導(dǎo)語(yǔ)：水浸束縛應(yīng)激對(duì)大鼠下頜下腺內(nèi)瘦素表達(dá)的影響一文來(lái)源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

關(guān)鍵詞】應(yīng)激；水浸束縛；頜下腺；瘦素；大鼠

Effectofwaterimmersionrestraintstresssonleptinexpressioninsubmandibularglandofrats

【Abstract】AIM:Toobservethechangesofleptinexpressioninsubmandibularglandofratsfollowingwaterimmersionrestraintstressandtoexploretheeffectsandsignificanceofstressresponseonleptinsecretioninsubmandibulargland.METHODS:TwentySpragueDawleyratsweredividedintowaterimmersionrestraintstress(WRS)group(n=10)andnormalcontrolgroup(n=10).Localizationanddistributionofleptininratsubmandibularglandwereobservedbyimmunohistochemistry,andtheconcentrationsofleptininserumandsubmandibularglandweredeterminedbyenzymelinkedimmunosorbentassay(ELISA).RESULTS：Leptinimmunoreactivecellsweremainlylocatedintheepithelialcellsofthegranularconvolutedandstriatedducts.Theimmunocomplexesweredistributedintheepithelialcytoplasmoftheductsbutnotinthenuclei.Thestainingintensityforleptininthegranularconvolutedductwasmuchhigherthanthatinstriatedduct.TheleptinstainingintheductsofsubmandibularglandinWRSgroupwasdenserthanthatinnormalcontrolgroup.Theconcentrationsofleptininbothserumandsubmandibularglandwereincreasedmarkedlycomparedwiththatinnormalcontrolgroup(P<0.01).CONCLUSION:Leptiniswidelyexpressedintheepithelialcellsofthegranularconvolutedandstriatedductsoftheratsubmandibulargland.WRScanleadtotheenhancedexpressionofleptininratsubmandibulargland,andtheseresultssuggestedthatleptininsubmandibularglandmightbeinvolvedintheregulationofstressresponseprocess.

【Keywords】stress;waterimmersionrestraint;submandibulargland;leptin;rat

【摘要】目的：觀察應(yīng)激狀態(tài)下大鼠頜下腺內(nèi)瘦素表達(dá)的變化，探討應(yīng)激反應(yīng)對(duì)頜下腺瘦素分泌的影響及其意義.方法：采用水浸束縛應(yīng)激（WRS）方法，將20只SD大鼠隨機(jī)均分為WRS組(n=10)和對(duì)照組(n=10)，用免疫組織化學(xué)方法觀察大鼠頜下腺內(nèi)瘦素的定位與分布；用ELISA法檢測(cè)兩組大鼠血清和頜下腺組織中瘦素水平.結(jié)果：瘦素免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞主要定位于頜下腺導(dǎo)管的顆粒曲管和紋狀管，腺泡細(xì)胞為陰性，其中顆粒曲管上皮細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng).WRS組大鼠頜下腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞瘦素免疫反應(yīng)細(xì)胞的染色強(qiáng)度高于對(duì)照組.與對(duì)照組相比，WRS組大鼠血清和頜下腺中瘦素水平均顯著升高（P<0.01）.結(jié)論：瘦素表達(dá)于大鼠頜下腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞；水浸束縛應(yīng)激可致大鼠血清和頜下腺中瘦素濃度增加，頜下腺內(nèi)瘦素可能參與應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程的調(diào)節(jié).

【關(guān)鍵詞】應(yīng)激；水浸束縛；頜下腺；瘦素；大鼠

0引言

瘦素（leptin）是一種由肥胖基因編碼的多肽產(chǎn)物被首次發(fā)現(xiàn)［1］.瘦素具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，是一種調(diào)節(jié)體內(nèi)脂肪貯存量、能量代謝及維持恒定體重的［2］,在脂肪、胃等多種組織與血液中維持一定的平衡，在機(jī)體處于應(yīng)激、創(chuàng)傷等因素刺激下，血液中瘦素水平發(fā)生顯著變化，參與攝食行為、脂肪代謝和ATP合成等過(guò)程.近年的研究發(fā)現(xiàn)，人和哺乳類動(dòng)物唾液腺內(nèi)有瘦素及其受體表達(dá)［3-5］.應(yīng)激刺激條件下頜下腺內(nèi)瘦素水平有無(wú)變化、其是否參與應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程的調(diào)節(jié)等問題至今未見研究報(bào)道.本研究采用免疫組織化學(xué)方法觀察瘦素在大鼠頜下腺的定位與分布；并應(yīng)用ELISA技術(shù)檢測(cè)水浸束縛應(yīng)激條件下大鼠血清及頜下腺組織中瘦素水平的變化，以期為深入研究頜下腺內(nèi)瘦素在應(yīng)激反應(yīng)中的調(diào)節(jié)作用提供實(shí)驗(yàn)資料.

1材料和方法

1.1材料健康SD大鼠2只，鼠齡為13wk，體質(zhì)量200~250g，隨機(jī)均分為WRS(waterimmersionrestraint)組（n=10）和正常對(duì)照組（n=10）.采用水浸束縛應(yīng)激模型［4］.乙醚麻醉下將大鼠四肢固定于特制的木板上，待動(dòng)物清醒后，置于高約30cm的方形塑料桶內(nèi)，桶內(nèi)加入溫度為21±1℃的冷水，使水面至大鼠的胸骨劍突，經(jīng)10h后，即可成功誘發(fā)WRS模型.正常對(duì)照組不做任何處理.動(dòng)物飼養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)過(guò)程均遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)與使用的規(guī)定進(jìn)行.將兩組大鼠在烏拉坦（1.2g/kg）腹腔麻醉下，剖開胸腔，暴露心臟，用5mL注射器心內(nèi)取血2mL于4℃靜置2h，離心（7000r/min）20min取上清，-20℃保存?zhèn)溆?然后從頸部取出雙側(cè)頜下腺組織，一側(cè)頜下腺于-70℃保存、留待ELISA檢測(cè)；另一側(cè)頜下腺組織入Bouins液固定24h后，常規(guī)脫水、石蠟包埋、制成厚5μm切片，分別裱貼于預(yù)先用APES(3aminopropyltriethoxysilane,Sigma公司)處理過(guò)的載玻片上，于37℃恒溫箱烤干備用.

1.2方法

1.2.1免疫組織化學(xué)染色兔抗瘦素多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德公司（Boster）；生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG以及ABC試劑盒均購(gòu)自Sigma公司.根據(jù)免疫組化ABC染色程序，取制備好的石蠟切片入二甲苯脫蠟10min×2次，無(wú)水乙醇漂洗5min×2次.新鮮甲醇配制的3g/L(V/V)雙氧水漂洗30min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶.0.01mol/LPBS(pH7.3)漂洗5min×3次.用15g/L(V/V)正常羊血清封閉30min；甩去正常羊血清后，滴加第一抗體兔抗瘦素（1∶200），4℃冰箱內(nèi)孵育過(guò)夜；PBS漂洗5min×3次，滴加生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶400)，室溫2h；PBS漂洗5min×3次，滴加ABC復(fù)合物1h(1∶200)；PBS漂洗5min×3次，DABH2O2顯色8~15min；常規(guī)脫水、透明、DPX封片.用正常兔血清替代瘦素抗體作為第一抗體進(jìn)行染色作為陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn).

1.2.4頜下腺及血清中瘦素的檢測(cè)瘦素ELISA試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司（Boster），具體操作步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行.取凍存的頜下腺組織、稱重，用2mL勻漿器勻漿（加1mLPBS）.組織勻漿液用樣品稀釋液稀釋5倍，將預(yù)先配置好的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品各0.1mL加入酶標(biāo)板孔內(nèi)，室溫孵育5h；甩去酶標(biāo)板內(nèi)液體、不洗，每孔滴加生物素化抗瘦素抗體工作液0.1mL，37℃反應(yīng)1h；0.01mol/LPBS洗滌3min×3次；ABC工作液每孔0.1mL（TMB空白顯色孔除外），37℃反應(yīng)1h，0.01mol/LPBS洗滌5min×3次；TMB顯色液每孔90μL，37℃避光反應(yīng)25min；TMB終止液每孔0.1mL終止顯色.酶標(biāo)儀在450nm測(cè)定A值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各樣品濃度.血清內(nèi)瘦素測(cè)定同法進(jìn)行.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，兩組間用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P<.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2結(jié)果

2.1瘦素在大鼠頜下腺的定位與分布大鼠頜下腺組織的實(shí)質(zhì)由腺泡和導(dǎo)管組成，其中紋狀管和顆粒曲管（GCT）是導(dǎo)管的主要部分.瘦素在正常及WRS大鼠頜下腺組織均有表達(dá)，免疫反應(yīng)產(chǎn)物呈棕褐色顆粒狀，定位于導(dǎo)管上皮細(xì)胞的胞漿和胞膜、細(xì)胞核未見陽(yáng)性物質(zhì)沉著，對(duì)比明顯，背景清晰.WRS組與正常對(duì)照組大鼠頜下腺內(nèi)瘦素免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞的分布基本一致，它們均位于頜下腺導(dǎo)管的紋狀管和顆粒曲管，其中顆粒曲管上皮細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)、紋狀管上皮細(xì)胞呈中等陽(yáng)性反應(yīng).WRS組大鼠頜下腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞瘦素免疫反應(yīng)細(xì)胞的染色強(qiáng)度高于對(duì)照組（圖1A,B），正常兔血清替代一抗的陰性對(duì)照切片未見特異性著色.

A：對(duì)照組；B：WRS組

圖1大鼠頜下腺內(nèi)瘦素免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞的定位與分布×200（略）

2.2水浸束縛應(yīng)激對(duì)大鼠血清和頜下腺組織中瘦素表達(dá)的影響WRS大鼠血清和頜下腺組織中瘦素濃度均顯著高于對(duì)照組（P<0.01，表1）.

表1水浸束縛應(yīng)激對(duì)大鼠血清和頜下腺組織中瘦素水平的影響（略）

aP<0.01vs對(duì)照.

3討論

頜下腺是三大唾液腺之一，屬外分泌腺，但隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)下頜下腺是具有外分泌和內(nèi)分泌雙重功能的腺體，其內(nèi)含有多種生物活性物質(zhì).大鼠頜下腺導(dǎo)管由閏管、顆粒曲管、紋狀管和小葉間導(dǎo)管組成，其中顆粒曲管粗長(zhǎng)而彎曲，頜下腺分泌的生物活性物質(zhì)主要定位于顆粒曲管細(xì)胞內(nèi).迄今已在大鼠頜下腺內(nèi)發(fā)現(xiàn)和分離出30多種生物活性肽.彭彥霄等［5］首先觀察了大鼠頜下腺內(nèi)瘦素的定位與分布，發(fā)現(xiàn)瘦素免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于導(dǎo)管中的紋狀管和顆粒曲管.本研究進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)果，并發(fā)現(xiàn)WRS時(shí)頜下腺導(dǎo)管上皮瘦素免疫染色強(qiáng)度增加.有研究者在健康人唾液涂片中亦發(fā)現(xiàn)有瘦素陽(yáng)性微粒，表明成人下頜下腺具有分泌瘦素的功能，其分泌途徑為外分泌方式.瘦素隨唾液進(jìn)入消化道后，與消化道的瘦素受體結(jié)合，可促進(jìn)胃腸粘膜分泌、增強(qiáng)胃動(dòng)力、促進(jìn)小腸吸收、促進(jìn)粘膜細(xì)胞增生和粘膜修復(fù)等.應(yīng)激是有害或過(guò)強(qiáng)刺激引起的機(jī)體非特異性反應(yīng)，應(yīng)激可致體內(nèi)多種內(nèi)分泌激素水平和代謝活動(dòng)的改變.傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，應(yīng)激效應(yīng)的機(jī)理是由于交感神經(jīng)興奮和下丘腦－垂體－腎上腺軸功能活動(dòng)的增強(qiáng).近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，腦－腸肽也參與了應(yīng)激過(guò)程的調(diào)控.有關(guān)瘦素在應(yīng)激反應(yīng)的作用已有一些研究報(bào)道.手術(shù)創(chuàng)傷應(yīng)激可導(dǎo)致患者血清瘦素濃度持續(xù)升高，并且與C反應(yīng)蛋白和ACTH水平的變化無(wú)相關(guān)性，因而推測(cè)瘦素可能作為一種獨(dú)立因素影響創(chuàng)傷應(yīng)激的病理生理過(guò)程［6］.Konishi等［7］的研究亦證明，水浸束縛應(yīng)激大鼠血清瘦素水平顯著升高，應(yīng)激刺激開始后9h達(dá)高峰；而胃內(nèi)瘦素在應(yīng)激開始后6h和9h時(shí)顯著下降，脂肪組織中瘦素水平在應(yīng)激開始后3h顯著升高.這說(shuō)明WRS后血清瘦素水平變化與胃和脂肪組織內(nèi)瘦素分泌有關(guān)，瘦素水平瘦應(yīng)激事件的調(diào)節(jié).而本研究結(jié)果證明，水浸束縛應(yīng)激大鼠血清和頜下腺組織中瘦素濃度均顯著增高，從而提示應(yīng)激狀刺激可影響頜下腺內(nèi)瘦素的分泌，多種組織分泌的瘦素進(jìn)入血循環(huán)，進(jìn)而影響應(yīng)激反應(yīng)的進(jìn)程和結(jié)果.

關(guān)于應(yīng)激刺激下頜下腺內(nèi)瘦素分泌增加的意義，我們推測(cè)可能與應(yīng)激過(guò)程中下列因素有關(guān).首先，瘦素促進(jìn)脂肪進(jìn)入高分解狀態(tài)，使ATP生成增加；其次，瘦素促進(jìn)細(xì)胞損傷的修復(fù)和增殖，有利于減少應(yīng)激組織細(xì)胞損傷；第三，瘦素可降低非特異性炎癥反應(yīng)，因而應(yīng)激時(shí)瘦素升高是機(jī)體的一種保護(hù)機(jī)制.

本研究通過(guò)對(duì)應(yīng)激狀態(tài)下大鼠頜下腺組織中瘦素表達(dá)的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)瘦素可能在應(yīng)激引起機(jī)體內(nèi)分泌和代謝紊亂中發(fā)揮重要作用.進(jìn)一步探討應(yīng)激條件下頜下腺內(nèi)瘦素與其它經(jīng)典腦腸肽之間的相互作用，將有助于闡明應(yīng)激導(dǎo)致消化道內(nèi)分泌功能紊亂的機(jī)制.

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