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［摘要］目的：在外源抗原表位表達(dá)載體系統(tǒng)中構(gòu)建并表達(dá)乙型肝炎病毒(HBV)抗原表位，并對(duì)其診斷敏感性進(jìn)行評(píng)價(jià)。方法：人工合成編碼HBV“a”抗原決定簇表位中24個(gè)氨基酸(S124147)的寡核苷酸序列，克隆入外源抗原表位表達(dá)載體系統(tǒng)FHVRNA2I3位點(diǎn)，構(gòu)建重組質(zhì)粒，在原核pET系統(tǒng)(BL21細(xì)胞)中表達(dá)。通過(guò)ELISA和Westernblot檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物的抗原性，并以表達(dá)產(chǎn)物為包被抗原,通過(guò)ELISA和Westernblot檢測(cè)58份乙肝患者血清抗HBs。結(jié)果：嵌和蛋白可與抗HBs特異性結(jié)合，其ELISA檢測(cè)抗HBs陽(yáng)性率為77.5%，Westernblot的為68%，而對(duì)照試劑盒的為62%。結(jié)論：在外源抗原表位表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的HBV重組抗原表位具有良好的抗原性，有診斷應(yīng)用價(jià)值。

［關(guān)鍵詞］HBV;抗原表位;抗原性;FHVRNA2載體系統(tǒng)

StudyonAntigenicityofHBVRecombinantEpitope

Abstract：ObjectiveConstructionandExpressionHBVrecombinantepitopeinaforeignepitopepresentingvector，andevalutionofdignosticsensitivityforantiHBswithHBVepitope.MethodsOligonucleotidsencodedtwentyfouraminoacids(aaS124147)whichiswithin"a"antigenicdeterninantweresynthesizedandinsertedintoaforeignepitopepresentingcarrierI3site(FHVRNA2cDNAI3).HBVepitopewasexpressedinaprokaryoticcellularsystem(BL21cell).TheexpressionproductwasanalyzedanditsantigenicitywasfurtherstudiedbyELISAandWsternblotmethodwithchimericproteinascoatingantigen.weusedchimericproteinascoatingantigentotestantiHBswithELISAandWsternblotin58seralsamples.ResultsThechimericproteinreactedwithantiHBsseralspecially.ThedetectionpositiveratioofantiHBsis77.5%and68%respectivelybyELISAandWsternblotwithchimericproteinascoatingantigen,thecontrol''''swas62%.ConclusionHBVepitopeexpressedinaforeignepitopepresentingcarrierpossessedgoodantigenicityanddiagnosticvalue.

Keywords：HBV；Epitope；Antigenicity；FHVRNA2carriersystem

乙型肝炎病毒(HBV)是乙型肝炎的病原體，并引起慢性肝炎和肝硬化，而且與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。迄今，對(duì)HBV感染最有力的預(yù)防和控制措施，仍是發(fā)展疫苗。FHVRNA2載體系統(tǒng)［1］是一個(gè)以昆蟲(chóng)小RNA病毒flockhousevirus外殼蛋白為載體的新型抗原表位表達(dá)載體，此系統(tǒng)中表達(dá)的載體蛋白可自動(dòng)組裝成病毒樣顆粒，使插入的外源抗原表位可以暴露在顆粒的表面，保持天然構(gòu)象和免疫學(xué)特性。本研究擬將HBVa抗原表位插入到FHV外殼蛋白上，并對(duì)其抗原性及診斷意義進(jìn)行了研究。

1材料與方法

1.1細(xì)胞重組質(zhì)粒DNA大腸桿菌DH5α用于重組質(zhì)粒pETEDNA的克隆和擴(kuò)增。大腸桿菌BL21(DE3)用于重組質(zhì)粒pETEDNA的表達(dá)。質(zhì)粒DNA在含200μg/ml氨芐青霉素的LB或TB培育中生長(zhǎng)，F(xiàn)HVRNA2載體系統(tǒng)即重組pETFHV構(gòu)建見(jiàn)［1］。

1.2HBV抗原表位及重組pETE的構(gòu)建和表達(dá)

1.2.1HBV抗原表位及重組pETE的構(gòu)建人工合成HBV特異抗原表位E(氨基酸序列：124CTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNC147)寡核苷酸序列：正向5’GATGCACGACTCCTGCTCAAGGCAACTCTATGTTTCCCTCATGTTGCTGTACAAAACCTACGGATGGAAATTGC3’；反向3’CTACGTGCTGAGGACGAGTTCCGTTGAGATACAAAGGGAGTACAACGACATGTTTTGGATGCCTACCTTTAACG5’，兩端為Bsu36I識(shí)別位點(diǎn)，與經(jīng)Bsu36I作用后的重組pETFHVDNA混勻后置室溫連接2h,轉(zhuǎn)化DH5α細(xì)胞，接種LB平板(200μg/mlAmp)培養(yǎng)。重組質(zhì)粒pETEDNA經(jīng)酶切篩選并經(jīng)DNA序列測(cè)定。

1.2.2攜帶HBV抗原表位的嵌和蛋白的表達(dá)重組pET系統(tǒng)中，嵌和蛋白的表達(dá)受T7啟動(dòng)子的控制［2］。BL21經(jīng)重組pETEDNA轉(zhuǎn)化后，在TB培養(yǎng)液中37℃生長(zhǎng)16h～18h,細(xì)胞經(jīng)4000r/10min離心沉淀,用超聲裂解緩沖液懸浮，超聲裂解，裂解液經(jīng)離心，棄上清，沉淀(包涵體)用8mol/L尿素溶解。

1.2.3SDSPAGE及Westernblot分析方法見(jiàn)前文［1，3］，3，3二氨基苯胺四氫鹽酸(DAB)底物試劑為AMRESCO公司產(chǎn)品;第二抗體辣根過(guò)氧化物酶(HRP)結(jié)合物購(gòu)自華美公司。

1.3HBV重組抗原表位診斷意義評(píng)價(jià)

1.3.1ELISA檢測(cè)血清樣本固相ELISA檢測(cè)如前文所述［1］，以純化的嵌和蛋白為包被抗原，每孔100μl(含1μg純化嵌和蛋白)，檢測(cè)58份乙肝患者血清中抗HBs，與抗HBsELISA檢測(cè)試劑檢測(cè)結(jié)果比較。陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)為(檢測(cè)血清A492底物對(duì)照A值)/(陰性血清A492底物對(duì)照A值)>2.1。鄰苯二胺二氫鹽酸(OPD)購(gòu)自AMRESCO公司；第二抗體辣根過(guò)氧化物酶(HRP)結(jié)合物購(gòu)自華美公司；乙肝患者血清由昆明市傳染病醫(yī)院收集;抗HBsELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海科華公司。

1.3.2HBV重組抗原表位Westernblot檢測(cè)血清樣本方法見(jiàn)前文［3］，檢測(cè)了58份乙肝患者血清樣本。

2結(jié)果

2.1攜帶HBV抗原表位的嵌和蛋白的表達(dá)FHVRNA2cDNA載體系統(tǒng)即重組pETFHV構(gòu)建見(jiàn)文獻(xiàn)［4］，其編碼產(chǎn)物是FHV外殼蛋白，三維立體結(jié)構(gòu)已得到精確測(cè)定，其上有6個(gè)可供外源抗原表位插入的位點(diǎn)［5］(見(jiàn)圖1)。應(yīng)用該系統(tǒng)，我們將人工合成HBV抗原表位寡核苷酸序列插入到重組pETFHVDNA上，構(gòu)建攜帶HBV抗原表位的重組質(zhì)粒pETE，經(jīng)NsiⅠ和NcoⅠ雙酶切篩選(見(jiàn)圖2)和DNA序列測(cè)定無(wú)誤后轉(zhuǎn)化BL21細(xì)胞，高水平表達(dá)嵌和蛋白。經(jīng)SDSPAGE和考馬斯亮藍(lán)染色(見(jiàn)圖3)和Westernblot(見(jiàn)圖4)分析結(jié)果表明，這些嵌和蛋白為攜帶有HBV抗原表位的重組FHV外殼蛋白。

圖1FHV外殼蛋白的三維結(jié)構(gòu)：示可供選擇的外源抗原表位序列插入位點(diǎn)L1、L2、L3、I1、I2，I3HBV抗原表位氨基酸序列在FHV中插入位點(diǎn)。（略）

圖2重組質(zhì)粒NcoⅠ+NsiⅠ酶切圖（略）

2.2攜帶HBV重組抗原表位的嵌和蛋白在BL21中的表達(dá)與鑒定攜帶HBV抗原表位的重組質(zhì)粒pETFHVE在BL21(DE3)轉(zhuǎn)化細(xì)胞中高水平表達(dá)了攜帶HBV抗原表位的嵌合蛋白FHVE,其分子質(zhì)量與陽(yáng)性對(duì)照相同，約為45000(等于載體FHV外殼蛋白的分子質(zhì)量43000加上HBV抗原表位的分子質(zhì)量)。經(jīng)SDSPAGE和考馬斯亮藍(lán)染色(見(jiàn)圖3)及Westernblot(見(jiàn)圖4)分析結(jié)果表明，重組抗原表位顯示了抗原性。

圖3攜帶HBVa特異抗原表位的嵌合蛋白SDSPAGE(10%)分析（略）

圖4嵌合蛋白的Westernblot分析（略）

2.3HBV重組抗原表位ELISA檢測(cè)敏感性分析我們用嵌和蛋白為包被抗原用間接ELISA法檢測(cè)58份乙肝患者血清中抗HBs抗體，檢測(cè)陽(yáng)性率為77.5%，高于ELISA試劑盒檢測(cè)的62%。

2.4HBV重組抗原表位Westernblot以嵌和蛋白為包被抗原用Westernblot檢測(cè)58份乙肝患者血清中抗HBs抗體，檢出陽(yáng)性率為68%。

3討論

3.1HBVa抗原表位在疫苗及診斷應(yīng)用研究中的意義根據(jù)HBsAgS蛋白的抗原性不同，將HBV分為9個(gè)血清型(即HBsAg亞型)［6，7］：ayw1、ayw2、ayw3、ayw4、ayr、adw2、adw4、adrq-、adrq+。HBVS蛋白第120～第160氨基酸序列是HBV的交叉中和抗原表位即a表位［8］，可誘導(dǎo)產(chǎn)生交叉中和抗體，保護(hù)成人免受各HBV亞型的感染。本研究進(jìn)一步表明，HBVa重組抗原表位可與臨床不同來(lái)源的血清抗HBs發(fā)生特異性結(jié)合，具有疫苗研究和診斷意義。

3.2新型抗原表位表達(dá)載體系統(tǒng)對(duì)于抗原表位來(lái)說(shuō)，決定其免疫原性和抗原性的因素除了氨基酸序列，更重要的是分子的空間構(gòu)象和呈遞給免疫細(xì)胞識(shí)別的方式。利用FHVRNA2表達(dá)載體在大腸桿菌中表達(dá)的抗原表位具有良好的免疫原性，免疫小鼠產(chǎn)生了交叉中和抗體［9］，并已成功的在該系統(tǒng)中表達(dá)了HIV1V3、輪狀病毒Vp4抗原表位和HCV抗原表位，并誘導(dǎo)中和抗體和交叉中和體產(chǎn)生［1，10，11］。HBV抗原表位在FHVRNA2載體系統(tǒng)可中高效地表達(dá)，并近似天然構(gòu)象，能被天然抗HBs抗體特異性識(shí)別結(jié)合，具有良好的抗原性，在以其為包被抗原用ELISA和Weternblot檢測(cè)抗HBs中檢測(cè)敏感性與ELISA診斷試劑盒差異無(wú)顯著性，在HBV診斷試劑和重組抗原表位亞單位疫苗研究中具有重要意義。

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