導(dǎo)語：如何才能寫好一篇nk細(xì)胞，這就需要搜集整理更多的資料和文獻(xiàn)，歡迎閱讀由公務(wù)員之家整理的十篇范文，供你借鑒。

篇1

1.概述：nk細(xì)胞是一種非T細(xì)胞性、非B細(xì)胞性、非吞噬細(xì)胞性的具有細(xì)胞毒性效應(yīng)的淋巴細(xì)胞。NK細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在抗病毒感染免疫、腫瘤免疫、移植排斥反應(yīng)以及免疫調(diào)節(jié)中起著十分重要的作用。

2001年WHO淋巴組織腫瘤分類將NK細(xì)胞腫瘤分為：（1）前體NK細(xì)胞腫瘤，即原始NK細(xì)胞淋巴瘤；（2）成熟NK細(xì)胞腫瘤，包括T-LGLL、ANKL、結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤，鼻型（NK/TCL）。

侵襲性NK細(xì)胞白血?。ˋNKL）是起源于成熟NK細(xì)胞的惡性腫瘤，突出特點(diǎn)是NK大顆粒淋巴細(xì)胞（LGL，large granular lymphocyte）系統(tǒng)性增生（1），腫瘤細(xì)胞表達(dá)CD56，而表面CD3陰性。ANKL為高度侵襲性疾病，病程進(jìn)展迅速，常伴有肝、腎、心等多器官功能衰竭，大部分患者診斷后數(shù)日或數(shù)周后死亡（2，3，4） 。ANKL最早由Imamura等于1990年發(fā)現(xiàn)，多見于亞洲和歐洲高加索地區(qū)，多在中青年發(fā)病，中位發(fā)病年齡30歲，男女發(fā)病率無差異，同時發(fā)現(xiàn)CD56作為NK細(xì)胞的標(biāo)志。該病發(fā)病率低，但惡性程度高，侵襲性強(qiáng)，早期癥狀不典型，易誤診（5），治療效果及預(yù)后極差。

2.病因及發(fā)病機(jī)制：本病的病因及發(fā)病機(jī)制尚未明確（6）。但多數(shù)病例報(bào)道（7，8，9）中發(fā)現(xiàn)，EB病毒感染的檢測多數(shù)陽性，提示EB病毒感染與本病存在相關(guān)性（10），但目前EBV如何引起NK細(xì)胞克隆性生長知之不多。有部分研究表明ANKL的發(fā)生可能與癌基因的激活與抑癌基因的失活有關(guān)（11）。ANKL引起MOF（多器官功能衰竭）的機(jī)制除了白血病細(xì)胞浸潤直接破壞器官功能外，是否與腫瘤細(xì)胞大量釋放炎癥因子、細(xì)胞因子、凋亡蛋白有關(guān)尚待進(jìn)一步研究（12），Makishima等（13）研究發(fā)現(xiàn)，ANKL細(xì)胞中趨化因子CXCRI、CCR5和細(xì)胞因子IL一8、MIP一12、MIP―lB及 FasL呈陽性表達(dá)，血清可溶性FasL水平顯著升高，提示細(xì)胞因子系統(tǒng)在ANKL細(xì)胞的遷移、侵襲中起到了重要作用，F(xiàn)as和FasL的相互作用被認(rèn)為是肝功能衰竭的機(jī)制之一。

3.臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室檢查：

3.1 臨床癥狀：70%的ANKL患者起病時即可表現(xiàn)B癥狀：發(fā)熱，體溫>38.5℃，盜汗，體重下降。最常見的累及部位是骨髓、外周血、肝和脾，其次為淋巴結(jié)（約37%）。但任何器官均可累及，如皮膚、腎臟、肺、漿膜腔、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、扁桃體、縱隔及等。大多數(shù)患者呈侵襲性、爆發(fā)性的臨床過程，短期內(nèi)可出現(xiàn)多臟器功能衰竭。以肝功能衰竭為主，逐漸累及到其他臟器。病程中常出現(xiàn)彌散性血管內(nèi)凝血和噬血細(xì)胞綜合征，尤其是在終末期。噬血細(xì)胞綜合征主要表現(xiàn)為：①發(fā)熱>7 d，體溫>38.5cC；②肝脾腫大；③外周血兩系或三系減少，且非骨髓造血功能減低所致；④高甘油三脂血癥和或低纖維蛋白原血癥；⑤骨髓、淋巴結(jié)、脾臟內(nèi)組織細(xì)胞增生并伴噬血細(xì)胞現(xiàn)象，無惡性腫瘤證據(jù)。

3.2 實(shí)驗(yàn)室檢查：ANKL患者白細(xì)胞可表現(xiàn)為異常增高，以淋巴細(xì)胞為主，也有表現(xiàn)為白細(xì)胞減少。部分患者可出現(xiàn)血紅蛋白及血小板減少。常出現(xiàn)凝血功能異常。疾病后期，幾乎所有患者都會有肝功能異常和全血細(xì)胞減少。乳酸脫氫酶通常升高。

3.3 骨髓象：該病與一般白血病是有區(qū)別的，其在外周血和骨髓中的腫瘤細(xì)胞數(shù)量可能是有限的，所以在過去亦稱為“侵襲性NK細(xì)胞自血病，淋巴瘤”。骨髓涂片中可見白血病細(xì)胞廣泛或局灶性浸潤，表現(xiàn)為LGL（NK大顆粒淋巴細(xì)胞），形態(tài)不規(guī)則，胞核也不規(guī)則，大多數(shù)胞質(zhì)內(nèi)可見粗大的嗜天青顆粒，伴有反應(yīng)性噬血細(xì)胞增多，伴有髓系成熟障礙。同時可見大片壞死，中間混有正常骨髓組織，以及不典型的單個核細(xì)胞。骨髓活檢可見異常細(xì)胞常呈簇狀或片狀分布，核圓形或不規(guī)則，染色質(zhì)致密，有小核仁，常見凋亡小體和壞死。

3.4 免疫分型：ANKL典型的免疫分型（14，15，16，17）為CD2+，sCD3-，CD7+，CD16+，CD19-，CD20-，CD33-，CD34-，CD38+，CD56+，

HLA-DR+，TCR-，CD10-，CD4-。

3.5 EB病毒抗體陽性。

4.診斷：要求滿足下列條件：①常有發(fā)熱、黃疸及肝、脾腫大，部分患者可有淋巴結(jié)腫大、胸腔積液、腹腔積液等。②發(fā)病急，進(jìn)展快，臨床呈侵襲性及爆發(fā)性的過程，預(yù)后差。③外周血或骨髓中出現(xiàn)輕度不成熟的大淋巴細(xì)胞，胞質(zhì)淡染、可見嗜苯胺藍(lán)顆粒，核染色質(zhì)較細(xì)，偶見核仁，免疫表型提示為成熟NK 細(xì)胞。④免疫表型：sCD3（-）、cCD3（-/+）及CD16（+/-）、CD56（+）、CD57（-）；TCRβ和IgH基因?yàn)榕呦禈?gòu)型。⑤有EB 病毒感染的證據(jù)支持該診斷，但不能作為診斷的必要條件。⑥沒有特異性染色體異常（18）。⑦排除其他大顆粒性淋巴細(xì)胞增殖性疾病。

5.鑒別診斷：

需與下列疾病鑒別：

（1）慢性NK淋巴細(xì)胞增多癥：以外周血中成熟NK細(xì)胞的慢性擴(kuò)增為特點(diǎn)。當(dāng)外周血中sCD3（-），CD56（+/-），CD16（+）NK細(xì)胞數(shù)>0.6×109/L，并持續(xù)至少6個月時可作出診斷。該病多見于成人，不具有侵襲性臨床病程，大多數(shù)患者無癥狀。

篇2

關(guān)鍵詞：侵襲性NK細(xì)胞白血病；診斷；免疫分型

ANKL是一種預(yù)后很差的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，臨床發(fā)病率低，病情進(jìn)展迅速，中位生存時間短，目前國內(nèi)外文獻(xiàn)有散發(fā)報(bào)道?，F(xiàn)將我院近期收治的2例患者報(bào)道如下，并對相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行復(fù)習(xí)，探討該病的臨床特點(diǎn)及有效的治療方案。

1臨床資料

病例1，患者，男，39歲。因"發(fā)熱10d，咳嗽6d，下肢浮腫2d"入院，血常規(guī)：WBC 4.5×109/L，NC2.3×10^9/L,HB 87g/L，PLT 41×109/L；骨髓細(xì)胞學(xué)檢查：骨髓增生活躍，G=32.5%，E=10%，G/E=5.55；可見23％分類不明細(xì)胞，該類細(xì)胞大小不等，胞漿深藍(lán)，核染色質(zhì)偏粗，可見清晰巨大核仁，從形態(tài)上看與組織細(xì)胞及淋巴瘤細(xì)胞均有相似之處。涂片偶見噬血細(xì)胞。該類細(xì)胞組化染色：NAE和NBE染色：部分細(xì)胞弱陽性； POX、AS-DCE染色和PAS染色：陰性。粒系增生尚活躍，以成熟粒細(xì)胞為主。紅系增生減低。成熟紅細(xì)胞中央淡染區(qū)擴(kuò)大。全片未見巨核細(xì)胞。血小板散在分布。流式細(xì)胞術(shù)分析：骨髓有核細(xì)胞中淋巴細(xì)胞約占61％，其中NK細(xì)胞約占73.1％，淋巴細(xì)胞表達(dá)CD2+ CD7-為83.2％，CD3-CD16+CD56+為73.1％，HLA-DR+為54.2％。T細(xì)胞亞群在正常范圍。染色體分析：正常核型（46，XY）。診斷：ANKL。予長春新堿2mg d1，8，15；地塞米松9 mg d1-15；吡柔比星30 mg d1-3聯(lián)合化療。化療效果不佳，第20d加用環(huán)磷酰胺1g，出現(xiàn)高熱而無明確感染征象，消瘦，全血減少，肝功能損害，因經(jīng)濟(jì)原因第28d出院回家，后死亡。

病例2，患者，女，41歲，因"反復(fù)發(fā)熱1月，頭暈、雙下肢乏力1w"入院，血常規(guī)：WBC5.12×109/L，NC3.2×109/L，HB98g/L，PLT73×109/L；骨髓細(xì)胞學(xué)檢查：有核細(xì)胞增生減低，G=45%，E=10%，G/E=4.5；可見16%原始細(xì)胞，此類細(xì)胞大小似淋巴系細(xì)胞，核染色質(zhì)粗，核仁1-2個，形態(tài)上有些似原、幼淋巴細(xì)胞，易見涂抹細(xì)胞。POX染色陰性，粒系增生受抑，紅系增生受抑，單核細(xì)胞無特殊。CD56(+)/CD2(+)/TIA1(+)/穿孔素（+）/GrB(+)/CD99(+)/CD34部分（+）；EBER(+)，結(jié)合免疫組化結(jié)果，組織改變符合ANKL。流式細(xì)胞術(shù)分析：骨髓有一群細(xì)胞占有核細(xì)胞24.3%，其表達(dá)CD2+為82.5%，CD38+為95%，CD56+為85.5%。染色體分析：43（X,-X）-3，-15，4q-，inv(12)。診斷：ANKL。予VTLP方案化療"THP 30mg d1-3 +VCR 2mg d1，8，15,22 +DXM 10mg d1-28逐漸減量+L-ASP1萬U d19-28"。門冬酰胺酶使用第4d因感染家屬拒絕進(jìn)一步使用，化療第26d摔倒后出現(xiàn)幕上腦積水，加強(qiáng)脫水治療仍有高熱伴神志不清。于化療第28d死亡。

2討論

ANKL又稱NK細(xì)胞大顆粒淋巴細(xì)胞白血病，1990年Immamura等首次提出ANKL[1]。一般發(fā)病年齡小于40歲，以發(fā)熱、肝脾腫大和淋巴結(jié)腫大常見。病程進(jìn)展迅速，預(yù)后差，總生存期2個月。目前國內(nèi)外對ANKL尚無統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)，較公認(rèn)的診斷標(biāo)準(zhǔn)為[2]：①常有發(fā)熱及肝、脾、淋巴結(jié)腫大；②中性粒細(xì)胞減低、貧血和血小板減少，外周血淋巴細(xì)胞增多，多為大顆粒淋巴細(xì)胞，但大顆粒淋巴細(xì)胞不是診斷的必要條件；③骨髓穿刺和病理活檢可見大顆粒淋巴細(xì)胞浸潤；④免疫表型為CD2+、表面CD3-、胞質(zhì)CD3+、CD16+、CD56+和CD57-，無TCR重排；⑤EB病毒抗體陽性，或原位雜交顯示大顆粒淋巴細(xì)胞中可見EB病毒mRNA；⑥沒有特異染色體異常，del(6)(q21q25)是較多見的核型異常。⑦排除其他反應(yīng)性大顆粒淋巴細(xì)胞增多癥。

目前ANKL以化療為主，尚無標(biāo)準(zhǔn)治療方案，多數(shù)采用以蒽環(huán)類、烷化劑、長春堿類和糖皮質(zhì)激素為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療，包括CHOP和DVLP等方案。但療效很不理想，許多患者在化療后數(shù)天至數(shù)月內(nèi)死亡。本文病例2加用左旋門冬酰胺酶似乎有一定效果。國外文獻(xiàn)報(bào)道中位生存期為58d，本文2例患者均在1個月內(nèi)死亡。

總之，ANKL是一種罕見的致命性惡性腫瘤，目前對其病因、發(fā)病機(jī)制及細(xì)胞遺傳學(xué)特點(diǎn)及理想治療方案尚待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

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中圖分類號：R733.4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2017.03.029

NK/T細(xì)胞淋巴瘤是一組發(fā)生于淋巴結(jié)外，伴以壞死為主的血管損傷和破壞，細(xì)胞毒表型，和EB病毒（EBV）相關(guān)為特征的淋巴瘤。因?yàn)槎鄶?shù)病例為NK細(xì)胞腫瘤，少數(shù)為T細(xì)胞毒表型而命名為NK/T細(xì)胞淋巴瘤[1]。NK/T細(xì)胞淋巴瘤分布有明顯的區(qū)域性，在亞洲地區(qū)占到T細(xì)胞淋巴瘤的22.4%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于歐美地區(qū)[2]。NK/T細(xì)胞淋巴瘤與EB病毒感染關(guān)系密切，尤其是鼻腔病例，80%～100%都存在EB病毒感染，而鼻外部位NK/T細(xì)胞淋巴瘤EB病毒的檢出率則相對較低（15%～50%）[3]。既往采用傳統(tǒng)的CHOP（環(huán)磷酰胺、阿霉素、長春新堿、潑尼松）類化療方案，NK/T細(xì)胞淋巴瘤的預(yù)后很差。對于Ⅰ/Ⅱ期的早期患者，其完全緩解（complete response，CR）率多數(shù)低于40%，長期生存率僅13%～29%；對于Ⅲ/Ⅳ期的晚期患者，預(yù)后更差，長期生存率僅為10%左右[4]。研究表明，NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞高表達(dá)P糖蛋白，導(dǎo)致進(jìn)入細(xì)胞的化療藥被泵出，是傳統(tǒng)化療方案療效不佳的主要原因[5]。因此探索新的化療方案治療NK/T細(xì)胞淋巴瘤成為一個熱點(diǎn)。我國勇威本等[6]最早提出采用門冬酰胺酶治療，明顯改善了難治復(fù)發(fā)患者的預(yù)后，使得NK/T細(xì)胞淋巴瘤的治療進(jìn)入一個新時代。筆者現(xiàn)將門冬酰胺酶治療NK/T細(xì)胞淋巴瘤的進(jìn)展作一綜述。

1 T冬酰胺酶對早期患者治療的影響

通常將Ⅰ/Ⅱ期的NK/T細(xì)胞淋巴瘤定義為早期患者。含門冬酰胺酶的方案顯著改善了早期患者的預(yù)后。Wang L等[7]回顧性分析321例NK/T細(xì)胞淋巴瘤早期患者，其中85例采用含門冬酰胺酶的方案治療，其余236例采用傳統(tǒng)方案，其5年無進(jìn)展生存（progress free survival，PFS）分別為69.2%和44.1%，總體生存率（overall survival，OS）分別為81%和58%。另一項(xiàng)大規(guī)模的多中心研究則觀察了1273例早期患者，其中單純化療170例，單純放療253例，放化療結(jié)合850例。觀察表明，采用門冬酰胺酶為主的化療方案較傳統(tǒng)化療方案有明顯的優(yōu)勢，5年生存率分別為69.6%和33.9%，進(jìn)一步證實(shí)了門冬酰胺酶在早期患者治療中的意義[8]。

為進(jìn)一步提高療效，降低不良反應(yīng)，有學(xué)者以門冬酰胺酶聯(lián)合吉西他濱、奧沙利鉑和地塞米松的GELOX方案治療早期患者，結(jié)果表明，27例患者中總體反應(yīng)率（overall response rate，ORR）高達(dá)96.3%，其中20例患者達(dá)CR，取得滿意的療效[9]。雖然含門冬酰胺酶方案極大地改善了早期NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者的預(yù)后，但放療在早期患者中仍然十分重要。Zang等[10]觀察了早期放療對NK/T細(xì)胞淋巴瘤治療的影響，64例局限期鼻型NK/T均接受以門冬酰胺酶為基礎(chǔ)的化療聯(lián)合放療，其中34例采用晚期放療（定義為6周期化療后），30例患者接受早期放療（定義為不晚于3周期化療后接受放療），兩組平均開始放療的時間均為26周，平均隨訪35個月。結(jié)果顯示3年OS和PFS早期放療組分別為84.2%、74.3%，晚期放療組分別為57.6%、55.9%；早期放療組CR和ORR分別為80%和93.3%，而晚期放療組分別為50%和67.6%。58例患者在治療2周期時有反應(yīng)，對這58例患者，早期和晚期放療3年OS（94.4%和58%）和PFS（82.9%和56.3%）仍有區(qū)別。22例進(jìn)展者，4例局部復(fù)發(fā)，18例遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)。因此，即使使用含LASP方案的Ⅰ/Ⅱ期NK/T細(xì)胞淋巴瘤，仍有必要早期放療；即使是初始治療有效，仍有必要早期放療。同步放化療對早期患者也是可行的選擇，30例患者中有26例通過同步放化療達(dá)CR[11]。Jing等[12]則在門冬酰胺酶為基礎(chǔ)的化療方案（培門冬酶、吉西他濱、奧沙利鉑，P-GeMox）上，采用放療-化療-放療的三明治法治療，共觀察38例患者，其中34例為早期患者，其1年OS和PFS分別達(dá)到86.7%和86.6%。

總之，由于以門冬酰胺酶為主的新藥引入，早期NK/T細(xì)胞淋巴瘤的預(yù)后有了明顯改善，多數(shù)患者可以治愈。但是放療的地位仍然十分重要，除少數(shù)患者外，并不推薦單純的化療。

2 門冬酰胺酶對晚期患者治療的影響

對晚期患者，門冬酰胺酶同樣可以改善患者的治療反應(yīng)。Bi等[13]回顧性分析73例Ⅲ/Ⅳ期NK/T淋巴瘤患者，其中11例為Ⅲ期，62例為Ⅳ期；4例接受支持治療，其余69例進(jìn)入分析。46例患者主要接受以CHOP方案為主的化療，23例在此基礎(chǔ)上聯(lián)合門冬酰胺酶治療，增加門冬酰胺酶使得總體反應(yīng)率由32.6%上升至56%，遺憾的是，這一改善并未轉(zhuǎn)化成生存優(yōu)勢，兩組患者的2年OS分別為25.4%和14.9%。提示在CHOP方案為基礎(chǔ)的化療方案上單純地增加門冬酰胺酶可能并不足以改善晚期患者的長期生存。

由于在傳統(tǒng)的蒽環(huán)類化療方案基礎(chǔ)上聯(lián)合應(yīng)用門冬酰胺酶，晚期患者的獲益并不明顯，因此需要探索更多的新藥組合。Wang等[14]觀察了以吉西他濱聯(lián)合門冬酰胺酶、異環(huán)磷酰胺和足葉乙甙（GLIDE）的化療方案治療Ⅳ期或者難治復(fù)發(fā)NK/T淋巴瘤，21例患者中17例完成預(yù)定化療，分別有12例和5例達(dá)CR和PR，ORR為80.9%，平均隨訪24個月，估計(jì)3年OS和PFS分別為56%和35.8%。Kim等[15]在異環(huán)磷酰胺、甲胺蝶呤、足葉乙甙（IMEP）的基礎(chǔ)上聯(lián)合門冬酰胺酶，使得總體治療反應(yīng)率從34.8%提升到90.0%，CR率從21.7%提升到65%，并帶來OS和PFS的收益。表明在強(qiáng)烈化療方案的基礎(chǔ)上，門冬酰胺酶能夠改善患者長期生存。更為強(qiáng)烈的化療方案如SMILE方案（地塞米松、異環(huán)磷酰胺、足乙葉甙、門冬酰胺酶）也能夠使晚期患者獲得較好的長期生存，但治療過程中幾乎所有的患者都會出現(xiàn)粒細(xì)胞缺乏，約三分之二的患者會合并感染[16]。小樣本的觀察表明，SMILE方案治療中感染是僅次于復(fù)發(fā)的死亡原因[17]。因此對晚期患者如何在保證療效的同時，減輕化療的不良反應(yīng)，值得進(jìn)一步探索。

Lei等[18]根據(jù)體外實(shí)驗(yàn)NK/T細(xì)胞的藥敏結(jié)果，選擇藥敏試驗(yàn)中最敏感的幾個藥物，包括吉西他濱、順鉑、地塞米松和培門冬酶組成DDPG方案治療進(jìn)展期NK/T細(xì)胞淋巴瘤。結(jié)果表明，25例患者中21例（84%）獲得反應(yīng)，其中CR 17例（70.8%），2年的OS和PFS分別達(dá)到68.50% 和 61.8%。值得注意的是，該方案的毒副作用較SMILE方案有明顯的改善，粒細(xì)胞缺乏的患者只有58.3%，耐受性要明顯優(yōu)于SMILE方案。對于難治復(fù)發(fā)的患者，該方案也能達(dá)到87.5%的總體有效率，2年P(guān)FS可達(dá)81.4%[18]。Wang等[19]則觀察了P-gemox（培門冬酶、吉西他濱、澳沙利鉑）的療效和不良反應(yīng)，表明該方案Ⅲ到Ⅳ期粒細(xì)胞減少僅為30%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于SMILE方案。

如前所述，EB病毒在NK/T細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)病中有重要的作用。因此有學(xué)者觀察了采用含門冬酰胺酶方案（SMILE）治療時患者EB病毒含量對療效的影響，表明第一療程結(jié)束時EBV含量與預(yù)后相關(guān)，化療前EB病毒拷貝數(shù)高、化療后拷貝數(shù)不能下降者，預(yù)后最差[20]。

3 含門冬酰胺酶方案序貫移植治療NK/T細(xì)胞淋巴瘤

由于傳統(tǒng)化療方案并不理想，在引入門冬酰胺酶前，即使是早期NK/T細(xì)胞淋巴瘤，也有進(jìn)行自體造血干細(xì)胞移植的探索。小樣本的研究表明，在以CHOP方案為主的化療基礎(chǔ)上，增加自體造血干細(xì)胞移植可以改善早期患者的預(yù)后，5年的OS和PFS可達(dá)100%和88.9%[21]。在化療方案中引入門冬酰胺酶后，早期患者的長期生存已經(jīng)達(dá)到80%以上，低?；颊邉t接近100%[7]。因此自體移植在早期患者中的應(yīng)用不再那么重要，可能需根據(jù)患者的危險(xiǎn)分度、治療反應(yīng)去選擇。

對于晚期患者，采用傳統(tǒng)方案化療時，增加自體移植可使患者獲益，2年OS可達(dá)71%[22]。引入了以門冬酰胺酶為主的新的化療方案改善了患者的預(yù)后，仍有相當(dāng)部分患者療效不滿意，自體移植的地位仍然頗為重要。Kim等[17]對27例Ⅳ期NK/T淋巴瘤患者采用SMILE序貫自體移植治療，16例患者達(dá)到CR或PR，其中11例按計(jì)劃完成了自體移植，7例存活；5例未接受自體移植者，僅2例存活。分析表明，治療前EBV是唯一的預(yù)后相關(guān)因素，治療前EBV在60拷貝/μL以上者預(yù)后差。因此對初治患者若EBV拷貝數(shù)高，需首先考慮異基因移植。BM受累者預(yù)后差于BM未受累者，長期生存分別為10%和30%。另一項(xiàng)研究則表明，對于進(jìn)展期患者，自體移植前是否達(dá)CR，是影響移植預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，接受SMILE類方案者，更易獲得CR，從而獲得較好的生存[23]。

自體造血干細(xì)胞移植中仍有部分患者不能獲益，對于部分高危患者需探索異基因造血干細(xì)胞移植一線治療。Wen等[24]對18例晚期患者進(jìn)行了異基因移植，移植m應(yīng)證包括：60歲以下、Ⅳ期且在CR1時有BM侵犯、或化療敏感的復(fù)發(fā)或難治患者。移植后5年OS為57%，EFS為51%，多因素相關(guān)分析表明，誘導(dǎo)方案與移植預(yù)后相關(guān)，以SMILE方案誘導(dǎo)能夠獲得更好的療效。筆者同時觀察到CR1與CR2時移植其預(yù)后無明顯區(qū)別，提示CR1患者不一定需要一線進(jìn)行異基因移植。

4 結(jié)語

以門冬酰胺酶為主的新藥對NK/T細(xì)胞淋巴瘤的治療是劃時代的改變。對于早期患者，多數(shù)可以通過以門冬酰胺酶為基礎(chǔ)的化療聯(lián)合放療達(dá)到長期生存，自體移植可能只適合于高危和難治的患者。對于晚期患者，以門冬酰胺酶為基礎(chǔ)的強(qiáng)烈化療方案可使患者獲益，基于體外藥敏實(shí)驗(yàn)的新藥組合在提高療效的同時，減輕了化療相關(guān)的不良反應(yīng)，值得進(jìn)一步去探索。自體移植可使晚期患者進(jìn)一步獲益，但是對化療未達(dá)CR者，化療前EB病毒負(fù)荷高者，以及骨髓受侵犯者，異基因移植可能是更好的選擇。

參 考 文 獻(xiàn)

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篇4

[關(guān)鍵詞]基底細(xì)胞癌；T淋巴細(xì)胞亞群；NK細(xì)胞；流式細(xì)胞儀；微波治療

[中圖分類號]Q813.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A [文章編號]1008-6455（2013）01-0075-02

Detection of the influence of T-cell subpopulation and Natural killer cells activity of microwave treatment for patients with basal cell carcinoma by flow cytometry

ZHANG Yuan，ZHONG Yi-ping，SUN Le-dong

（Department of Dermatology，Zhujiang Hospital，Southern Medical University，Guangzhou 510515，Guangdong，China）

Abstract： Objective To study the influence of the cellular immune function on The microwave therapy for patients with basal cell carcinoma（BCC）. Methods T-cell subpopulation and percentage of NK cells in peripheral blood of 32 cases with BCC were tested by flow cytometry before and after microwave therapy. Results The percentage of CD3 cells，CD4 cells and NK cells decreased and that of CD8 cells increased in BCC patients，with significant difference from those of controls. After microwave therapy，the percentage of CD4 cells and NK cells in patients with BCC were higher than that of before treatment，the percentage of CD8 cells were lower than that of before treatment. Conclusion BCC patients exist cellular immune function defect，Microwave therapy can enhance the immune function of the BCCpatients.

Key words：basal cell carcinoma；T-cell subpopulation；natural killer cells；flow cytometry；microwave therapy

基底細(xì)胞癌（basal cell carcinoma， BCC）是最常見的皮膚癌之一，以往多采用手術(shù)、放療、化療及免疫治療等傳統(tǒng)治療方法，雖然這些方法效果尚可，但在美容和副作用方面存在一定的局限性。微波治療BCC效果滿意，復(fù)發(fā)率低，副作用少[1]，但其治療機(jī)制尚未完全明了。惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸與機(jī)體的免疫功能密切相關(guān)，我們以前的研究證實(shí)BCC患者存在細(xì)胞免疫功能受損，并與BCC的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸有關(guān)，提示可從提高機(jī)體的免疫功能來尋找有效的治療方法[2]。為了進(jìn)一步了解微波治療BCC癌的機(jī)制，我們應(yīng)用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測了32例BCC患者微波治療前后的T細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料：32例患者均經(jīng)組織病理學(xué)檢查證實(shí)為基底細(xì)胞癌并接受微波治療，其中男20例，女12例，平均年齡56.8歲（15～68歲），平均病程3.7年（2個月～18年），但具有下列情況之一者不列入研究范圍：①伴有自身免疫性疾病、過敏性疾病、嚴(yán)重的系統(tǒng)性疾病、病毒感染性疾病者；②1年內(nèi)用過免疫增強(qiáng)劑或免疫抑制劑者。微波的具體治療方法為先將局部清潔、消毒，予2%利多卡因局部麻醉后，選用雙極觸頭對準(zhǔn)癌組織進(jìn)行多點(diǎn)熱化凝固，然后清除已凝固的壞死組織，反復(fù)多次對癌組織進(jìn)行熱化凝固，直到暴露出基底正常組織。治療范圍超出癌灶邊緣5 mm。對范圍特別大的基底細(xì)胞癌，可分次治療。經(jīng)過上述方法治療后，接著按下微波機(jī)的熱療檔，選用直徑為7 cm的圓形發(fā)熱器對準(zhǔn)創(chuàng)面進(jìn)行照射，輸出功率為40～50W，發(fā)熱器距創(chuàng)面10～15 cm，以患者有溫?zé)岣袨槎取Ｕ丈鋾r注意充分暴露創(chuàng)面，照射完畢局部外涂復(fù)方紅汞溶液。每日1次，每次20min，1個療程為7～10天[1]。對照組32例，均為我院健康體檢者，其中男19例，女13例，平均年齡57.3歲（16～69歲）。兩組年齡和性別方面無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

1.2 方法：用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測32例BCC患者微波治療前、療程結(jié)束后及32例健康對照組外周血T細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞百分率。具體方法為：2只試管中各加入100μl EDTA抗凝靜脈血，再分別加入20μl的雙標(biāo)單克隆抗體CD3/CD16+56和CD4/CD8，室溫避光副孵育20min后，加500μl紅細(xì)胞溶解液溶解紅細(xì)胞15min，1 000r/min 離心5 min，棄上清，用PBS緩沖液沖洗2次，再以0.5ml PBS緩沖液懸浮細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分析5 000個細(xì)胞（雙標(biāo)記單克隆抗體CD3/CD16+56，CD4/CD8及紅細(xì)胞溶解均購自法國國際免疫公司）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：使用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用配對t檢驗(yàn)，以P

2 結(jié)果

32例BCC患者與對照組比較，CD3、CD4細(xì)胞百分率、CD4/CD8的比值和NK細(xì)胞的百分率均明顯降低，CD8細(xì)胞百分率明顯增高，差異均有顯著性（P

3 討論

檢測外周血T淋巴細(xì)胞亞群及其比值是反映機(jī)體細(xì)胞免疫狀態(tài)的重要參數(shù)之一[3]。我們應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測了BCC患者的外周血T淋巴細(xì)胞亞群，并與健康正常對照組比較，發(fā)現(xiàn)BCC患者CD3、CD4、CD4/CD8值及NK細(xì)胞百分率明顯低于對照組，而CD8卻明顯高于對照組，差異均有顯著性。BCC患者CD3、CD4細(xì)胞降低和CD8細(xì)胞的增高，再次證實(shí)BCC患者細(xì)胞免疫功能有明顯下降，且以免疫抑制現(xiàn)象和自身免疫監(jiān)視能力下降為突出，與我們以前的研究結(jié)果相符[2]，其與BCC的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸有關(guān)。

微波治療BCC時，在微波能量較高時，可使蛋白質(zhì)變性、凝固、壞死，從而達(dá)到去除病灶的目的，且其能有效地解決創(chuàng)面出血的問題，便于在治療過程中觀察病變組織是否清除“干凈”[3]。此外，熱療能加快局部血液循環(huán)及代謝，提高局部免疫力，有利于傷口愈合。值得我們關(guān)注的是微波治療后BCC患者的CD4細(xì)胞百分率、CD4/CD8的比值和NK細(xì)胞的百分率均明顯上升，CD8細(xì)胞百分率明顯下降。提示微波治療BCC除了物理治療作用外，還有可能是通過提高機(jī)體的免疫功能途徑來實(shí)現(xiàn)治療效果。與以往采取的手術(shù)、放療、化療及免疫治療等傳統(tǒng)治療方法相比，微波療法具有經(jīng)濟(jì)、方便、安全、可靠、美觀及促進(jìn)創(chuàng)面恢復(fù)和增強(qiáng)患者細(xì)胞免疫功能等優(yōu)點(diǎn)，值得臨床推廣應(yīng)用[1，3]。

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篇5

【關(guān)鍵詞】鼻腔NK/T細(xì)胞淋巴瘤；放化療；護(hù)理

【中圖分類號】R47 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】1004-7484（2012）13-0293-02

鼻腔NK/T細(xì)胞淋巴瘤是除韋氏環(huán)外[1]中國最常見的結(jié)外非霍奇金淋巴瘤之一，占全部惡性淋巴瘤的2%--10%[2]。鼻腔NK/T細(xì)胞淋巴瘤有超出鼻腔侵犯鄰近組織和器官的傾向，病情進(jìn)展快，治療上多根據(jù)不同的分期合理選用放化療為主的綜合治療方案。我院自2000年1月至2010年12月共有60例確診鼻腔NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者在放療科行放化療綜合治療，現(xiàn)就臨床中的護(hù)理干預(yù)措施報(bào)告如下：

1 資料和方法

1.1 一般資料 60例鼻腔NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者，其中男性39例、女性21例，男性多于女性，男女比例為2∶1，年齡15～75歲，平均45歲， 病程3～20個月，平均病程4個月。病變局限于鼻腔者41例，超出鼻腔累及鄰近結(jié)構(gòu)者19例。

1.2臨床表現(xiàn) 首發(fā)癥狀常為鼻塞、流稀黃水樣涕，病人誤以為“感冒”、“鼻炎”而未引起注意。后期出現(xiàn)持續(xù)鼻塞、血涕、鼻臭、頭痛等，很多病人至此就診。病情進(jìn)一步發(fā)展，常有一個以上病變部位受累，可因累及鼻旁各部位而出現(xiàn)咽痛、面部腫脹、鼻咽部腫塊等。全身癥狀常有發(fā)熱，一般在38℃以上，伴體重下降、疲倦等，部分病人可出現(xiàn)噬血細(xì)胞綜合癥，以發(fā)熱、全血細(xì)胞減少、骨髓中出現(xiàn)吞噬血細(xì)胞的組織細(xì)胞及肝功能迅速衰竭為特點(diǎn)，是病人死亡的一個重要原因。本組患者主要臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性鼻塞45例，涕血30例，鼻及鼻竇部隆起25例，惡臭15例，頸部淋巴瘤腫大12例，硬腭潰爛穿孔8例，鼻黏膜糜爛壞死20例。

1.3治療方法：全組60例中，4例Ⅰ期患者行手術(shù)切除后行放化綜合治療，51例確診后行放化綜合治療，5例單純放療。放射治療方法：醫(yī)生根據(jù)患者的腫瘤情況，在模擬機(jī)定位下確定照射野，原發(fā)灶采用高能χ線或電子線照射，以鼻前“凸”字野或“L”型野為主，輔以單或雙側(cè)耳前野，腫瘤累及后鼻孔和/或鼻咽、頸部淋巴結(jié)者用面頸聯(lián)合野放療，照射30～36Gy后改野保護(hù)脊髓加量放療，頸部淋巴結(jié)受侵時采取頸部切線野照射。靶區(qū)總劑量50Gy，單次劑量為180～200CGY，5次/周。化療方法：一線化療方案多采用CHOP（環(huán)磷酰胺、吡柔比星、長春新堿、潑尼松）為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療，55例行CHOP方案，CHOPE或MAcop-B等方案化療2-6周期，其中30例放化療同時進(jìn)行，20例先放療后化療，10例先化療后放療。

2 護(hù)理

2.1心理評估與護(hù)理

護(hù)士為患者進(jìn)行心理護(hù)理是非常重要的，因?yàn)橛辛藨?zhàn)勝病魔的信心，才可能有奇跡出現(xiàn)?；颊呷朐汉笠皶r進(jìn)行心理評估并給予相應(yīng)的護(hù)理措施。

2.1.1 懷疑心理：患者一旦得知自己患了癌癥，立即坐立不安，多方求證，心情緊張，猜疑不定。因此，醫(yī)務(wù)人員應(yīng)言行謹(jǐn)慎，要探明患者詢問的目的，科學(xué)而委婉地回答患者所提的問題，不可直言，減輕患者的受打擊程度，以免對治療失去信心。

2.1.2恐懼心理：患者確切知道自己患有癌癥，常表現(xiàn)為害怕、絕望，失去生的希望，牽掛親人。護(hù)士應(yīng)同情患者，給予安慰，鼓勵患者積極接受治療，以免貽誤病情，并強(qiáng)調(diào)心理對病情的作用，鼓勵患者以積極的心態(tài)接受治療。

2.1.3悲觀心理：證實(shí)自己患癌癥時，會產(chǎn)生悲觀、失望情緒，表現(xiàn)為失望多于期待，抑郁不樂，落落寡歡。此時護(hù)士應(yīng)給予關(guān)懷，說明疾病正在得到治療，同時強(qiáng)調(diào)心情舒暢有利于疾病預(yù)后。

2.1.4認(rèn)可心理：患者經(jīng)過一段時間后，開始接受自己患有此病的事實(shí)，心情漸平穩(wěn)，愿意接受治療，并寄希望于治療。護(hù)士應(yīng)及時應(yīng)用“暗示”療法，宣傳治療的意義，排除對治療的不利因素，如社會因素、家庭因素等。

2.1.5失望或樂觀心理：因?yàn)閭€人的體質(zhì)和適應(yīng)程度不一樣，治療效果也不盡相同，有的患者病情得到控制，善于調(diào)適自己的心情，同時生活在和諧感情的環(huán)境中，患者長期處于一種樂觀狀態(tài)。有的逐漸惡化，治療反應(yīng)大，經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)重，體力難支，精神委靡，消極地等待死亡。護(hù)士對消極的患者要分析原因，做好心理安慰，及時調(diào)整患者的心態(tài)，做好生活指導(dǎo)；對樂觀的患者，要做好康復(fù)指導(dǎo)。留心觀察心理變化，以便發(fā)現(xiàn)問題及時解決。另外，護(hù)士也要有嫻熟的護(hù)理技術(shù)和良好的心理品質(zhì)，使患者感到心理滿足，情緒愉快。護(hù)士要富有同情心，冷靜熱情，耐心和果斷，有敏銳的觀察力，對不同年齡、性格和地位的患者應(yīng)一律平等，公平公正，取得患者的信賴建立良好的護(hù)患關(guān)系，善于諒解患者的過失，不與患者頂撞，寬宏大量。在語言上，應(yīng)親切耐心，關(guān)懷和體諒，語氣溫和，交談時要認(rèn)真傾聽，不隨意打斷，并注意觀察病情，了解思想，接受合理建議。在交談過程中，要注意保護(hù)性語言，對患者的診斷、治療和預(yù)后，要嚴(yán)謹(jǐn)，要有科學(xué)依據(jù)，切不可主觀武斷，胡亂猜想。

2.2 放化療前的護(hù)理干預(yù)措施

篇6

【關(guān)鍵詞】

宮頸癌；外周血T淋巴細(xì)胞；NK細(xì)胞檢測；臨床意義

The Clinical significane of peripheral blood T lymphocytes and NK cells in cervical cancer patients

WANG Hongning.

Zongnan Womens Hospital, Chengdu 610041, China

【Abstract】 Objective To investigate peripheral blood T lymphocytes in patients with cervical cancer and NK cells and its clinical significance Methods From Jan.2009 to Jan.2011,214 cases of cervical cancer patients were admitted, selected over the same period 200 cases of physical examination (medical group), peripheral blood T lymphocytes and NK cells were detected and compared Results The cervical cancer group and medical group significant difference(P

【Key words】

Cervical cancer；Peripheral blood T lymphocytes；NK cell detection；Clinical significance

T細(xì)胞亞群是反映細(xì)胞免疫功能的重要指標(biāo)之一，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后與機(jī)體的免疫功能，特別是與T淋巴細(xì)胞功能有密切的關(guān)系，在腫瘤免疫監(jiān)測中起著重要的作用［1］。而腫瘤患者以T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫存在不同程度的紊亂與缺陷。宮頸癌是女性最常見的生殖道惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅婦女的健康，近年來其發(fā)病率有明顯上升趨勢，我們對宮頸癌患者外周血T淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞進(jìn)行檢測，了解其臨床意義，具體匯報(bào)如下。

1 資料與方法

11 一般資料 選取2009年1月至2011年1月收治的宮頸癌患者214例，年齡38~71歲，平均658歲。所有病例檢測前均未經(jīng)放療或化療。依據(jù)《新編常見惡性腫瘤診治規(guī)范》

對214例宮頸癌患者(宮頸癌組)進(jìn)行腫瘤分期，Ⅰ期102例，Ⅲ期68例，Ⅲ期30例，IV期14例。選取同期進(jìn)行健康體檢200例(體檢組)，進(jìn)行外周血T淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞檢測兩組在年齡上比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。

12 檢測方法 儀器和試劑熒光標(biāo)記單克隆抗體：鼠抗人CD3PC5/CD4FITC/CD8PE三色標(biāo)記和同型對照鼠抗人IgG1PC5/IgGlFITC/IgGPE均購自法國Immunotech公司。BeckmanCouIter EPICS XL型流式細(xì)胞儀購自美國BeckmCruIter公司。采集晨起空腹新鮮抗凝靜脈血2 ml，肝素抗凝；取外周血100 μl，加入上述單抗20 μl，混勻，室溫避光20 rain染色；加入15 ml紅細(xì)胞裂解液，混勻后室溫避光放置10 min，破壞紅細(xì)胞；1 500 r/min離心5 min，棄上清；每管加入2 ml 01％疊氮鈉的磷酸鹽緩沖液混勻，1 000 r/rain離心5 min，棄上清；加PBS 1 ml，混勻，2 h內(nèi)上機(jī)檢測。FCM激光為冷亞激光，波長488 nm，采用flowcheck調(diào)整光路，用同型對照

調(diào)電壓，以SSC為橫座標(biāo)，F(xiàn)SC為縱座標(biāo)，構(gòu)建散點(diǎn)圖，在散點(diǎn)圖上采用設(shè)門技術(shù)分析淋巴細(xì)胞群中CD+3，CD+3CD+4和CD+3CD+8抗原表達(dá)情況，每份標(biāo)本計(jì)數(shù)1×105細(xì)胞。

13 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 130統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分

析，因數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，故采用秩和檢驗(yàn)，P

2 結(jié)果

對兩組病例進(jìn)行外周血T淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞的檢測，觀察體檢組、宮頸癌組(Ⅰ期 、Ⅲ期、 Ⅲ期、IV期)變化并比較，具體見表1.

表1

3 討論

機(jī)體的免疫系統(tǒng)是在生物進(jìn)化中逐步建立起來的，其存在與功能的正常建立在機(jī)體穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上。在正常情況下，機(jī)體的自身免疫功能可以防御病原微生物的侵襲，消除體內(nèi)損傷或變老的自身細(xì)胞，處理體內(nèi)出現(xiàn)的少量異常細(xì)胞。在抗腫瘤免疫中，細(xì)胞免疫占據(jù)著重要的地位。細(xì)胞免疫應(yīng)答主要是T細(xì)胞介導(dǎo)的特異性細(xì)胞免疫，已證明T細(xì)胞具有有效的抗腫瘤作用［2］。對于T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞等細(xì)胞免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞的研究已經(jīng)成為現(xiàn)代腫瘤免疫學(xué)研究的重點(diǎn)。

胸腺依賴性淋巴細(xì)胞即T淋巴細(xì)胞又是細(xì)胞免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分。機(jī)體內(nèi)的T淋巴細(xì)胞能識別腫瘤細(xì)胞，在接受腫瘤細(xì)胞刺激后，轉(zhuǎn)化為能攻擊和殺傷腫瘤細(xì)胞的致敏淋巴細(xì)胞，有著免疫監(jiān)視機(jī)能。一旦這種監(jiān)視機(jī)能遭到破壞，患腫瘤的危險(xiǎn)就將增加。

CD+3抗原分子通常分布在成熟T細(xì)胞表面，故CD+3T細(xì)胞數(shù)量可代表機(jī)體總T細(xì)胞數(shù)量，而CD+4T細(xì)胞通常代表T輔助細(xì)胞，CD+8T細(xì)胞通常代表T抑制細(xì)胞，CD+4/CD+8比值反映了機(jī)體細(xì)胞免疫功能狀態(tài)是否穩(wěn)定，比值降低代表細(xì)胞免疫功能降低。NK細(xì)胞是在腫瘤早期發(fā)揮作用的效應(yīng)細(xì)胞，不需要預(yù)先接觸抗原，無組織相容性復(fù)合體(MHC)限制性，不依賴抗體或補(bǔ)體即可直接殺傷MHCl類基因表達(dá)低下或缺如的腫瘤細(xì)胞，被稱為抵抗腫瘤生長的第一道防線，其表面標(biāo)志是CD+16CD+56［3］。

宮頸癌患者的T細(xì)胞亞群與正常人相比，當(dāng)具有免疫反應(yīng)活性的CD+4細(xì)胞減少，而具有免疫抑制功能的CD+8細(xì)胞升高時，可能引起機(jī)體的免疫平衡失調(diào)，造成惡性腫瘤患者的免疫功能減退或受到腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生大量的免疫抑制因子(TDSF)，可廣泛抑制殺傷細(xì)胞的活性，同時在腫瘤抗原的刺激下，脾細(xì)胞免疫抑制細(xì)胞前體被激活，分泌免疫抑制因子，造成宮頸癌患者免疫功能低下［4］。NK細(xì)胞在殺傷腫瘤細(xì)胞的過程中消耗了大量的NK細(xì)胞，以及TDSF使NK活性降低，NK細(xì)胞在血液循環(huán)中再分布等原因?qū)е聦m頸癌患者NK細(xì)胞降低［5］。

通過對兩組進(jìn)行觀察宮頸癌患者的T細(xì)胞亞群與正常人相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CD+4細(xì)胞減少、CD+8細(xì)胞升高。并且隨著宮頸癌患者病情的發(fā)展，Ⅰ期 、Ⅲ期與Ⅲ期、IV期外周血T淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞的檢測比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

參考文獻(xiàn)

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篇7

【關(guān)鍵詞】鼻腔NK/T細(xì)胞淋巴瘤；放射治療；皮膚過敏

放射治療是治療惡性腫瘤的主要手段之一，約70%的腫瘤患者需要進(jìn)行放療[1]。但放射治療是一把雙刃劍，在治療腫瘤的同時也會對周圍正常組織造成損傷。在放療過程中，隨著放射劑量的增加，患者照射野皮膚因放射線的影響會出現(xiàn)一定的放射性反應(yīng)。急性放射性皮炎是放射治療中常見的并發(fā)癥，約占頭頸部惡性腫瘤放療患者中的90%以上[2]。但非照射野部位出現(xiàn)皮膚過敏的報(bào)道較少。

我科于2012年6月收治了一例鼻腔NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者，在放射治療過程中，2次出現(xiàn)照射野皮膚（顏面部、鼻翼）及非照射野皮膚（頸部、胸部、右上肢）皮膚過敏（皮疹、滲液、破潰、結(jié)痂），通過治療與護(hù)理，患者住院70天，好轉(zhuǎn)出院?，F(xiàn)將護(hù)理體會報(bào)告如下。

1病例介紹

患者女性，36歲，鼻腔NK/T細(xì)胞淋巴瘤，于2012年3月至5月在外院行4周期“健擇+培門冬酶”方案化療，具體“健擇1.2g，第1、8天靜滴”過程順利，出現(xiàn)Ⅲ°骨髓抑制，經(jīng)對癥治療恢復(fù)正常，化療完畢復(fù)查鼻咽MRI：鼻腔病變較前明顯縮小，雙側(cè)咽喉淋巴結(jié)較前稍縮小，鼻咽、顱底未見明顯異常。建議行局部補(bǔ)量放療DT56Gy，于2012年6月11日為行放射治療而來我院就診。實(shí)驗(yàn)室檢查：白細(xì)胞2.5×10^9/L：中性粒細(xì)胞0.9×10^9/L：紅細(xì)胞3.27×10^12/L：血紅蛋白99g/L：血小板136×10^9/L：肝功能示：谷丙轉(zhuǎn)氨酶41U/L：谷草轉(zhuǎn)氨酶55U/L：腎功能，電解質(zhì)，心肌酶，免疫球蛋白基本正常范圍，EB病毒陰性，大小便常規(guī)正常。無放療禁忌癥，予設(shè)野放療，因患者鼻腔及咽后淋巴結(jié)均有病灶，采用三維適形調(diào)強(qiáng)放療，靶區(qū)為鼻腔、篩竇、患側(cè)上頜竇、鼻咽、上腭、咽后淋巴結(jié)等部位，因放療范圍較大，皮膚、口咽反應(yīng)會較重，放療期間加強(qiáng)健康教育囑患者做好皮膚、口腔、飲食護(hù)理。保持放射野皮膚清潔干燥，避免刺激，充分暴露頸部皮膚，不要穿質(zhì)硬的高領(lǐng)衣服，勿用肥皂、刺激性藥物等，給予皮膚防護(hù)劑外涂。囑患者保持口腔清潔，勤漱口，予維生素B12注射液20mg+0.9%NS250ml注射液含漱。放療至10次，劑量為PTV18Gy，PGTV20Gy時，患者訴稍口干，鼻腔干燥，放療野皮膚色素輕度沉著；放療至18次，劑量為PTV32.4Gy，PGTV36Gy時，患者訴咽喉及鼻腔干燥，疼痛不適，口腔黏膜反應(yīng)Ⅱ級，皮膚色素沉著；放療至22次，劑量為PTV39.4Gy，PGTV44Gy，放療野范圍鼻翼及兩側(cè)皮膚出現(xiàn)皮疹，呈片狀，瘙癢，予抗過敏藥物治療。次日，癥狀未緩解，患者顏面部、頸部、胸部及右上肢均出現(xiàn)片狀皮疹，其中顏面部、鼻翼皮疹反應(yīng)較大，皮膚紅腫，眼瞼水腫，皮溫升高，出現(xiàn)滲液、破潰。予抗過敏、保肝藥物治療及皮疹清洗、換藥護(hù)理，暫停放療。10天后患者皮疹消退，局部結(jié)痂已脫落，恢復(fù)放療。放療次日，頸部皮膚再次出現(xiàn)紅疹，給予抗過敏治療后能順利完成治療?；颊卟∏楹棉D(zhuǎn)，于2012年8月20日出院。

2護(hù)理

2.1病情觀察29/7患者放療至22次，劑量為PTV39.4Gy，PGTV44Gy，照射部位急性放射損傷表現(xiàn)為放射性皮炎2級：為色素沉著，皮膚稍有色素沉著，微黑，有時瘙癢[3]。咽喉及鼻腔干燥，疼痛不適，口腔黏膜反應(yīng)Ⅱ級。鼻腔咽喉干燥疼痛主要為放療皮膚黏膜反應(yīng)，遵醫(yī)囑予地塞米松及核黃素減輕反應(yīng)治療，同時使用核糖核酸提高免疫治療，配合放療順利進(jìn)行。30/7護(hù)士晨間交接班時，患者訴放療野范圍出現(xiàn)皮疹，瘙癢較明顯，查體：生命征平穩(wěn)，鼻翼及兩側(cè)皮膚可見片狀皮疹，略高出皮膚表面，皮疹無化膿點(diǎn)，局部皮膚無紅腫，皮溫不高。醫(yī)師查房后指出：患者放療中，抵抗力較差，容易發(fā)生過敏等癥狀，遵醫(yī)囑給予鹽酸西替利嗪片5mg，氯雷他定分散片10mg，康復(fù)新液10ml含服，復(fù)方地塞米松乳膏涂擦皮疹部位，抗過敏藥物治療。效果無明顯好轉(zhuǎn)，31/7患者顏面部、頸部、胸部及右上肢出現(xiàn)片狀皮疹，顏面部及鼻翼兩側(cè)皮膚紅腫，眼瞼水腫，皮溫升高，有灼熱感，出現(xiàn)滲液、破潰，有少許黃色分泌物流出，伴輕度瘙癢。查白細(xì)胞3×10^9/L，中性粒細(xì)胞比率65.9%：淋巴細(xì)胞比率16.9%，紅細(xì)胞3.55×10^12/L，血小板180×10^9/L，患者白細(xì)胞稍低，因患者目前皮炎較重，故暫時不予升白治療，定期復(fù)查血常規(guī)。肝功能：谷丙轉(zhuǎn)氨酶10U/L：谷草轉(zhuǎn)氨酶17U/L：堿性磷酸酶48U/L：亮氨酰轉(zhuǎn)肽酶11U/L：谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶11U/L：膽堿脂酶8150IU/L：提示肝功能正常。遵醫(yī)囑給予維生素C注射液3g、維生素B6注射液100mg+0.9%NS100ml注射液；復(fù)方甘草酸苷注射液60mg+0.9%NS250ml注射液；地塞米松磷酸鈉注射液5mg+0.9%NS100ml注射液；西咪替丁注射液0.6g+0.9%NS100ml注射液，50滴/min靜脈滴入1次/d，螺內(nèi)酯0.4g，3次/d口服等保肝治療。治療過程中嚴(yán)密監(jiān)測患者病情變化，3d后患者顏面部、頸部、胸部及右上肢的片狀皮疹明顯消退，顏面部皮膚見散在分布皮疹，無滲出液，結(jié)痂基本脫落，顏面部腫脹明顯好轉(zhuǎn)，無瘙癢。7d后患者顏面部皮疹基本消退，無滲出，局部結(jié)痂已脫落，右上肢皮疹減少，無瘙癢，無發(fā)熱。第10d遵醫(yī)囑給予再次放射治療，劑量為，次日查房，患者主訴今日頸部皮膚再次出現(xiàn)紅疹，較昨日增多，不排除患者對放射線過敏，繼續(xù)給予抗過敏治療后能順利完成治療。病情好轉(zhuǎn)，于8月20號出院。

2.2皮疹護(hù)理患者放療期間顏面部、頸部、胸部及右上肢出現(xiàn)片狀、大小、形態(tài)不一的淡紅色皮疹，顏面部及鼻翼兩側(cè)皮膚紅腫，有少許黃色分泌物流出，眼瞼水腫，皮溫升高，有灼熱感，伴輕度瘙癢，無發(fā)熱。嚴(yán)密觀察病情變化，特別是觀察：是否有新發(fā)生的皮疹，部位、范圍、程度、時間、數(shù)量，速度、瘙癢、疼痛程度及其他過敏癥狀。①遵醫(yī)囑給予鹽酸西替利嗪片5mg，氯雷他定分散片10mg，康復(fù)新液10ml含服。②護(hù)士用無菌醫(yī)用棉簽取復(fù)方地塞米松乳膏涂擦皮疹部位，2-3次/d。③加強(qiáng)健康教育，指導(dǎo)患者選擇棉質(zhì)、柔軟的衣服及毛巾，可用32-34°C溫水進(jìn)行皮膚擦?。伱娌考氨且韮蓚?cè)皮膚有分泌物處禁止擦洗），動作輕柔，忌用堿性肥皂等洗劑。④顏面部及鼻翼兩側(cè)皮膚給予0.9%NS清洗分泌物3次/d。⑤給予修剪指甲，并告知患者不要抓撓皮疹，防止皮疹感染，同時觀察患者皮疹消退情況，10d后患者皮疹消失未留下瘢痕。

2.3心理護(hù)理患者從發(fā)病到確診及化學(xué)、放射治療階段輾轉(zhuǎn)了全國4所醫(yī)院，其經(jīng)歷了復(fù)雜的心理變化。焦慮、抑郁等消極情緒反應(yīng)，加之放射治療導(dǎo)致的患者皮膚過敏損傷，當(dāng)出現(xiàn)皮膚破潰后，患者表現(xiàn)為更加焦慮、恐懼、悲觀，對放射治療產(chǎn)生了強(qiáng)烈的焦慮、恐懼心理，懷疑疾病治療和護(hù)理的有效性，進(jìn)而自信心下降，自我認(rèn)同出現(xiàn)障礙。因此，我們與患者及家屬及時溝通，對其皮膚反應(yīng)請皮膚科專家給予會診，并讓患者及家屬參與到治療中來，有助于消除患者緊張、恐懼感，使患者得到家庭溫暖和情感上的支持，增加安全感。給予優(yōu)質(zhì)護(hù)理，與患者建立良好的護(hù)患關(guān)系，增強(qiáng)患者的信任感。加強(qiáng)巡視，嚴(yán)密觀察病情變化，做好各項(xiàng)護(hù)理記錄，及時告知治療護(hù)理過程中好轉(zhuǎn)的信息，讓患者振作起來以樂觀積極心態(tài)配合治療。

2.4出院時健康指導(dǎo)患者出院前心理既覺得治療終于結(jié)束，熬出頭了，但又擔(dān)心治療的效果及預(yù)后，開心同時又焦慮。我們給患者和家屬進(jìn)行健康宣教。①預(yù)防感染患者放療后會出現(xiàn)骨髓抑制，機(jī)體抵抗力下降，很容易感染，囑患者必須注意保暖，預(yù)防感冒。進(jìn)食高蛋白、高維生素、高熱量的食物。②皮膚護(hù)理囑患者需保護(hù)好照射野皮膚，避免冷熱刺激，如熱敷冰袋等，外出防止日光直接照射，局部皮膚不要用手搔抓，皮膚脫屑切忌用手撕剝，平時不能用手摳鼻及用力擠鼻。③口腔護(hù)理頭頸部病人放療后唾液腺分泌少、質(zhì)變粘稠、口腔酸度增加，口腔自潔能力下降利于細(xì)菌繁殖，多存在口腔黏膜充血、口臭、咽痛、聲嘶。護(hù)理措施是保持口腔清潔，可用淡鹽水（500ml溫開水加熟鹽3-4g）或堿性漱口液飯前、飯后漱口，稀釋口腔內(nèi)有害菌群濃度。用軟毛牙刷及含氟牙膏刷牙。若口干，可常使用滋陰生津藥物，如使用金銀花、、麥冬等泡茶飲用。④告知患者一個月后按時復(fù)查，患者來院復(fù)查時，照射野皮膚恢復(fù)正常，無紅腫、瘙癢。

3討論

鼻腔NK/T細(xì)胞淋巴瘤是一種特殊類型的惡性淋巴瘤，其瘤組織常侵犯鼻腔、上呼吸道和消化道，進(jìn)展較快，預(yù)后差，5年生存率小于50%。放射治療仍然是治療鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤的主要手段，但放射治療會使患者發(fā)生不同程度的放射性皮炎，發(fā)病機(jī)理為受照射部位皮膚發(fā)生毛細(xì)血管反應(yīng)性擴(kuò)張，局部充血，出現(xiàn)紅斑、色素沉著及干性脫屑[4]。發(fā)生放射性皮炎的部位為照射野及對穿射線輻射到范圍，而全身皮膚出現(xiàn)對射線反應(yīng)導(dǎo)致皮膚過敏的反應(yīng)較少，考慮外因由放射治療致皮膚受損引起，內(nèi)因?yàn)檫^敏體質(zhì)，個體差異，免疫系統(tǒng)不平衡，與患鼻腔NK/T細(xì)胞淋巴瘤導(dǎo)致免疫力下降有關(guān)。當(dāng)人體免疫功能和皮膚新陳代謝紊亂時，外界刺激會對皮膚造成嚴(yán)重的傷害，這時皮膚就會變薄，而且釋放大量的組織胺，導(dǎo)致皮膚泛紅、紅腫、瘙癢、脫皮等。由于放射性皮炎復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制，做好患者放射野皮膚的護(hù)理，是減輕放射性皮炎的最關(guān)鍵環(huán)節(jié)[5]。在患者放療期間給予優(yōu)質(zhì)、精心護(hù)理，能降低并發(fā)癥的發(fā)生率，使病人順利完成全程放療。

參考文獻(xiàn)

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篇8

【摘要】

本研究探討從人外周血中分選及擴(kuò)增高純度NK細(xì)胞的優(yōu)化技術(shù)。先用miniMACS及陰性免疫磁珠分選方法，從外周血單個核細(xì)胞（PBMNC）得到純化的NK細(xì)胞，隨后在干細(xì)胞培液基條件下，通過IL2、IL12和IL15等細(xì)胞因子的不同組合將培養(yǎng)體系分為IL2組、IL2+IL12組、IL2+IL15組、IL2+IL15+IL12組和對照組（不加任何細(xì)胞因子），分別培養(yǎng)15天，每3天半量換液并補(bǔ)充細(xì)胞因子；檢測分選及擴(kuò)增前后（CD3-CD56+）NK細(xì)胞含量、擴(kuò)增倍數(shù)及擴(kuò)增前后各組在不同效靶比下的殺傷率。結(jié)果顯示經(jīng)：miniMACS陰性免疫磁珠分選后（CD3-CD56+）NK細(xì)胞含量由分選前的11.19±5.25%提高到94.23±3.50%。培養(yǎng)15天后除對照組（CD3-CD56+）NK細(xì)胞純度略下降外，其余4組與擴(kuò)增前無顯著性差異（P＞0.05）。在IL2、IL2+IL12、IL2+IL15、IL2+IL15+IL12培養(yǎng)體系中， NK細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)分別為15.43±1.08，19.87±3.87，50.46±4.31和52.35±6.72，均顯著高于對照組6.14±1.0（P＜0.01），但I(xiàn)L2+IL15與IL2+IL15+IL12組間未見顯著差異（P＞0.05）。各組擴(kuò)增的NK細(xì)胞對K562細(xì)胞的殺傷率均較擴(kuò)增前增強(qiáng)，在不同效靶比下IL2+IL15、IL2+IL15+ IL12組對K562細(xì)胞的殺傷率顯著高于其他組，但兩組間無顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)論：經(jīng)miniMACS免疫磁珠陰性分選得少量NK細(xì)胞后，應(yīng)用IL2+IL15培養(yǎng)條件是獲得高純度NK細(xì)胞的簡單有效方法。

【關(guān)鍵詞】 NK細(xì)胞； miniMACS； 白介素2； 白介素12； 白介素15

Ex Vivo Expansion of Highly Purified NK Cells from Human Peripheral Blood

Abstract

Adoptive immunotherapy using allogeneic natural killer (NK) cells provides to be useful in recipients after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (AlloHSCT)， but its application has been limited by the inability to obtain sufficient numbers of pure NK cells. This study was aimed to optimize the expansion of high purity NK cells from human peripheral blood. First， the NK cells were isolated from PBMNC by using miniMACS (magnetic cellselection) and NK Cell Isolation Kit Ⅱ. Then the isolated cells were cultured in SCEM (Stemline Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium， Sigma) supplemented with 10% human AB serum and different combinations of IL2 and/or IL12， IL15 for 15 days. Cultures were fed with fresh media and cytokines every 3 days， and were evaluated for cell expansion， phenotype， and cytotoxicity at the end of the culture period. The results showed that in group IL2+IL15 and IL2+IL15+IL12， cells were expanded 50.46±4.31 and 52.35±6.72fold respectively， much higher than others（P＜0.01)， but no significant difference between themselves (P＞0.05). And the purity of CD3-CD56+ NK cells was over 94% in all groups except the control. The cytotoxicity of expanded NK cells cultured with cytokines was significantly higher than the starting population at different E:T ratio（P＜0.01)， although the cytotoxicity of IL2+IL15+IL12 group was slightly higher than that of IL2+IL15 group， but no significant difference between themselves (P＞0.05). It is concluded that high purity of NK cells can be efficiently expanded in culture with IL2+IL15.

Key words

natural killer cell; miniMACS ; IL2， IL12， IL1

NK細(xì)胞作為機(jī)體固有免疫的重要組成部分是機(jī)體抗腫瘤、抗感染的第一道天然防線。隨著對NK細(xì)胞生物功能及活化機(jī)制的了解，NK細(xì)胞在造血干細(xì)胞/骨髓移植的輔助治療及腫瘤過繼免疫治療方面的作用倍受關(guān)注。最近在異基因造血干細(xì)胞移植中發(fā)現(xiàn)供者異源反應(yīng)性NK細(xì)胞可以發(fā)揮移植物抗白血病(graftversusleukemia，GVL)效應(yīng)，并減少移植物抗宿主病(graftversushost disease，GVHD)的發(fā)生［1-3］，故輸注供者異源反應(yīng)性NK細(xì)胞已經(jīng)成為臨床移植輔助治療的新策略［4，5］。然而，外周血中NK細(xì)胞含量少（約占淋巴細(xì)胞的5%-7%），且目前尚缺乏有效的體外擴(kuò)增體系，所以NK細(xì)胞的廣泛臨床應(yīng)用受到了限制。目前的許多體外研究均顯示IL2、IL12、IL15對促進(jìn)NK細(xì)胞的分化成熟、活化、增殖及細(xì)胞毒活性有重要作用。本研究從方法學(xué)角度探索提高NK細(xì)胞純度并采用IL2、IL12、IL15等細(xì)胞因子的不同組合，以期優(yōu)化NK細(xì)胞體外擴(kuò)增的效率及純度，為NK細(xì)胞的進(jìn)一步臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

材料

NK細(xì)胞分選試劑盒（NK Cell Isolation Kit Ⅱ，包括熒光標(biāo)記抗體、磁珠）及miniMACS磁珠分選系統(tǒng)、分離柱（MS Column）均購自德國美天意公司（Miltenyi Biotec，Germany）。造血干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基(Stemline Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium，SCEM)為Sigma公司產(chǎn)品，RPMI 1640培養(yǎng)液為Gibco公司產(chǎn)品。人AB血清購自杭州四季青生物制品公司。IL2、IL12、IL15為Cytolab公司產(chǎn)品。左旋谷氨酰胺（Lglutamine）為 Sigma公司產(chǎn)品。流式細(xì)胞儀及熒光抗體FITCCD3、PECD56、FITCIgG1、PEIgG1均為Becton Dickinson公司產(chǎn)品。CCK8 試劑盒（Cell Counting Kit8，新型細(xì)胞檢測MTT法改良試劑）購自日本同仁化工。K562細(xì)胞為我科實(shí)驗(yàn)室長期保存。外周血來源于我院健康獻(xiàn)血者。

外周血采集與單個核細(xì)胞分離

健康獻(xiàn)血者10名，采集肘靜脈外周血20 ml，肝素抗凝，用PBS等體積稀釋后，用淋巴細(xì)胞分離液以密度梯度離心法分離得到單個核細(xì)胞（PBMNC），PBS洗滌1次。

NK細(xì)胞分離純化

將上述PBMNC用溶紅素處理，然后用MACS buffer洗滌1次，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。每107個細(xì)胞重懸于40 μl MACS buffer，加入10　μl NK cell biotinantibody cocktail，4-8℃孵育10分鐘，然后依次加入30　μl MACS buffer、20　μl antibiotin micro beads，4-8℃孵育15分鐘，再次用MACS buffer洗滌標(biāo)記好的細(xì)胞，重懸于500　μl MACS buffer中。選用MS分離柱，安放于miniMACS分離器磁場中，使用前潤濕分離柱，將分離柱放置于合適的細(xì)胞收集管上。將細(xì)胞懸液上柱，用3×500　μl MACS buffer洗柱，收集細(xì)胞。純化前后計(jì)數(shù)單個核細(xì)胞，并以CD3、CD56熒光標(biāo)記抗體分析NK細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞回收效率和純化效率。

細(xì)胞培養(yǎng)

將分離純化的NK細(xì)胞加入含有10%人AB血清、2 mmol/L左旋谷氨酰胺、青、鏈霉素（各100 U/ml）及細(xì)胞因子的SCEM培養(yǎng)體系內(nèi)，調(diào)至細(xì)胞終濃度2×105/ml，然后接種于24孔板，每孔終體積為1 ml；培養(yǎng)體系按細(xì)胞因子的不同組合分為4組： A組：IL2（200 U/ml），B組： IL2(200 U/ml)+IL12(10 ng/ml)，C組：IL2(200 U/ml)+IL15(20 ng/ml)，D組：IL2(200 U/ml)+IL15(20 ng/ml)+IL12(10 ng/ml)，E組：不加任何細(xì)胞因子為對照組。每組復(fù)種3孔，置37℃、5% CO2、飽和溫度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天半量換液并全量補(bǔ)充上述細(xì)胞因子。于培養(yǎng)第0、5、10、15天通過臺盼藍(lán)染色法計(jì)數(shù)并檢測細(xì)胞活性。

免疫表型分析

將取自不同來源的細(xì)胞用熒光抗體CD3FITC、CD56PE標(biāo)記，流式細(xì)胞儀檢測及分析，了解NK細(xì)胞純度。

白血病細(xì)胞系的培養(yǎng)

K562細(xì)胞種于含有10%FCS的 RPMI 1640培養(yǎng)體系中，置37℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

NK細(xì)胞殺傷活性檢測

收集對數(shù)生長期K562細(xì)胞及培養(yǎng)第0、15天NK細(xì)胞。以K562細(xì)胞為靶細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105 /ml；NK細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，根據(jù)不同效靶比分別調(diào)整細(xì)胞密度為1×105 /ml、5×105 /ml、1×106 /ml。按不同效/靶比（1∶1、5∶1、10∶1 ）將效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞混合，同時設(shè)相應(yīng)的靶細(xì)胞孔，效應(yīng)細(xì)胞孔和培養(yǎng)基空白對照孔。每組均設(shè)3個平行孔。置37℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時后每孔加入10 μl CCK8（ Cell Counting Kit8：新型細(xì)胞檢測MTT法改良試劑），混勻，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4小時后用酶標(biāo)儀測定每孔450 nm波長處的OD值。細(xì)胞毒活性的計(jì)算方法：求出3個平行孔的平均值，按以下方法計(jì)算NK細(xì)胞毒活性，以殺傷率%表示。

細(xì)胞毒活性=［1-（效靶細(xì)胞作用孔OD值-效應(yīng)

細(xì)胞孔OD值）/靶細(xì)胞孔OD值］×100%

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均以（±SD）表示，組間比較采用方差分析，所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均采用CHISS 2004統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。

結(jié)

果

NK細(xì)胞純化效率

10名獻(xiàn)血者標(biāo)本顯示，2×107個外周血單個核細(xì)胞經(jīng)分選后可獲得（2.56±1.23）×106個CD3-CD56+細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測NK細(xì)胞（CD3-CD56+）含量由分選前的11.19±5.25%提高到94.23±3.50%（圖1）。

NK細(xì)胞增殖情況

各組實(shí)驗(yàn)條件下NK細(xì)胞計(jì)數(shù)情況見圖2。培養(yǎng)期內(nèi)臺盼藍(lán)染色示細(xì)胞存活率均為95%以上。培養(yǎng)前5天，各組細(xì)胞增殖均較緩慢；最快增殖時間出現(xiàn)于培養(yǎng)第2周，即第7-15天，此階段各組培養(yǎng)條件下NK細(xì)胞均較培養(yǎng)初期顯著擴(kuò)增。培養(yǎng)至第15天IL2組、IL2+ IL12組、IL2+IL15組及IL2+IL15+IL12組NK細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)分別為15.43±1.08，19.87±3.87，50.46±4.31和52.35±6.72，均顯著高于對照組6.14±1.0（P＜0.01）。IL2+IL15組及IL2+IL15+IL12組細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)顯著高于IL2組、IL2+ IL12組（P＜0.01）。在這10例標(biāo)本中，IL2+IL15+IL12組雖然曾獲得一次最大擴(kuò)增倍數(shù)60.8倍，同時平均擴(kuò)增倍數(shù)也略高于IL2+IL15組，但統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示它們的擴(kuò)增效率無顯著差異（P＞0.05）。

NK細(xì)胞擴(kuò)增前后免疫表型分析

取自于培養(yǎng)第15天的細(xì)胞分別標(biāo)記CD3、CD56抗體，結(jié)果顯示在含有細(xì)胞因子的4組培養(yǎng)體系中，CD3-CD56+NK細(xì)胞純度均大于94%，與開始培養(yǎng)時（0天）NK細(xì)胞純度無顯著差異（P＞0.05）。對照組CD3-CD56+NK細(xì)胞純度為83.26±6.39%，較其余各組及培養(yǎng)初始時略有下降（P＜0.05）（圖2）。

NK細(xì)胞對K562細(xì)胞的殺傷作用

分別比較培養(yǎng)15天后各細(xì)胞因子組不同擴(kuò)增體系的NK細(xì)胞及其與擴(kuò)增前的NK細(xì)胞（E0組）對K562細(xì)胞的殺傷率的變化。如圖3所示：各細(xì)胞因子組NK細(xì)胞殺傷活性均較擴(kuò)增前明顯增強(qiáng)（P＜0.01），且NK細(xì)胞對K562 細(xì)胞的殺傷活性呈C組≈D組（P＞0.05）＞B組＞A組＞E組（P＜0.01）。隨著效靶比從1∶1、5∶1到10∶1，各組NK細(xì)胞對K562細(xì)胞的殺傷率均逐步提高（P＜0.01）（圖3）。

討

論

目前的研究證實(shí)，NK細(xì)胞是造血干細(xì)胞/骨髓移植的輔助治療及抗腫瘤免疫中非常有應(yīng)用價值的效應(yīng)細(xì)胞之一。尤其在造血干細(xì)胞/骨髓移植方面，許多的動物實(shí)驗(yàn)和臨床觀察均提示異基因造血干細(xì)胞移植后，供者的異源反應(yīng)性NK細(xì)胞可促進(jìn)植入，阻止T細(xì)胞介導(dǎo)的GVHD，攻擊宿主白血病細(xì)胞發(fā)揮GVL效應(yīng)。故輸注供者異源反應(yīng)性NK細(xì)胞已成為臨床移植輔助治療的新策略。如何獲得高純度、足夠數(shù)量的NK細(xì)胞是臨床應(yīng)用的前提條件。雖然國內(nèi)外有應(yīng)用ClinMACS直接從供者外周血中分選NK細(xì)胞，但用血量大，分選費(fèi)用昂貴，獲得的NK細(xì)胞量仍不能滿足臨床需要，往往需要體外進(jìn)一步擴(kuò)增［6］，這些問題均大大限制其臨床應(yīng)用。近年來Carlens［7］、Klingemann［8］、黎陽等［9］國內(nèi)外學(xué)者都曾嘗試建立人NK細(xì)胞體外擴(kuò)增體系，但仍存在細(xì)胞純度低、擴(kuò)增效率不高，應(yīng)用飼養(yǎng)細(xì)胞等問題，這些研究雖然部分的滿足了科研的需要，但臨床應(yīng)用問題尚未解決。尤其對于移植免疫中對NK細(xì)胞的需要，由于移植前后受者處于特殊的免疫狀態(tài)中，不同免疫細(xì)胞對患者影響不同，故輸注時NK細(xì)胞的純度直接關(guān)系到輸注后的療效。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，先采用miniMACS免疫磁珠分選方法，從正常人外周血中得到高純度的NK細(xì)胞，隨后優(yōu)化NK細(xì)胞培養(yǎng)體系進(jìn)行體外擴(kuò)增，以降低大量分選NK細(xì)胞的昂貴費(fèi)用。從我們NK細(xì)胞分選的實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，流式細(xì)胞儀檢測NK細(xì)胞（CD3-CD56+）含量由分選前的（11.19±5.25）%提高到（94.23±3.50）%，肯定了經(jīng)miniMACS高梯度磁場的NK細(xì)胞陰性免疫磁珠分選方法的分選效果。

進(jìn)一步優(yōu)化NK細(xì)胞體外擴(kuò)增體系時，在選用，含有10%人AB血清、2 mmol/L左旋谷氨酰胺的SCEM培養(yǎng)體系基礎(chǔ)上，我們又選擇細(xì)胞因子IL2、IL12、IL15組成不同的組合。文獻(xiàn)報(bào)道IL2，IL12，IL15均對于促進(jìn)NK細(xì)胞的分化成熟、活化、增殖及細(xì)胞毒活性有重要作用。IL2是一種多功能的炎性細(xì)胞因子，能夠激活NK細(xì)胞，誘導(dǎo)NK細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子的產(chǎn)生［10］。IL12最先從人B淋巴母細(xì)胞系的培養(yǎng)上清液中發(fā)現(xiàn)，它不僅可促進(jìn)NK細(xì)胞的殺傷活性和分泌功能，而且可在體外促進(jìn)NK細(xì)胞的增殖，同時可協(xié)同IL2誘導(dǎo)健康成人NK的細(xì)胞因子激活的細(xì)胞毒作用［11］。IL15在刺激NK細(xì)胞增殖及活化等方面與IL2有許多相似性。當(dāng)然，這與二者都可與IL2受體復(fù)合體的β、γ鏈結(jié)合有關(guān)。然而，IL15還可結(jié)合于1個新的α鏈，即IL15受體［12，13］，故IL15還在促進(jìn)造血干細(xì)胞定向分化為NK細(xì)胞，并對NK細(xì)胞的發(fā)育分化及維持長期體外存活等方面有顯著作用。另外IL2與IL15也具有協(xié)同作用。所以，我們根據(jù)不同細(xì)胞因子組合將培養(yǎng)體系分為4組：IL2組、IL2+IL12組、IL2+IL15組、IL2+IL15+IL12組，以期篩選出最佳組合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：經(jīng)過15天的培養(yǎng)，與對照組相比，上述細(xì)胞因子均能促進(jìn)NK細(xì)胞的體外擴(kuò)增，并能保持?jǐn)U增體系中NK細(xì)胞的高純度；其中IL2+ IL12組雖較IL2組添加了IL12，但增殖效果的提高并不明顯，同樣情況也可在上述分組的后2組中看到，這說明IL12在體外對NK細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用遠(yuǎn)不及IL2，兩者結(jié)合并不比單獨(dú)使用IL2更有效，這與前人的一些實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合；同時在IL2組與IL2+IL15組的比較中我們看到，IL15與IL2的組合大大提高了擴(kuò)增倍數(shù)，由單獨(dú)使用IL2 時的15.43±1.08倍增至50.46±4.31倍，說明IL15能顯著促進(jìn)NK細(xì)胞的體外擴(kuò)增，并可協(xié)同IL2大大提高擴(kuò)增效率；而IL2+IL15+IL12組在實(shí)驗(yàn)中雖然有1例標(biāo)本獲得了最大增值倍數(shù)60.8倍，但統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示其并不比IL2+IL15組有更好的擴(kuò)增效率。

為了檢測所得NK細(xì)胞的活性，我們在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中分別比較了培養(yǎng)15天后實(shí)驗(yàn)組不同擴(kuò)增體系的NK細(xì)胞及其與擴(kuò)增前的NK細(xì)胞對K562細(xì)胞的殺傷率的變化。結(jié)果各組效靶比與殺傷率呈正比，從1∶1、5∶1到10∶1對K562細(xì)胞的殺傷率逐步提高（P＜0.01），這說明在一定條件下，NK細(xì)胞殺傷活性存在量效關(guān)系。其次，各細(xì)胞因子組NK細(xì)胞殺傷活性均較擴(kuò)增前明顯增強(qiáng)（P＜0.01），且殺傷活性呈IL2+IL15組≈IL2+IL15+IL12組（P＞0.05）＞IL2+ IL12組＞IL2組＞對照組（P＜0.01）；體外擴(kuò)增后當(dāng)效靶比為10∶1時，各組對K562 細(xì)胞的殺傷率均在60% 以上，其中IL2+IL15組、IL2+IL15+IL12組接近100%。即使當(dāng)效靶比1∶1時，這兩組NK細(xì)胞對K562細(xì)胞的殺傷率也從擴(kuò)增前的17%提高到45%，NK細(xì)胞活性顯著增強(qiáng)（P＜0.01）。另外結(jié)果還顯示，雖然IL12可增強(qiáng)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，但其效果略遜于IL2及IL15，尤其后二者的組合可在效靶比為10∶1時達(dá)到近乎100%的殺傷率。

總之，經(jīng)miniMACS免疫磁珠陰性分選得少量高純度NK細(xì)胞后，在含IL2(200 U/ml)+ IL15(20 ng/ml)的SCEM（含10%人AB血清的）培養(yǎng)條件下，我們可以獲得純度高、細(xì)胞毒活性強(qiáng)、增殖倍數(shù)較高的NK細(xì)胞，同時培養(yǎng)擴(kuò)增條件簡單，成本較低，為NK細(xì)胞用于造血干細(xì)胞/骨髓移植的輔助治療及腫瘤過繼免疫生物治療奠定了良好基礎(chǔ)。

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篇9

【摘要】 目的： 研究急性白血病患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞水平變化及臨床意義。方法： 采用流式細(xì)胞儀對32例急性白血病患者 (急性髓細(xì)胞性白血病23例、急性淋巴細(xì)胞性白血病9例)及18例正常人外周血T淋巴細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞水平進(jìn)行檢測。結(jié)果： 初治急性白血病組與正常對照組比較，CD3+細(xì)胞、CD4+細(xì)胞、CD4+/CD8+比值及NK細(xì)胞下降（P0.05）。化療后12例取得完全緩解，再次檢測上述指標(biāo)接近正常對照組（P>0.05）。初診急性淋巴細(xì)胞性白血病組CD4+細(xì)胞及CD4+/CD8+比值低于初診急性髓細(xì)胞性白血病組（P

【關(guān)鍵詞】 急性白血??； T細(xì)胞亞群； NK細(xì)胞

［Abstract］ Objective: To study the changes of T lymphocyte subsets，NK cells in peripheral blood of patients with acute leukemia and its clinical significance.Methods： The different level of peripheral blood T lymphocyte subsets， NK cells of 32 acute leukemia patients and 18 normal controls were detected with flow cytometry. Results： Compared with the normal controls， the number of CD3+ T cell， CD4+T cell， NK cell and CD4+/CD8+ ratio reduced in newly diagnosed acute leukemia group(P0.05).Twelve of 32 patients achieved complete remission after chemotherapy.Their level of T lymphocyte subsets，NK cells near those of normal controls（P>0.05）.The number of CD3+ T cell and CD4+/CD8+ ratio in newly diagnosed acute lymphoblastic leukemia group were lower than those in newly diagnosed acute myelogenous leukemia group(P

［Key words］ acute leukemia; T lymphocyte subsets; NK cell

急性白血病（acute leukemia，AL）是造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病，其發(fā)生及發(fā)展與機(jī)體免疫紊亂有著密切的關(guān)系。在抗腫瘤免疫效應(yīng)中，細(xì)胞免疫比體液免疫起著更為重要的作用。T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞執(zhí)行細(xì)胞免疫功能，是機(jī)體抗腫瘤免疫的重要活性細(xì)胞。本文采用流式細(xì)胞術(shù)（flowcytometry，F(xiàn)CM）檢測急性白血病患者及健康人群外周血T淋巴細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞的水平，并探討其臨床意義。

1 材料和方法

1.1 材 料

32例急性白血?。ˋL）外周血標(biāo)本均來自我院住院患者。其中男14例，女18例，年齡15～72歲，中位年齡41歲；急性髓細(xì)胞性白血病(acute myelogenous leukemia，AML)23例，急性淋巴細(xì)胞性白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)9例。初診患者分別于化療前、完全緩解后采集外周靜脈血2 ml，枸櫞酸鈉抗凝。18例正常對照外周血標(biāo)本采自健康體檢者。

1.2 方 法

取100 μl上述抗凝血分別加入4個試管中，每管加入抗CD45PerCP 10 μl。各管再依次加入抗CD3-FITC+CD19-PE、抗CD3-FITC+CD4-PE、抗CD3-FITC+CD8-PE、抗CD3-FITC+CD16CD56-PE各10 μl，避光室溫充分結(jié)合20 min后，每管加入溶血素2 m1，避光放置至透明后1 000 r/min 離心5 min，棄去上清液體，加入2 m1 PBS在混合器上使試管底部的細(xì)胞與PBS溶液混勻，1 000 r/min離心5 min，最后加入0.4 ml PBS溶液混勻直接上流式細(xì)胞儀（美國BD公司）檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS12.0處理數(shù)據(jù)，結(jié)果以±s表示，用t檢驗(yàn)方法比較各組間差異。

2 結(jié) 果

32例急性白血病患者T淋巴細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞的水平變化見表1。由表1可見: 與緩解AL組相比較，初診AL組外周血CD3+細(xì)胞、CD4+細(xì)胞、CD16+CD56+細(xì)胞及CD4+/CD8+比值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。初診AL組與對照組相比較有類似的結(jié)果。而緩解AL組外周血CD3+細(xì)胞，CD4+細(xì)胞，CD8+細(xì)胞、CD4+/CD8+比值及CD16+CD56+細(xì)胞與對照組相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。初治ALL組與AML組相比較，ALL組CD4+細(xì)胞及CD4+/CD8+比值低于AML組，兩者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。表1 急性白血病患者及正常對照組外周血T細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞水平

3 討 論

機(jī)體的細(xì)胞免疫異常可使腫瘤細(xì)胞逃避宿主的免疫監(jiān)視，最終發(fā)生腫瘤。CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞在體內(nèi)抗腫瘤免疫中具有重要的作用。

CD4+細(xì)胞能輔助T細(xì)胞、B細(xì)胞活化，后兩者活化釋放的大量細(xì)胞因子能促進(jìn)CD8+T細(xì)胞及吞噬細(xì)胞的活性，并影響B(tài)細(xì)胞抗體的產(chǎn)生，從多方面調(diào)節(jié)和增強(qiáng)抗腫瘤效應(yīng)。CD8+細(xì)胞常在免疫應(yīng)答后期增多，除可對靶細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC）外，還能識別可溶性抗原，分泌抑制因子，減弱或抑制免疫應(yīng)答，對CD4+細(xì)胞有調(diào)節(jié)性抑制作用。CD4+/CD8+比例平衡是維持免疫內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的一個中心環(huán)節(jié)，是機(jī)體免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的重要樞紐，反映了機(jī)體免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)能力［1］。這種免疫平衡紊亂時，可引起繼發(fā)性免疫缺陷。本組資料分析了32例不同類型急性白血病患者的T淋巴細(xì)胞亞群，發(fā)現(xiàn)初治AL患者CD3+、CD4+細(xì)胞以及CD4+ /CD8+比值明顯降低。其他惡性血液病如非霍奇金氏淋巴瘤中有類似的變化［2，3］，在兒童急性白血病中也有類似報(bào)道［4，5］。這些提示白血病患者輔T細(xì)胞數(shù)量或功能低下，機(jī)體識別和殺傷白血病細(xì)胞的能力下降，與白血病的發(fā)生發(fā)展有一定的關(guān)系。本組資料還提示，化療后緩解的患者，T淋巴細(xì)胞各亞群抗原表達(dá)接近正常，細(xì)胞免疫功能得到一定程度恢復(fù)。通過分析我們還發(fā)現(xiàn)，與AML比較，ALL患者CD4+細(xì)胞、CD4+/CD8+比值降低程度更顯著，提示原發(fā)于淋巴系統(tǒng)腫瘤的細(xì)胞免疫功能更低下。

CD16+CD56+是自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）的標(biāo)志物，表達(dá)的量可能與NK細(xì)胞的數(shù)量或功能有關(guān)。NK是重要的天然免疫細(xì)胞， 起源于CD34+造血細(xì)胞，在骨髓微環(huán)境內(nèi)發(fā)育，形成具有免疫活性的成熟型細(xì)胞。它不需預(yù)先致敏，無MHC限制性，即可自發(fā)地殺傷MHC1類分子缺陷或低表達(dá)的腫瘤細(xì)胞， 具有廣譜的抗腫瘤、抗感染、免疫調(diào)節(jié)等作用，在機(jī)體免疫監(jiān)視過程中發(fā)揮重要功能。分析本組資料發(fā)現(xiàn)AL患者化療前CD16+CD56+細(xì)胞明顯降低，與樓瑾［6］等的研究結(jié)果相似，而化療后完全緩解者CD16+CD56+細(xì)胞又恢復(fù)到正常水平，進(jìn)一步說明初發(fā)急性白血病NK細(xì)胞免疫功能明顯受損。

由于初治AL與緩解AL的T淋巴細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞的水平有明顯差異，檢測T淋巴細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞水平在評價AL療效及判斷預(yù)后方面具有一定的臨床價值。其臨床意義還有待積累更多病例進(jìn)行深入研究。

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篇10

【關(guān)鍵詞】 雙歧桿菌DNA;，巨噬細(xì)胞;，蛋白激酶C;，核因子

Influence of bifidobacterium DNA on PKC and NFκB in murine macrophages

[Abstract] AIM: To explore the influence of DNA of bifidobacteriua adolescence on PKC and NKκB of murine macrophages. METHODS: The fluorescent intensity of PKCα、 PKCβI、 PKCβII、 PKCγ、 PKCε and PKCζ in murine peritoneal macrophages was detected by using laser confocal microscope. The density of NKκB+ macrophages was detected by immunocytochemical staining. RESULTS: The average fluorescent intensity of PKCα and PKCβII produced by mouse peritoneal macrophages in bifidobacterium DNA injection group was markedly higher than that in control group（P0.05）. The density of NKκB+ macrophages in bifidobacterium DNA injection group was markedly higher than that in control group（P

[Keywords]bifidobacterium DNA; macrophage; protein kinase C; nuclear factorκB

[摘 要] 目的: 探討青春型雙歧桿菌的DNA對巨噬細(xì)胞中6種PKC和NFκB的影響。方法: 通過激光共聚焦顯微鏡觀察小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中PKCα、 PKCβI、 PKCβII、 PKCγ、 PKCε和PKCζ的熒光強(qiáng)度， 以免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測巨噬細(xì)胞中NFκB+細(xì)胞的密度。結(jié)果: 雙歧桿菌DNA注射組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中， PKCα和PKCβII的平均熒光強(qiáng)度明顯高于對照組（P0.05）。雙歧桿菌DNA注射組巨噬細(xì)胞中， NFκB+細(xì)胞的密度顯著高于對照組（P

[關(guān)鍵詞]雙歧桿菌DNA; 巨噬細(xì)胞; 蛋白激酶C; 核因子κB

雙歧桿菌是人體和動物腸道內(nèi)數(shù)量最多的生理性厭氧菌， 能調(diào)節(jié)腸道的微生態(tài)平衡， 也有抗腫瘤、 抗感染和免疫激活等多種重要的功能[1]。目前研究發(fā)現(xiàn)， 雙歧桿菌的DNA中含有非甲基化的胞嘧啶磷酸鳥嘌呤基序(cytidinephosphateguanosine， CpG DNA)， 可作為免疫刺激序列(immunostimulatory sequence)激活樹突狀細(xì)胞(DC)， 上調(diào)其表面分子和共刺激分子(如CD69、 MHCI、 MHCII類分子、 CD80以及CD86等)的表達(dá)。同時， 其還能激活NK細(xì)胞和B細(xì)胞， 使之產(chǎn)生較多量的IFNγ和抗體[2]。此外，其亦可激活巨噬細(xì)胞， 增強(qiáng)其吞噬和細(xì)胞毒作用， 并分泌較多量的IL1及IL6， 但其具體的作用機(jī)制目前仍不清楚[3]。本研究中應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡和免疫細(xì)胞化學(xué)染色法， 檢測了青春型雙歧桿菌的DNA對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中PKC和NFκB的影響， 旨在探討其激活巨噬細(xì)胞的信號途徑。

1 材料和方法

1.1 材料 BALB/c小鼠， 6~8周齡， 雌雄各半， 體質(zhì)量為18~23 g， 購于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。兔抗鼠PKCα、 PKCβI、 PKCβII、 PKCγ、 PKCε和PKCζ， 購自New England Biolab公司。FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG、 兔抗p65抗體和生物素化的羊抗兔IgG， 均購自北京中山生物技術(shù)有限公司。溶菌酶和LPS為Sigma公司產(chǎn)品。其他生化試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 菌種來源及其培養(yǎng) 雙歧桿菌由本室從健康嬰兒糞便中分離培養(yǎng)獲得， 經(jīng)API20A及TAB系統(tǒng)和多次生化反應(yīng)鑒定為青春型。實(shí)驗(yàn)時， 將雙歧桿菌接種至硫乙醇酸鹽肉湯中， 置厭氧培養(yǎng)箱， 于37℃培養(yǎng)72 h。將含菌培養(yǎng)液以3000 r/min離心10 min， 去上清， 沉渣以PBS液洗3次， 并調(diào)整細(xì)菌數(shù)為1×1013/L。

1.2.2 雙歧桿菌DNA的制備和鑒定 將雙歧桿菌接種于硫乙醇酸鹽肉湯中， 置厭氧培養(yǎng)箱中于37℃培養(yǎng)72 h。收集細(xì)菌， 加入溶菌酶（1 g/L）與SDS（終濃度為10 g/L）裂解菌體后， 用飽和酚抽提去除菌體蛋白并透析。用紫外分光光度計(jì)測定所提取的雙歧桿菌基因組DNA的A260/A280為1.976。測定DNA的濃度后， 經(jīng)薄板層析證實(shí)，所制備的雙歧桿菌DNA中無脂多糖存在， 冷凍干燥后備用[4]。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組及雙歧桿菌DNA的處理 實(shí)驗(yàn)動物分為兩組， 即(1)雙歧桿菌DNA注射組: 20只小鼠， 于實(shí)驗(yàn)的第1天向小鼠腹腔注射100 g/L硫乙醇酸鹽肉湯2 mL， 第2天起腹腔注射雙歧桿菌DNA 0.2 μg， 每天1次， 連續(xù)5 d。 (2)對照組: 動物的數(shù)量及第1天的處理措施均同雙歧桿菌DNA注射組， 不同之處為第2天起向其腹腔注射PBS液0.2 mL， 每天1次， 連續(xù)5 d。

1.2.4 巨噬細(xì)胞的收集及培養(yǎng) 于實(shí)驗(yàn)的第7天， 常規(guī)消毒小鼠腹部的皮膚， 以冷的Hank’s液灌洗腹腔。洗出液以1000 r/min離心10 min， 去上清， 沉渣以無血清的RPMI1640培養(yǎng)液重懸2次， 并調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×109/L。吸取100 μL細(xì)胞懸液加至孔底鋪有蓋玻片的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中， 置37℃、 50 mL/L CO2 孵箱中培養(yǎng)2 h。棄去未貼壁的細(xì)胞， 即得巨噬細(xì)胞。再加入含100 mL/L小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液及LPS(終濃度為10 μg/L)， 500 μL/孔， 繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h。

1.2.5 巨噬細(xì)胞PKC含量的檢測 通過激光共聚焦顯微鏡觀察PKC的熒光強(qiáng)度反映PKC的含量。具體操作步驟為: ①傾去培養(yǎng)孔內(nèi)的培養(yǎng)液， 取出爬有巨噬細(xì)胞的蓋玻片， 滴加3 mL/L H2O2甲醇封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性; ②以0.01 mol/L PBS(pH7.2)液洗滌3次×5 min; ③滴加100 g/L非特異性牛血清白蛋白， 室溫孵育10 min; ④以0.01 mol/L PBS(pH7.2)液洗滌3次×5 min; ⑤分別滴加兔抗鼠PKCα、 抗PKCβI、 抗PKCβII、 抗PKCγ、 抗PKCε和抗PKCζ抗體各100 μL， 工作濃度均為1∶200， 于37℃溫育60 min; ⑥以0.01 mol/L PBS(pH7.2)液洗滌3次×5 min; ⑦滴加1∶100 FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG100 μL， 于37℃溫育30 min; ⑧以0.01 mol/L PBS(pH7.2)液充分洗滌5次×5 min; ⑨用激光共聚焦顯微鏡逐個觀察巨噬細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度。所用激發(fā)波長為488 nm， 發(fā)射波長為475 nm， 每孔于不同視野計(jì)數(shù)100個細(xì)胞以上， 取其平均熒光值作為定量參數(shù)。

1.2.6 NFκB的免疫細(xì)胞化學(xué)染色 取出細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)爬有巨噬細(xì)胞的蓋玻片， 以0.01 mol/L PBS(pH7.2)液洗滌3次， 干燥。染色程序按免疫細(xì)胞化學(xué)SP法常規(guī)進(jìn)行。一抗為兔抗p65抗體， 二抗為生物素化的羊抗兔IgG。以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.2.7 觀察指標(biāo)及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 對每張蓋玻片以16D目鏡測微網(wǎng)在400倍放大下計(jì)數(shù)網(wǎng)格中細(xì)胞核著色的陽性細(xì)胞數(shù)， 每例計(jì)數(shù)10個網(wǎng)格， 取其均值作為該樣本中NFκB+細(xì)胞的密度， 以t檢驗(yàn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。其余各組間的比較也采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 巨噬細(xì)胞中6種PKC含量的檢測 以激光共聚焦顯微鏡觀測巨噬細(xì)胞中PKCα、 PKCβI、 PKCβII、 PKCγ、 PKCε和PKCζ的熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示， 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞被青春型雙歧桿菌的DNA刺激后， 其PKCα和PKCβII的熒光強(qiáng)度明顯高于對照組（P0.05， 表1、 圖1）。

表1 巨噬細(xì)胞中PKCα、 PKCβI、 PKCβII、 PKCγ、 PKCε及PKCζ含量的檢測　略

圖1 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中PKCα表達(dá)的激光掃描共聚焦顯微鏡觀測　略

2.2 雙歧桿菌DNA對巨噬細(xì)胞中NFκB表達(dá)的影響 NFκB主要是由p50和p65組成的異源二聚體。實(shí)驗(yàn)用兔抗p65抗體作為免疫細(xì)胞化學(xué)染色中的一抗， 其結(jié)果即可反映NFκB的存在。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中， NFκB陽性產(chǎn)物表現(xiàn)為黃褐色顆粒狀物。雙歧桿菌的DNA注射組巨噬細(xì)胞中， NFκB陽性產(chǎn)物存在于胞漿和胞核， 但以胞核為主， 其胞核上NFκB陽性產(chǎn)物的密度為（17563±1020）個; 對照組巨噬細(xì)胞中NFκB的陽性產(chǎn)物主要位于胞漿， 其胞核上NFκB陽性產(chǎn)物的密度為（8398±764）個， 兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

3 討論

PKC是結(jié)構(gòu)相近、 依賴鈣、 磷脂和二?；视图せ畹慕z氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的多基因超家族，對細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)起重要作用。目前已闡明， 很多巨噬細(xì)胞的激活劑均能使其胞內(nèi)PKC的濃度上升。Lin等[5]證實(shí)， UTP可激活小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞， 提高磷脂酶A2及花生四烯酸的水平依賴的磷酯酰膽堿磷脂酶 C（PIPLC）的活化以及胞內(nèi)[Ca2+]i濃度的升高， 并證實(shí) PKC的激活亦參與了這一過程。Kumar等[6]報(bào)道， 催乳素能激活小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，使之分泌大量的IL1和NO， 其機(jī)制主要是激活PKC。Shishodia和Um等[7， 8]則分別報(bào)道， 順鉑和II 型肺炎鏈球菌細(xì)胞壁多糖能激活巨噬細(xì)胞， 產(chǎn)生多量的TNFα， 這一過程需要PKC的活化。本研究表明， 雙歧桿菌DNA注射組巨噬細(xì)胞中PKCα和PKCβII的熒光強(qiáng)度明顯高于對照組; 而PKCβI、 PKCγ、 PKCε及PKCζ的熒光強(qiáng)度在兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， 提示青春型雙歧桿菌的DNA能活化巨噬細(xì)胞中的PKCα和PKCβII; 而對PKCβI、 PKCγ、 PKCε和PKCζ的活性無明顯影響。靜息狀態(tài)下， NFκB的同源或異源二聚體與抑制性蛋白IκB結(jié)合而存在于胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時， 可通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激活I(lǐng)κB激酶（IKK）， 導(dǎo)致IκB發(fā)生磷酸并被降解， 于是NFκB釋放出來并被激活， 接著發(fā)生核易位， 和靶基因的特定位點(diǎn)相結(jié)合， 從而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。已知NFκB的活化是巨噬細(xì)胞的激活機(jī)制之一。von Knethen等[9]發(fā)現(xiàn)， 亞致死量的H2O2 能活化小鼠 RAW264.7巨噬細(xì)胞中的NFκB， 進(jìn)而增強(qiáng)環(huán)氧合酶 2 的表達(dá)。Darieva等[10]證實(shí)， BCG能激活小鼠J774巨噬細(xì)胞， 使之分泌多量的IL6、 NO 和TNFα等具有殺瘤活性的效應(yīng)分子， 其機(jī)制主要是增強(qiáng)NFκB DNA的結(jié)合。Liu等[11]報(bào)道， 乳酸桿菌細(xì)胞壁中的肽聚糖（peptidoglycan， PG）可作用于小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞的Tolllike 受體2(Tolllike receptor 2， TLR 2)， 進(jìn)而激活NFκB， 最終增強(qiáng)其細(xì)胞毒活性。Mandrika等[12]也發(fā)現(xiàn)， 具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用的黑色素細(xì)胞刺激激素α(alphamelanocytestimulating hormone， αMSH)能促使巨噬細(xì)胞中的NFκB核轉(zhuǎn)位， 進(jìn)而上調(diào)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶mRNA的表達(dá)， 最終催化底物精氨酸產(chǎn)生多量的NO。李義軍等[13]則證實(shí)， 細(xì)菌內(nèi)毒素能明顯提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞NFκB的活性。本研究表明， 雙歧桿菌DNA注射組巨噬細(xì)胞細(xì)胞核表達(dá)NFκB+細(xì)胞的密度顯著高于對照組， 提示青春型雙歧桿菌的DNA能有效地促進(jìn)巨噬細(xì)胞中NFκB的轉(zhuǎn)位和活化。已知雙歧桿菌的DNA能激活機(jī)體免疫系統(tǒng)中的巨噬細(xì)胞。宋文剛等[14]報(bào)道， 嬰兒型雙歧桿菌的DNA能活化巨噬細(xì)胞， 增強(qiáng)其吞噬功能， 并使之分泌多量的IL1和TNFα。Stacey等[15]證實(shí)， 分叉雙歧桿菌的DNA能刺激巨噬細(xì)胞釋放多量的IL6和 IL12。目前認(rèn)為， 細(xì)菌DNA激活巨噬細(xì)胞的途徑主要為刺激性CpG DNA與巨噬細(xì)胞Toll 樣受體9(Toll like receptor 9， TLR 9)的結(jié)合， 接著誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生多量的活性氧(ROS)。ROS作為第二信使， 進(jìn)一步可活化MAPK和AP1等信號分子， 最終調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)[16]。結(jié)合本研究的結(jié)果， 我們認(rèn)為， 活化PKCα、 PKCβII及 NFκB是青春型雙歧桿菌DNA激活巨噬細(xì)胞的另一途徑。

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