導(dǎo)語：大鼠Munc13研究論文一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

【摘要】目的：研究大鼠胰腺發(fā)育不同階段munc131基因及蛋白表達(dá)的變化及Munc131在胰島素釋放過程中的作用.方法：應(yīng)用顯微分離及提取技術(shù)獲得大鼠胚胎發(fā)育12.5d（E12.5）,E15.5,E18.5,新生大鼠,出生后21d（P21）及成年大鼠胰腺組織；另外，從大鼠胚胎發(fā)育15d開始給予孕鼠半量飲食，造成宮內(nèi)發(fā)育遲緩動物模型，提取其新生大鼠胰腺組織.采用RTPCR,RealtimePCR和Westernblot技術(shù)確定Munc131的表達(dá)情況，并測定不同發(fā)育時期血中胰島素濃度.結(jié)果：胰島素基因從E12.5開始出現(xiàn)，Munc131基因從E15.5開始表達(dá)，隨著胎齡的增長，二者表達(dá)量皆增多.E15.5和E18.5時munc131蛋白表達(dá)量較少，以后明顯增多.自E18.5即檢測到血中胰島素的存在，隨著胚胎的發(fā)育，血胰島素濃度逐漸升高.宮內(nèi)發(fā)育遲緩新生大鼠比正常新生大鼠血胰島素濃度低，同時Munc131基因及蛋白表達(dá)量亦比正常對照組明顯減少.結(jié)論：Munc131在胰島素釋放過程中的作用，隨著胚胎發(fā)育期胰島素分泌的增多表達(dá)也增加，宮內(nèi)發(fā)育遲緩新生大鼠胰島素分泌減少時，Munc131的表達(dá)亦減少.

【關(guān)鍵詞】Munc131；胰島素/分泌；胚胎胰腺發(fā)育；糖尿病；宮內(nèi)發(fā)育遲緩

0引言

胰島素在β細(xì)胞內(nèi)合成后，以分泌顆粒的形式貯存在大致密囊泡中，在營養(yǎng)物質(zhì)（葡萄糖、氨基酸、脂肪酸等）、神經(jīng)遞質(zhì)、激素等刺激下，進(jìn)入血循環(huán)，完成其調(diào)節(jié)體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)代謝，調(diào)節(jié)生長發(fā)育，控制血糖動態(tài)平衡的生理作用［1-2］.業(yè)已證實(shí)，胞吐過程是涉及許多蛋白因子的復(fù)雜過程，可溶性N甲基馬來酰胺融合蛋白附著蛋白受體(solublenethylmaleimidesensitivefusionproteinattachmentproteinreceptors,SNARE)復(fù)合體是胞吐過程所必須的分子構(gòu)件；Munc，Synaptotagmin，Rab等蛋白家族的不同成員是其重要的調(diào)節(jié)因子.這些因子在神經(jīng)遞質(zhì)胞吐中研究得較多，但他們在胰島素分泌過程中的確切作用及其精細(xì)功能如何尚無定論［3-5］.我們運(yùn)用基因芯片技術(shù)，已建立了大鼠不同發(fā)育階段基因表達(dá)譜，初步明確了胰島素釋放的完善過程中相關(guān)基因的表達(dá)情況，在此基礎(chǔ)上，我們重點(diǎn)從胰島素釋放關(guān)鍵因子之一Munc131入手，探討正常及異常胰腺發(fā)育情況下Munc131表達(dá)的變化，闡述其在胰島素釋放過程中所起的重要作用，以期尋找糖尿病治療的新靶點(diǎn).

1材料和方法

1.1材料SD大鼠由南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供.18：00將雌雄鼠合籠，次日晨檢測有陰栓者定為孕0.5d（E0.5），分別于受精后12.5d(E12.5),15.5d(E15.5),18.5d(E18.5)，經(jīng)頸椎脫臼處死孕鼠，剖腹取出孕子宮，分離胚胎，取出胰腺（E12.5,E15.5胚胎胰腺需在解剖顯微鏡下分離），新生鼠出生后，立即與母體分離，迅速取出其胰腺.出生后21d鼠和成年鼠在低溫條件下迅速取出胰腺［6］.部分孕鼠于E15開始給予正?？防锏?0%，直至出生，造成宮內(nèi)發(fā)育遲緩動物模型，待新生鼠出生后，立即取出其胰腺.所有標(biāo)本置液氮中速凍后-70℃凍存?zhèn)溆?分別取E12.5胚胎胰腺100只、E15.5胚胎胰腺30只，E18.5胚胎胰腺10只（來自3只孕鼠）,新生鼠3只（來自3只孕鼠），用RneasyMiniKit（Qiagen公司）抽提并純化總RNA.總RNA分裝后-70℃凍存，用于RTPCR和RealtimePCR.

1.2方法RTPCR和RealtimePCRRTPCR操作過程按試劑盒（日本Toyoko公司）提供常規(guī)步驟.目的基因及內(nèi)參照引物序列如下：G3PDHforward:5′ACCACAGTCCATGCCATCAC3′,reverse:5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA3′.Insulinforward:5′CCGTCGTGAAGTGGAG3′,reverse:5′CAGTTGGTAGAGGGAGCAG3′.PDX1forward:5′GGTGCCAGAGTTCAGTGCTAA3′,reverse:5′CCAGTCTCGGTTCCATTCG3′.Munc131forward:5′TGTGGAACAAGGGTCTCATCTGG3′.reverse:5′GGCTGCGAAGTCGTGTAGTAAGG－3′.Munc131RealtimePCR探針設(shè)計(jì)如下：unc13h1fam:CCAAGCCATGACCCACTTTGCCTG，unc13h1fp:CGCTATGGCGTTGAATCCA，unc13h1rp:TGCGTAGTAGGCGTTGATGTTG.分別取E15.5的胰腺100只,E18.5的胰腺20只,新生大鼠胰腺6只,出生后21d大鼠6只、成年大鼠6只（雌雄各3只），分別按1∶5（m/V）加裂解液（50mmol/LTrisCl,150mmol/LNaCl,1g/LSDS,100mg/LPMSF,10g/LNP40,10g/LTritonX100,10g/L蛋白酶抑制劑cocktail），冰上勻漿，然后300W超聲4s×14（間隔時間）×6次（保護(hù)、工作復(fù)位），靜置1h后，21500g離心15min，提取上清為總蛋白，用Braford法測蛋白濃度，分裝后-70℃凍存?zhèn)溆?將上述提取的胰腺發(fā)育各時期的總蛋白,進(jìn)行SDSPAGE,轉(zhuǎn)膜后以Munc131（小鼠，針對621~834氨基酸，BD公司）為一抗，羊抗小鼠IgG為二抗進(jìn)行雜交，檢測其相對分子質(zhì)量.另取E18.5、新生大鼠和成年大鼠血標(biāo)本各6份，運(yùn)用胰島素ELISA試劑盒（Linco公司）檢測血中胰島素水平.

2結(jié)果

胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞的一些標(biāo)志物如insulin，PDX1等基因在所取胰腺皆有表達(dá)，證明我們的取材是準(zhǔn)確無誤的.

2.1胰腺發(fā)育各階段Munc131基因及蛋白的表達(dá)Munc131從E15.5開始表達(dá)，以后一直持續(xù)存在；同時，胰島素基因從E12.5開始出現(xiàn)，隨著胎齡的增長表達(dá)量增多（圖1）.RealtimePCR結(jié)果與RTPCR結(jié)果趨勢一致.Westernblot結(jié)果顯示，在Mr1.97×105處出現(xiàn)雜交帶,此與文獻(xiàn)報(bào)道的Munc131抗原的相對分子質(zhì)量相一致.E15.5和E18.5時Munc131蛋白表達(dá)量較少，新生以后表達(dá)量明顯增多.

M：Marker；N：新生大鼠；P21：出生后21d大鼠；A：成年大鼠.

圖1大鼠胰腺中Munc131,insulin的表達(dá)（RTPCR）（略）

A:正常大鼠；B:宮內(nèi)發(fā)育遲緩新生大鼠.N：新生大鼠；IUGR：宮內(nèi)發(fā)育遲緩新生大鼠.

圖2胰腺中Munc131蛋白的表達(dá)（Westernblot）（略）

2.2宮內(nèi)發(fā)育遲緩新生大鼠Munc131基因及蛋白的表達(dá)與正常新生大鼠相比，宮內(nèi)發(fā)育遲緩新生大鼠insulin基因表達(dá)無明顯變化，PDX1表達(dá)相對減少，而Munc131的基因表達(dá)明顯減少（圖3）.宮內(nèi)發(fā)育遲緩新生大鼠Munc131蛋白表達(dá)量比正常對照組明顯減少（圖2B）.

N:正常新生大鼠；IUGR：宮內(nèi)發(fā)育遲緩新生大鼠.

圖3正常及宮內(nèi)發(fā)育遲緩新生大鼠insulin，PDX1，Munc131的基因表達(dá)（略）

2.3大鼠不同發(fā)育階段血胰島素水平自E18.5即檢測到血中胰島素的存在，但濃度較低，隨著胚胎的發(fā)育，血胰島素濃度明顯升高，新生和成年期血胰島素水平無顯著差異.另外，宮內(nèi)發(fā)育遲緩新生大鼠比正常新生大鼠血胰島素濃度低.

3討論

胞吐是胰島素釋放出β細(xì)胞的重要過程.胰島素分泌顆粒分別位于貯存池（約95%～99％）和釋放池（約1%～5％），釋放池的胰島素顆粒經(jīng)過胞吐介導(dǎo)一相胰島素分泌，貯存池的胰島素顆粒經(jīng)過轉(zhuǎn)位、錨定、成熟等過程，補(bǔ)充釋放池的不足，完成二相胰島素分泌.雖然循環(huán)胰島素的量與胰島素合成有關(guān)，但與胰島素釋放的調(diào)節(jié)關(guān)系更加密切［7-9］，本實(shí)驗(yàn)室最近的結(jié)果顯示，上述胰島素分泌關(guān)鍵因子在胚胎及成年大鼠胰腺有表達(dá)（結(jié)果未列），為明確各關(guān)鍵因子的具體作用，我們首先選擇了Munc131作進(jìn)一步的研究.Munc家族成員中較重要的是Munc13（包括Munc131，Munc132，Munc133）和munc18.有研究提示，Munc131不僅可以與Munc18結(jié)合，使Munc18與syntaxin解離，還能直接作用于syntaxin，使syntaxin從syntaxinMunc18復(fù)合體中游離出來，此時SNARE復(fù)合體才能從沒有胞吐能力的松散狀態(tài)變成致密復(fù)合體，促使胞吐的發(fā)生［10-12］.但Munc131在胰島素分泌過程中的確切作用顯有報(bào)道，對其胚胎發(fā)育期的研究更是少.我們發(fā)現(xiàn)，大鼠E12.5胰島素基因即開始表達(dá)，Munc131從E15.5開始出現(xiàn)，說明胚胎胰腺發(fā)育早期即有了合成胰島素的能力，隨后才出現(xiàn)胰島素胞吐關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因，隨著胚胎的生長，二者表達(dá)量增多.Munc131蛋白在E15.5，E18.5已有少量表達(dá)，出生以后表達(dá)明顯增多，與基因水平表達(dá)趨勢基本一致.另宮內(nèi)發(fā)育遲緩新生大鼠比正常新生大鼠血胰島素水平降低，從基因水平及蛋白水平上看，宮內(nèi)發(fā)育遲緩新生大鼠比正常新生大鼠Munc131的表達(dá)明顯減少，而胰島素基因的表達(dá)無明顯變化，這提示宮內(nèi)發(fā)育遲緩新生大鼠胰島素的合成能力可能不變，其血胰島素水平下降可能發(fā)生在胰島素釋放的環(huán)節(jié)，即可能是Munc131等胞吐調(diào)節(jié)因子表達(dá)下降，從而造成胰島素胞吐能力減弱，導(dǎo)致循環(huán)胰島素減少.

因此，我們可以得出以下結(jié)論：①大鼠胚胎胰腺有分泌胰島素的能力，以調(diào)節(jié)自身血糖水平，但胚胎發(fā)育晚期才開始有較多的胰島素分泌，且隨著胚胎生長，胰島素分泌增多；②Munc131在胰島素釋放過程中起著重要作用，隨著胚胎發(fā)育期胰島素分泌的增多，Munc131的表達(dá)同時增多，而宮內(nèi)發(fā)育遲緩新生大鼠胰島素分泌減少時，Munc131的表達(dá)亦減少.

【參考文獻(xiàn)】

［1］RorsmanP,RenstrǒmE.Insulingranuledynamicsinpancreaticbetacells［J］.Diabetologia，2003，46:1029-1045.

［2］KimSK,HebrokM.Intercellularsignalsregulatingpancreasdevelopmentandfunction［J］.GenesDevelop，2001，15:111-127.

［3］LangJ.Molecularmechanismsandregulationofinsulinexocytosisasaparadigmofendocrinesecretion［J］.EurJBiochem，1999，259:3-17.

［4］GuGQ,WellsJM,PrefferF.Globalexpressionanalysisofgeneregulationpathwaysduringendocrinepancreaticdevelopment［J］.Development，2004，131:165-179.

［5］BoitardC,CerasiE,EfendicS.Novelfactorsintheregulationofβcellfunction［J］.Diabetes，2004，53:S1-S4.

［6］倪雪峰，袁櫟，程志祥，等.巢蛋白在大鼠胚胎、新生及成年胰腺中的表達(dá)變化［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，25（3）：193-196.

［7］OharaImaizumiM,OhtsukaT.ELKS,aproteinstructurallyrelatedtotheactivezoneassociatedproteinCAST,isexpressedinpancreaticβcellsandfunctionsininsulinexocytosis:interactionofELKSwithexocytoticmachineryanalyzedbytotalinternalreflectionfluorescencemicroscopy［J］.MolBiolCell，2005，16(7):3289-3300.

［8］HolemansK,AertsL.Lifetimeconsequencesofabnormalfetalpancreaticdevelopment［J］.JPhysiol，2003，547:11-20.

［9］YaekuraK,JulyanR,WicksteedBL.InsulinsecretorydeficiencyandglucoseintoleranceinRab3Anullmice［J］.JBiolChem,2003，278(11):9715-9721.

［10］DulubovaI,LouX,LuJ.AMunc13/RIM/Rab3tripartitecomplex:fromprimingtoplasticit?［J］.EMBOJ,2005，24(16):2839-2850.

［11］VaroqueauxF,SonsMS,PlompJJ.AberrantmorphologyandresidualtransmitterreleaseattheMunc13Deficientmouseneuromuscularsynapse［J］.MolCellBio,2005，25(14):5973-5984.

［12］SheuL,PasykEA,JiJ.RegulationofinsulinexocytosisbyMunc131［J］.JBiolChem，2003，30:27556-27663