高于模型對(duì)照組。見(jiàn)表3。表3當(dāng)歸注射液對(duì)免疫誘導(dǎo)再生障礙性貧血小鼠骨單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清IL3的影響

3討論

31免疫誘導(dǎo)再生障礙性貧血小鼠模型的建立

在建立AA小鼠模型的過(guò)程中，照射和淋巴細(xì)胞的輸入是兩個(gè)必需的條件，合適的照射劑量既能降低造血干細(xì)胞的數(shù)量，引起骨髓儲(chǔ)備力下降，削弱宿主的免疫功能，抑制宿主的造血系統(tǒng)，誘發(fā)AA，又不至于使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物過(guò)早死亡。本實(shí)驗(yàn)AA模型經(jīng)射線照射后，不僅造成造血細(xì)胞的死亡，對(duì)組成造血微環(huán)境的血竇、內(nèi)皮細(xì)胞、外膜網(wǎng)狀細(xì)胞及吞噬細(xì)胞也造成損傷，呈現(xiàn)血竇壁斷裂，細(xì)胞器腫脹、變形等超微結(jié)構(gòu)的變化。照射同時(shí)輸入的具有免疫活性的淋巴細(xì)胞可使造血微環(huán)境的損傷加重，病變持續(xù)存在，影響造血細(xì)胞的正常生長(zhǎng)代謝，最終導(dǎo)致造血功能不能重建，出現(xiàn)不可逆的AA。因此本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ托∈蟮牟±砀淖兣c人類AA相似。已知該模型AA發(fā)病時(shí)間集中在8~14天，高峰期為12天［3］，所以我們選擇第12天處死小鼠，獲取標(biāo)本。

32AA的發(fā)病機(jī)理

AA是以全血細(xì)胞減少、骨髓造血功能衰竭為主要特征的一類貧血。目前，其發(fā)病機(jī)理主要認(rèn)為與造血干細(xì)胞數(shù)目減少或功能缺失［5］，造血微環(huán)境的缺陷以及由造血微環(huán)境中基質(zhì)細(xì)胞缺陷所致的正/負(fù)調(diào)節(jié)因子表達(dá)異常［6］相關(guān)。

造血微環(huán)境是造血干細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和自我更新的重要場(chǎng)所。主要由基質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和微血管系統(tǒng)組成?；|(zhì)細(xì)胞構(gòu)成了骨髓微環(huán)境的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，網(wǎng)架內(nèi)充滿造血細(xì)胞；血竇由內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成，竇腔內(nèi)有成熟紅細(xì)胞和其他細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞外有網(wǎng)狀細(xì)胞，營(yíng)養(yǎng)和發(fā)育造血細(xì)胞［7］?；|(zhì)細(xì)胞在造血調(diào)控方面發(fā)揮重要的作用。它不僅作為造血細(xì)胞生長(zhǎng)的支架，而且可通過(guò)細(xì)胞間的直接作用和分泌多種造血生長(zhǎng)因子來(lái)調(diào)節(jié)造血細(xì)胞的增殖、分化、成熟與釋放［8］。早已證實(shí)血竇的完整性及外膜網(wǎng)狀細(xì)胞在造血的支持和誘導(dǎo)中也有重要作用。

33當(dāng)歸的藥理作用

當(dāng)歸是中醫(yī)臨床最重要的補(bǔ)血活血藥物，過(guò)去多用于治療腰腿痛和婦科疾病，隨著臨床研究的進(jìn)展，其用藥范圍逐漸擴(kuò)大。作為補(bǔ)血藥物，其在血液系統(tǒng)疾病中的研究也日漸增多。

當(dāng)歸的水溶性部分含阿魏酸，具有增加血流量、改善骨髓微環(huán)境的功能［9］，并能穩(wěn)定紅細(xì)胞膜，保護(hù)紅細(xì)胞免受破壞［10］。

當(dāng)歸多糖(angelicapolysaccharide,AP)是當(dāng)歸中另一促進(jìn)造血的有效成分。AP對(duì)貧血小鼠的紅細(xì)胞、血紅蛋白、白細(xì)胞和骨髓單個(gè)核細(xì)胞數(shù)恢復(fù)有顯著促進(jìn)作用［11］。實(shí)驗(yàn)表明，AP能顯著增加照射小鼠脾臟內(nèi)源性造血灶的形成，提高照射小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)，增強(qiáng)造血功能；能防止照射后效應(yīng)，顯著促進(jìn)照射小鼠多能造血干細(xì)胞形成單位(CFUS)和粒系定向干細(xì)胞形成單位(CFUC)的恢復(fù)［12］。對(duì)造血干細(xì)胞的增殖分化有顯著刺激作用［13］。而且，體內(nèi)注射AP對(duì)正常或貧血小鼠的早期紅系祖細(xì)胞(BFUE)、晚期紅系祖細(xì)胞(CFUE)、粒單系祖細(xì)胞(CFUGM)和巨核系祖細(xì)胞(CFUMK)的增殖均有顯著促進(jìn)作用［14］。

牛泱平等［15］采用體外造血祖細(xì)胞集落形成技術(shù)，首次觀察了當(dāng)歸注射液對(duì)正常人和再生障礙性貧血患者骨髓紅系、粒系的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸注射液能促進(jìn)正常人和再生障礙性貧血患者骨髓造血干、祖細(xì)胞的增生和轉(zhuǎn)化。

當(dāng)歸還具有多重調(diào)節(jié)免疫功能作用［16］。研究證實(shí)，當(dāng)歸對(duì)免疫器官及細(xì)胞的再生以及機(jī)體的修復(fù)具有促進(jìn)作用［17］。孟慶勇等［18］發(fā)現(xiàn)一定劑量的體內(nèi)注射當(dāng)歸注射液對(duì)正常及受輻射損傷小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖具有明顯的刺激作用，有利于機(jī)體免疫功能的恢復(fù)。當(dāng)歸注射液還能明顯抑制免疫抑制劑氫化可的松對(duì)大鼠脾細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用［19］。

當(dāng)歸具有保護(hù)、促進(jìn)和加速由于輻射引起的DNA合成抑制過(guò)程恢復(fù)的作用，或解除由輻射引起的物質(zhì)代謝障礙［20］。劉玉蘭等［21］實(shí)驗(yàn)證明當(dāng)歸注射液腹腔用藥對(duì)輻射損傷的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖具有刺激作用，表明當(dāng)歸注射液腹腔用藥具有抗輻射作用。

34當(dāng)歸注射液對(duì)AA小鼠的保護(hù)作用

341對(duì)AA小鼠造血組織容量的影響本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?duì)照組小鼠骨髓主要為脂肪細(xì)胞，造血細(xì)胞明顯減少，當(dāng)歸注射液大劑量組能明顯提高造血組織容量百分，使造血細(xì)胞明顯增生。

邢金龍等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果［22］也證實(shí)當(dāng)歸注射液具有清除氧自由基等有害物質(zhì)，保護(hù)細(xì)胞器的作用。

342對(duì)骨髓微環(huán)境的影響本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?duì)照組骨髓微環(huán)境損傷突出表現(xiàn)為骨髓間質(zhì)主要為巨大的脂肪細(xì)胞，血竇擴(kuò)張、充血，血竇內(nèi)皮細(xì)胞核呈梭形，無(wú)核內(nèi)小體，竇壁薄而直，甚至斷裂，無(wú)微絨毛，很少見(jiàn)到外膜網(wǎng)狀細(xì)胞。當(dāng)歸注射液大劑量組造血小島增生，血竇豐富，血竇內(nèi)皮細(xì)胞核為圓形或橢圓形，常見(jiàn)核內(nèi)小體，竇壁較厚，有豐富的微絨毛。血竇的外膜網(wǎng)狀細(xì)胞常見(jiàn)。血竇的修復(fù)保證了細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及體液因子，無(wú)疑促進(jìn)造血細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育及其功能。

實(shí)驗(yàn)證明，當(dāng)歸注射液大劑量組與丙酸睪丸酮組比較，小鼠的體重，外周血白細(xì)胞、骨髓單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)均無(wú)顯著差異，骨髓微環(huán)境變化也基本一致，說(shuō)明大劑量組當(dāng)歸注射液作用強(qiáng)度與丙酸睪丸酮相似。而經(jīng)當(dāng)歸注射液小劑量組治療的AA小鼠外周血白細(xì)胞、骨髓單個(gè)核細(xì)胞水平與模型對(duì)照組無(wú)顯著差異，說(shuō)明達(dá)到一定劑量的當(dāng)歸注射液才能對(duì)AA小鼠有保護(hù)作用。

343對(duì)BMNC培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IL3的影響本實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)了正常對(duì)照組、模型對(duì)照組及當(dāng)歸注射液大劑量組的骨髓MNC培養(yǎng)上清中IL3的含量，以期探討當(dāng)歸注射液對(duì)AA小鼠的保護(hù)機(jī)理。

細(xì)胞增殖受細(xì)胞內(nèi)外調(diào)控因子的影響，造血生長(zhǎng)因子是一組調(diào)控造血干／祖細(xì)胞的增殖、分化及成熟血細(xì)胞功能的糖蛋白，它通過(guò)血液循環(huán)，到達(dá)骨髓造血組織，對(duì)其靶細(xì)胞發(fā)揮作用。根據(jù)其發(fā)揮的作用不同而分為正調(diào)控因子及負(fù)調(diào)控因子。白細(xì)胞介素3（IL3）是一種重要的正調(diào)控因子。IL3生物活性廣泛，通過(guò)激活干／祖細(xì)胞表面的IL3受體，促進(jìn)造血干細(xì)胞的增殖與分化。此外，IL3還增強(qiáng)造血干細(xì)胞對(duì)其它造血生長(zhǎng)因子的反應(yīng)，發(fā)揮協(xié)同作用。因此，在幾乎所有的造血干細(xì)胞培養(yǎng)方案中都應(yīng)用IL3，由此增生的造血干細(xì)胞被用來(lái)作基因轉(zhuǎn)染，及化療后的造血重建。IL3促進(jìn)多能造血干細(xì)胞和各系祖細(xì)胞的定向分化與增殖，表現(xiàn)為對(duì)多種血細(xì)胞的生成有調(diào)節(jié)作用［23，24］。

35展望

當(dāng)歸注射液能明顯促進(jìn)AA小鼠骨髓造血細(xì)胞增生，改善骨髓造血微環(huán)境。其對(duì)AA小鼠的保護(hù)作用可能與其能提高骨髓造血細(xì)胞線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的數(shù)量，改善其質(zhì)量。當(dāng)歸注射液是否還通過(guò)其他途徑發(fā)揮作用有待進(jìn)一步探討。從理論及部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果而言，當(dāng)歸注射液可能是治療AA的有效藥物之一。

4結(jié)論

當(dāng)歸注射液對(duì)免疫誘導(dǎo)小鼠再生障礙性貧血具有保護(hù)作用，能改善AA小鼠骨髓微環(huán)境，促進(jìn)造血細(xì)胞增生。

當(dāng)歸注射液保護(hù)作用的機(jī)制與其能提高骨髓中造血正調(diào)控因子IL3有關(guān)。

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