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篇1

【摘要】 目的： 應(yīng)用光譜技術(shù)研究曲克蘆丁(troxerutin， TRO)與牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA) 間結(jié)合作用機(jī)制。方法： 通過熒光光譜法確定曲克蘆丁對BSA的熒光猝滅機(jī)制。依據(jù)熱力學(xué)參數(shù)討論兩者之間的主要作用力類型。利用同步熒光光譜考察曲克蘆丁對BSA構(gòu)象的影響。結(jié)果： 曲克蘆丁對BSA的熒光猝滅機(jī)制為靜態(tài)猝滅;反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)ΔH=-77.06 KJ/mol，ΔS=-152.20 J/(mol·K)。結(jié)論： 曲克蘆丁與BSA之間的主要作用力是范德華力;曲克蘆丁的加入使BSA構(gòu)象發(fā)生了變化。

【關(guān)鍵詞】 牛血清白蛋白; 曲克蘆丁; 熒光猝滅; 同步熒光光譜

[Abstract] Objective: Applied spectroscopy to study the interaction mechanism of troxerutin and bovine serum albumin(BSA).Methods： Fluorescence spectroscopy method was used to determine the fluorescence quenching mechanism of BSA caused by troxerutin.According to the thermodynamic parameters the major force types between troxerutin and BSA was discussd.The effect of troxerutin on bovine serum albumin was also studied by synchronous fluorescence spectrometry.Results： The quenching mechanism of troxerutin to bovine serum albumin was static quenching.The thermodynamic parameters of the reaction was ΔH=-77.06 KJ/mol，ΔS=-152.20 J/(mol·K).Conclusion： The main binding force between troxerutin and BSA was Van derWaals interaction.Troxerutin binding on the bovine serum albumin could change the serum protein conformation.

[Key words] bovine serum albumin; troxerutin; fluorescence quenching;synchronous fluorescence spectroscopy

曲克蘆丁(troxerutin，TRO)系蘆丁經(jīng)羥乙基化制成的半成品黃酮化合物。具有抑制紅細(xì)胞和血小板凝結(jié)，防止血栓形成的作用;同時(shí)能增加血中氧的含量，改善微循環(huán)，促進(jìn)新生血管形成以增進(jìn)側(cè)支循環(huán)的開放[1]。結(jié)構(gòu)見圖1。血清白蛋白是血漿中含量最豐富的載體蛋白，它能和許多內(nèi)源性物質(zhì)廣泛結(jié)合。各種藥物進(jìn)入人體一般都要通過血漿的貯存和運(yùn)輸，而后才能到達(dá)受體部位并發(fā)生藥理作用。

研究藥物與血清白蛋白的相互作用具有重要的理論意義[2]。蛋白質(zhì)的功能與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，研究中藥有效成分對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響，不僅能為確定中草藥有效成分及作用強(qiáng)度提供一定信息，而且對全面闡明小分子化合物與蛋白質(zhì)的結(jié)合機(jī)制也有重要意義，同時(shí)也有利于了解中藥的作用機(jī)制。本文研究了TRO與牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的作用機(jī)制以及溫度對結(jié)合常數(shù)的影響。分析了TRO與BSA的結(jié)合模式，從分子水平認(rèn)識(shí)該反應(yīng)的作用機(jī)制。

圖1 曲克蘆丁的結(jié)構(gòu)

Fig 1 The structure of troxerutin

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

TU1901PC型分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)，LS50B型熒光分光光度計(jì)(美國PerkinElmer公司)，PHS25型PH計(jì)(上海雷磁儀器廠);TRO(中國藥品生物制品檢定所)，牛血清白蛋白(Sigma公司);三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鹽酸、氯化鈉等試劑均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 溶液配制

用0.9%NaCl配成pH=7.4的TrisHCl緩沖液來配制濃度為1.0×10-3 mol/L的TRO儲(chǔ)備液備用;以TrisHCl緩沖溶液(pH=7.4，含0.1 mol/L NaCl 以維持溶液的離子強(qiáng)度)為溶劑配制1.0×10-4 mol/L 的BSA儲(chǔ)備液備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

熒光光譜的測定：取3 ml 1.0×10-6 mol/L的BSA溶液于1 cm的石英比色皿中，用微量注射器逐次加入濃度為1.626×10-3 mol/L的TRO溶液進(jìn)行滴定，加樣體積由實(shí)驗(yàn)點(diǎn)濃度計(jì)算確定(滴定劑累加體積小于100 μl)。以278 nm為激發(fā)波長，繪制300～500 nm波長范圍的熒光光譜;同步熒光光譜實(shí)驗(yàn)中同時(shí)掃描激發(fā)和發(fā)射單色器，固定激發(fā)和發(fā)射波長差分別為60 nm和20 nm，其他同熒光光譜測量。

紫外吸收光譜的測定：移取10 ml 1×10-4 mol/ L 的曲克蘆丁溶液于10 ml比色管中，加入pH=7.4 的TrisHCl緩沖溶液定容至刻度，以TrisHCl 緩沖溶液做參比，測定紫外吸收光譜。

2 結(jié) 果

2.1 紫外光譜的研究

由BSA，TRO及TROBSA(1∶1)復(fù)合體系的紫外吸收光譜(圖2)可以看出，TROBSA復(fù)合體系的吸收光譜與單獨(dú)TRO，BSA的吸收光譜相比，發(fā)生了明顯的減色效應(yīng)。吸收光譜的變化表明TRO和BSA之間的相互作用是在基態(tài)分子中發(fā)生的。

2.2 TRO對BSA的熒光猝滅研究

蛋白質(zhì)能夠發(fā)出熒光是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)中存在三種芳香族氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸。由于這些氨基酸結(jié)構(gòu)不同，其熒光強(qiáng)度之比為100∶9∶0.5，因此大多數(shù)情況下可以認(rèn)為蛋白質(zhì)所顯示的熒光主要由色氨酸殘基貢獻(xiàn)[3]。而當(dāng)激發(fā)波長為278 nm時(shí)，TRO在300～500 nm范圍內(nèi)幾乎無熒光。固定BSA的量，不斷增加TRO濃度時(shí)，BSA內(nèi)源熒光強(qiáng)度有規(guī)律地降低，不同溫度時(shí)的熒光猝滅曲線如圖3，4所示。

C(BSA)=1.0×10-6 mol/L;λ=278 nm;pH=7.4;C(TRO)(AF)：0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5×10-6 mol/L

圖3 25℃時(shí)TRO對BSA的熒光猝滅光譜

Fig 3 Effect of TRO on fluorescence spectrum

of BSA at 25℃

C(BSA)=1.0×10-6 mol/L;λ=278 nm;pH=7.4;C(TRO)(AF)：0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5×10-6 mol/L

圖4 37℃時(shí)TRO對BSA的熒光猝滅光譜

Fig 4 Effect of TRO on fluorescence spectrum

of BSA at 37℃

熒光猝滅通?？煞譃閯?dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅。一般情況下，可依據(jù)不同溫度下的結(jié)果區(qū)別是動(dòng)態(tài)還是靜態(tài)猝滅。對于動(dòng)態(tài)猝滅，隨著溫度的升高，將增加離子有效碰撞的數(shù)目，加劇電子的轉(zhuǎn)移，使熒光物質(zhì)的猝滅常數(shù)隨溫度升高而增大;若是靜態(tài)猝滅則溫度升高將降低復(fù)合物的穩(wěn)定性，使猝滅常數(shù)減小。為了進(jìn)一步闡明其熒光猝滅機(jī)制，分別作出25 ℃和37 ℃時(shí)BSA猝滅的熒光光譜，根據(jù)SternVolmer方程[4]

F0F=1+Kqτ0[Q ]=1+KSV[Q ]

式中F0和F分別為加入猝滅物質(zhì)前后所測得的熒光強(qiáng)度值，τ0為沒有猝滅物質(zhì)存在時(shí)熒光分子的平均壽命。Kq為雙分子碰撞猝滅常數(shù)，[Q ]為猝滅物質(zhì)的濃度， KSV為SternVolmer猝滅常數(shù)，且有KSV=Kqτ0。繪制F0/F-1對[Q ]關(guān)系圖，見圖5。

圖5 25℃和 37℃時(shí)BSA 的SternVolmer圖

Fig 5 SternVolumer curve of BSA with TRO at

25℃ and 37℃

從圖5可以看出，曲線呈良好的線性關(guān)系，且隨著溫度的升高BSA猝滅曲線的斜率降低，可判斷藥物與BSA之間形成了復(fù)合物，猝滅過程為靜態(tài)猝滅。

2.3 結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合常數(shù)的確定

藥物分子和蛋白質(zhì)分子間的相互作用一般采用位點(diǎn)結(jié)合模型來描述，設(shè)蛋白質(zhì)分子(P)上對藥物分子(Q)有N個(gè)等同獨(dú)立的結(jié)合部位。蛋白質(zhì)總濃度為[Pt]，藥物總濃度為[Qt]，蛋白質(zhì)和藥物的游離濃度分別為[P]和[Q]，生成物為QnP，其濃度為[QnP]，則與蛋白質(zhì)結(jié)合的藥物當(dāng)量數(shù)為n[QnP]，設(shè)結(jié)合常數(shù)為K，依據(jù)Scatchard方程[5]可知，確定猝滅機(jī)制后，再將所測得的各個(gè)熒光光譜，按349 nm處的相對熒光強(qiáng)度F0/F對C(TRO)F0/(F0-F)作線性擬合，得到弱堿性條件下TRO與BSA形成復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和相應(yīng)的直線相關(guān)系數(shù)，見表1。結(jié)果表明，TRO與BSA作用時(shí)只有1個(gè)結(jié)合點(diǎn)。表1 BSA和TRO的結(jié)合常數(shù)及方程的相關(guān)系數(shù)

2.4 TRO與BSA作用力的確定

藥物與生物大分子的作用力包括氫鍵、范德華力、靜電引力、疏水作用力等。藥物不同，與蛋白質(zhì)作用類型也不相同。根據(jù)熱力學(xué)參數(shù)與作用力間的關(guān)系，可以確定其作用力類型。熱力學(xué)參數(shù)與主要作用力間的相互關(guān)系如下[6]：ΔH=0，ΔS>0，為疏水作用力;ΔH0，為靜電作用力;ΔH

lnK2K1=ΔH(1T1-1T2)R

ΔG=ΔH-TΔS=-RTlnK

可求得25 ℃時(shí)TRO與BSA反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)ΔH=-77.06 KJ/mol，ΔS=-152.20 J/(mol·K)，ΔG=-31.70 KJ/mol。所以可認(rèn)為TRO與BSA之間的作用力主要為范德華力。

2.5 TRO對BSA構(gòu)象的影響

同步熒光光譜經(jīng)常被用來研究藥物分子對蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響。當(dāng)同步掃描波長差Δλ為60 nm時(shí)，BSA的同步熒光主要是色氨酸殘基發(fā)射的熒光，Δλ為20 nm時(shí)只表現(xiàn)出酪氨酸殘基的熒光。而色氨酸的最大熒光發(fā)射波長與其所處的介質(zhì)環(huán)境有關(guān)。因?yàn)榘被釟埢淖畲蟀l(fā)射波長與其所處環(huán)境的疏水性有關(guān)，所以由發(fā)射波長的改變可判斷蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。

BSA的空間結(jié)構(gòu)由3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，每個(gè)結(jié)構(gòu)域由2個(gè)亞結(jié)構(gòu)以槽口相對的方式形成圓筒狀結(jié)構(gòu)，幾乎所有疏水性氨基酸殘基都包埋在圓筒內(nèi)部構(gòu)成疏水腔[5]。固定BSA濃度，逐漸增大TRO的濃度，記錄Δλ=60 nm和Δλ=20 nm時(shí)的同步熒光光譜圖，發(fā)現(xiàn)最大發(fā)射波長略有移動(dòng)(圖6)。表明TRO的加入導(dǎo)致了BSA構(gòu)象的改變，色氨酸殘基所處環(huán)境的疏水性降低，BSA 內(nèi)部的疏水結(jié)構(gòu)有所瓦解， 肽鏈的伸展程度增加[7 ]。

C(BSA)=1.0×10-6 mol/L; pH=7.4

a：Δλ=20 nm; C(TRO)(A-E)：0，1，2，3，4，×10-6 mol/L

b：Δλ=60 nm; C(TRO)(A-E)：0，1，2，3，4×10-6 mol/L

圖6 BSA的同步熒光光譜

Fig 6 Synchronous fluorescence spectrum of BSA

3 討 論

TRO對BSA產(chǎn)生熒光猝滅，且猝滅過程是由于形成化合物而引起的靜態(tài)猝滅。因?yàn)閯?dòng)態(tài)猝滅是由分子的擴(kuò)散碰撞導(dǎo)致的，隨著溫度的升高，分子的擴(kuò)散速度加快，熒光猝滅會(huì)更嚴(yán)重，猝滅常數(shù)應(yīng)更大。而靜態(tài)猝滅溫度升高將降低復(fù)合物的穩(wěn)定性，使猝滅常數(shù)減小。另外，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，生物大分子的熒光壽命約為10-8 s[8]，各類猝滅劑對生物大分子的最大擴(kuò)散碰撞猝滅速率常數(shù)為2.0×1010 L·(mol·s)-1，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所得KSV值及SternVolmer方程，可以計(jì)算TRO對BSA的熒光猝滅速率常數(shù)Kq遠(yuǎn)大于各類猝滅劑對生物大分子的最大擴(kuò)散碰撞猝滅速率常數(shù)。由此進(jìn)一步證明，TRO對BSA的猝滅是由于形成了配合物而引起的靜態(tài)猝滅。

通過TRO與BSA熒光光譜的研究發(fā)現(xiàn)，不存在藥物時(shí)的BSA熒光強(qiáng)度比存在藥物時(shí)的BSA熒光強(qiáng)度強(qiáng)，表明BSA內(nèi)色氨酸殘基與TRO之間存 在能量轉(zhuǎn)移。

通過對TRO與BSA熒光光譜測定，發(fā)現(xiàn)BSA的內(nèi)源熒光有規(guī)律地降低且略有紅移現(xiàn)象。有研究[9] 認(rèn)為色氨酸的最大熒光發(fā)射峰位對環(huán)境很敏感， 在疏水環(huán)境中其最大峰位約為332 nm，完全顯露于水相中時(shí)約為352 nm，部分顯露于水相中時(shí)則約為342 nm，由此可以認(rèn)為TRO 與BSA 結(jié)合后， 使BSA 的螺旋結(jié)構(gòu)逐漸舒展開來， 從而使色氨酸殘基逐漸從白蛋白的疏水環(huán)境中顯露出來而進(jìn)入水相中， 導(dǎo)致BSA分子的空間構(gòu)象發(fā)生了變化。

參考文獻(xiàn)

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篇2

【摘要】

目的 研究新型光敏劑五聚賴氨酸2羰基酞菁鋅（ZnPc(Lys)5）與牛血清白蛋白（BSA）之間的相互作用。方法 從BSA角度采用熒光光譜法和紫外可見光譜法通過熒光猝滅實(shí)驗(yàn)探討ZnPc(Lys)5與BSA相互作用的猝滅機(jī)制、結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)；從ZnPc(Lys)5角度采用膠束熒光增敏法測定ZnPc(Lys)5濃度通過Scatchard方程計(jì)算ZnPc(Lys)5與BSA相互作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。結(jié)果 熒光猝滅實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ZnPc(Lys)5對BSA的熒光有強(qiáng)烈的猝滅作用，猝滅機(jī)制主要是靜態(tài)猝滅形成基態(tài)配合物。不同溫度（298，303，308，313，318 K）的結(jié)合常數(shù)K1分別為12.1×104 L/mol，7.69×104 L/mol，6.12×104 L/mol，4.57×104 L/mol，3.76×104 L/mol，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)分別為0.93，1.02，1.07，1.13，1.17。Scatchard方程計(jì)算出298 K結(jié)合常數(shù)K2為1.557×105 L/mol，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)位1.07。結(jié)論 從兩個(gè)方面計(jì)算的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)基本一致， ZnPc(Lys)5與血清白蛋白之間主要通過形成基態(tài)配合物的方式相互作用，進(jìn)入血清白蛋白中1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。

【關(guān)鍵詞】 光敏感藥； 光譜法，熒光； 分光光度法，紫外線； 鋅； 聚賴氨酸； 吲哚類； 血清白蛋白，牛

Interaction of Pentalysine βcarbonylphthalocyanine Zinc with Bovine Serum Albumin: Two Methods

LI Chunyan ， RUAN Guanyu， SHAN Li， CHEN Jincan， HUANG Mingdong

School of Pharmacy， Fujian Medical University， Fuzhou 350004， China;Department of pharmacy，F(xiàn)ujian Maternal and Child Health Hospital，F(xiàn)uzhou， 350001， China;State Key Laboratory of Structural Chemistry， Fujian Institute of Structure of Matter，

Chinese Academy of Sciences， Fuzhou， 350002， China

ABSTRACT: Objective To investigate the interaction of pentalysine βcarbonylphthalocyanine zinc (ZnPc(Lys)5) with bovine serum albumin (BSA) by two methods. Methods From the point of BSA， the quenching mechanism， binding constants and sites of the interaction between ZnPc(Lys)5 and BSA was investigated through the fluorescence quenching experiment by fluorescence spectrometry and UVvisible spectroscopy. From the point of ZnPc(Lys)5， the constants and sites of the interaction were calculated through micellar enhanced spectrofluorometric determination of ZnPc(Lys)5 concentration with Scatchard equation. Results The mechanism of fluorescence quenching is static quenching process. The binding constants and the number of binding sites were calculated at different temperatures (298， 303， 308， 313， 318 K): 12.1， 7.69， 6.12， 4.57， 3.76×104 L/mol and 0.93， 1.02， 1.07， 1.13， 1.17， respectively. The binding constant and the number of binding sites calculated from Scatchard equation at 298 K were 1.557×105 L/mol and 1.07， respectively. Conclusion The two methods produce approximately identical data of the binding constant and sites. The results indicate that ZnPc(Lys)5 strongly binds to BSA at a molar ratio of 1∶1.

KEY WORDS: photosensitizing agents; spectrometry， fluorescence; spectrophotometry， ultraviolet; zinc; polylysine; indoles; serum albumin，bovine

已有文獻(xiàn)報(bào)道血清白蛋白在運(yùn)輸光敏劑酞菁過程中扮演著重要的角色，但其與血清白蛋白的相互作用的分子機(jī)制仍未徹底研究［1］。藥物與血清白蛋白相互作用的研究方法有熒光分析法、紫外－可見光譜法、平衡透析法、圓二色譜法、超過濾法、傅立葉變換紅外光譜法、核磁共振波譜及高效親和色譜法等。國內(nèi)外文獻(xiàn)中大多采用熒光光譜法研究藥物與白蛋白的相互作用，該法具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、分析速度快、方法簡單、操作方便、儀器價(jià)廉等優(yōu)點(diǎn)［2］。本文采用熒光方法從兩個(gè)不同的角度研究ZnPc(Lys)5與BSA相互作用：（1）從BSA角度通過熒光猝滅法應(yīng)用著名的SternVolmer方程研究加入不同濃度ZnPc(Lys)5導(dǎo)致BSA中色氨酸（Trp）殘基熒光猝滅，進(jìn)而計(jì)算出表觀猝滅常數(shù)并探討了可能的猝滅機(jī)制和相互作用方式，然后通過雙導(dǎo)數(shù)方程計(jì)算出ZnPc(Lys)5與BSA結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)；（2）從ZnPc(Lys)5角度通過膠束增敏熒光法分別測定結(jié)合態(tài)和游離態(tài)的ZnPc(Lys)5濃度，采用Scatchard方程計(jì)算ZnPc(Lys)5與BSA相互作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

熒光光度計(jì)（Cary Eclipse，美國Varian公司）；多功能酶標(biāo)儀（Synergy 4，美國BioTek公司）；ZnPc(Lys)5由中國科學(xué)院福建物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究所黃明東課題組合成，純度>99.5%；BSA（美國Amerosco公司進(jìn)口分裝）；SDS（美國Sigma公司）；考馬斯亮藍(lán)蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒（福建泰京公司）；其他試劑純度均為分析純以上；實(shí)驗(yàn)用水均為Millipore Q超純?nèi)ルx子水（18.20 mΩ）。

1.2 方法

1.2.1 熒光猝滅法

在離心管中分別加入終濃度2.5 μL/mol的脫脂BSA儲(chǔ)備液，分別精確加入10 μL ZnPc(Lys)5系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，用Tris緩沖液補(bǔ)足至500 μL，搖勻、靜置10 min后，取200 μL加入96孔熒光板中，以290 nm作為激發(fā)波長，測定300～500 nm熒光發(fā)射光譜。

1.2.2 丙酮沉淀BSA和結(jié)合態(tài)ZnPc(Lys)5

ZnPc(Lys)5游離濃度：在離心管中加入2.5 μmol/L的脫脂BSA儲(chǔ)備液，分別精確加入10 μL ZnPc(Lys)5系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，用Tris緩沖液補(bǔ)足至500 μL，搖勻、靜置10 min后，立即加入冰丙酮500 μL，132 000 r/min離心5 min，分別取上清液800 μL，SDS儲(chǔ)備液200 μL，用Tris緩沖液定容至5 mL，待測。

ZnPc(Lys)5總濃度：在離心管中分別精確加入10 μL ZnPc(Lys)5系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，用Tris緩沖液補(bǔ)足至500 μL，搖勻、靜置10 min后，立即加入冰丙酮500 μL，132 000 r/min離心5 min，分別取上清液800 μL，SDS儲(chǔ)備液200 μL，用Tris緩沖液定容至5 mL，待測。

空白對照組：在離心管中加入2.5 μmol/L的脫脂BSA儲(chǔ)備液后，用Tris緩沖液補(bǔ)足到500 μL，振蕩搖勻，靜置10 min后，立即加入冰丙酮500 μL，132 000 r/min離心5 min，分別取上清液800 μL，SDS儲(chǔ)備液200 μL，用Tris緩沖液定容至5 mL，待測。

1.2.3 膠束熒光光譜測定ZnPc(Lys)5濃度

室溫條件下用Cary Eclipse熒光光度計(jì)進(jìn)行熒光光譜的掃描，10 mm石英比色皿進(jìn)行測定。激發(fā)波長：610 nm，發(fā)射波長：692 nm；激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm，使用儀器自帶濾光片；PTM電壓：600 V，掃描速度：600 nm/min。

ZnPc(Lys)5結(jié)合濃度=ZnPc(Lys)5總濃度-ZnPc(Lys)5游離濃度

實(shí)際ZnPc(Lys)5游離濃度=ZnPc(Lys)5游離濃度-空白對照組

2 結(jié)果

2.1 ZnPc(Lys)5對BSA內(nèi)源熒光的猝滅

固定BSA的濃度（2.5 μmol/L），改變ZnPc(Lys)5的濃度，在pH=7.4的Tris緩沖體系中測得不同濃度ZnPc(Lys)5時(shí)BSA的熒光光譜，結(jié)果見圖1。

2.2 ZnPc(Lys)5引起B(yǎng)SA內(nèi)源熒光的猝滅機(jī)制

熒光猝滅過程通常可分為動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅兩種。動(dòng)態(tài)猝滅是猝滅劑和熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子之間發(fā)生相互碰撞而導(dǎo)致熒光物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率下降的過程。靜態(tài)猝滅是猝滅劑和熒光物質(zhì)分子在基態(tài)時(shí)生成不發(fā)熒光或弱熒光的配合物，從而導(dǎo)致熒光物質(zhì)熒光強(qiáng)度減小。其中動(dòng)態(tài)猝滅遵循SternVolmer方程［2］：

F0/F=1+Ksv［ZnPc(Lys)5］=1+Kqτ0［ZnPc(Lys)5］（1-1）

式（1-1）中，F(xiàn)0 為未加入ZnPc(Lys)5時(shí)熒光分子BSA的熒光強(qiáng)度，F(xiàn) 為加入ZnPc(Lys)5后BSA的熒光強(qiáng)度，［ZnPc(Lys)5］ 為ZnPc(Lys)5游離濃度，Kq為雙分子猝滅過程的速率常數(shù)，τ0為無ZnPc(Lys)5存在下熒光分子的平均壽命，生物大分子的熒光壽命τ0約為108s，Ksv為SternVolmer猝滅常數(shù)，通過F0 /F對 ［ZnPc(Lys)5］作圖，可由回歸方程的斜率求出Ksv。

按1.2.1項(xiàng)方法測定不同溫度（298，303，308，313，318 K）下ZnPc(Lys)5對BSA作用后BSA熒光強(qiáng)度強(qiáng)度，其SternVolmer曲線結(jié)果見圖2。由圖2可知，ZnPc(Lys)5在4～50 μmol/L濃度范圍中F0/F與 ［ZnPc(Lys)5］之間存在線性關(guān)系。通過式（1-1）計(jì)算得猝滅常數(shù)結(jié)果見表1。為了進(jìn)一步確證上述結(jié)果，本文還觀察了猝滅劑ZnPc(Lys)5的紫外可見光譜的變化情況，結(jié)果見圖3。表1 不同溫度下（298，303，308，313，318 K）熒光猝滅法計(jì)算的ZnPc(Lys)5與BSA相互作用結(jié)合參數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（略），Tab 1 The binding parameters and sites for the interaction of ZnPc(Lys)5 and BSA by the fluorescence quenching method at five temperatures（298， 303， 308， 313， 318 K）（略）。

2.3 ZnPc(Lys)5與BSA結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的計(jì)算

對于靜態(tài)猝滅，假設(shè)生物大分子有n個(gè)相互獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn)，并且位點(diǎn)之間不存在相互作用［3］，則：

n(ZnPc(Lys)5+BSA（ZnPc(Lys)5）nBSA(1-2)

(ZnPc(Lys)5)nBSA為生成的配合物，則其結(jié)合常數(shù)Ks為：

Ks=［(ZnPc(Lys)5)nBSA］+［ZnPc(Lys)5)］n［BSA］(1-3)

［BSA］為體系中BSA游離濃度，設(shè)［BSAt］為BSA的總濃度則［BSAt］＝［(ZnPc(Lys)5)nBSA］+［BSA］代入式（13）可得

Ks=(［BSAt］-［BSA］)/［ZnPc(Lys)5)］n［BSA］(1-4)

在一定的波長范圍內(nèi)，若體系的熒光僅由BSA所產(chǎn)生，即猝滅劑和配合物不發(fā)熒光，則有

F0/F=［BSAt］/［BSA］(1-5)

式中，F(xiàn)0和F分別表示未加入ZnPc(Lys)5和加入ZnPc(Lys)5后BSA的熒光強(qiáng)度。將式（1-5）代入（1-4）經(jīng)變化后得：

lg(F0-F)/F=lgK1+nlg［ZnPc(Lys)5］(1-6)

當(dāng)ZnPc(Lys)5總濃度大大于BSA濃度時(shí)，ZnPc(Lys)5總濃度可近似看作其游離濃度代入式（1-6）計(jì)算。通過lg(F0-F)/F對lg［ZnPc(Lys)5］作回歸曲線，結(jié)果見圖4，由斜率和截距求出ZnPc(Lys)5與BSA結(jié)合常數(shù)K1及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n，結(jié)果見表1。

2.4 Scatchard方程計(jì)算ZnPc(Lys)5與BSA結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

藥物與蛋白質(zhì)分子間的相互作用采用位點(diǎn)結(jié)合模型解釋，即

r=nK1［ZnPc(Lys)5］/(1+K2ZnPc(Lys)5］)（1-7）

式（1-7）中，［ZnPc(Lys)5為溶液中ZnPc(Lys)5的游離濃度，r為平均每摩爾BSA分子結(jié)合ZnPc(Lys)5的物質(zhì)量，K2為結(jié)合常數(shù)，n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，即一個(gè)BSA分子能結(jié)合的ZnPc(Lys)5數(shù)目。

式（1-7）可變換成著名的Scatchard方程：

r［ZnPc(Lys)5］=nK2-rK2（1-8）

按“1.2.2”項(xiàng)方法計(jì)算ZnPc(Lys)5結(jié)合濃度和游離濃度，根據(jù)方程（1-8）通過r/［ZnPc(Lys)5］對r作線性回歸，求得結(jié)合常數(shù)K2為1.557 × 105 L/mol，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)位為1.07（r= 0.9963）。

3 討論

ZnPc(Lys)5［4］（圖5）是通過β單取代羧基酞菁鋅（βZnPc）［5］與水溶性聚賴氨酸多肽連接得到的一種新型兩親性酞菁鋅。側(cè)鏈上聚賴氨酸富含陽離子，對具有比正常細(xì)胞表面更多負(fù)電荷的腫瘤細(xì)胞表面具有選擇性吸附和電中和作用［6］，增加酞菁在腫瘤組織的富集，降低活性光敏劑在正常組織的富集，從而提高靶向性。因此，ZnPc(Lys)5有望成為一種理想的抗癌光敏劑，進(jìn)行ZnPc(Lys)5與白蛋白相互作用研究具有重要意義。

由于血清白蛋白中存在色氨酸和酪氨酸，使其具有內(nèi)源熒光。以280 nm為激發(fā)波長時(shí)，主要激發(fā)白蛋白中色氨酸和酪氨酸殘基的熒光，本文選擇激發(fā)波長為290 nm， BSA發(fā)射的內(nèi)源性熒光則來源于色氨酸。由圖1可見，ZnPc(Lys)5對BSA內(nèi)源熒光產(chǎn)生強(qiáng)烈猝滅作用，當(dāng)濃度達(dá)50 μmol/L時(shí)，BSA熒光強(qiáng)度僅約為未加入ZnPc(Lys)5時(shí)BSA熒光強(qiáng)度的35%，但最大發(fā)射波長沒有明顯位移。表明ZnPc(Lys)5使得BSA中色氨酸殘基的熒光量子產(chǎn)率大幅下降，但對色氨酸所處的內(nèi)環(huán)境極性沒有明顯影響。

目前認(rèn)為動(dòng)態(tài)與靜態(tài)猝滅可以依據(jù)猝滅常數(shù)隨溫度的變化來區(qū)別。對于動(dòng)態(tài)猝滅，溫度升高，將增加有效碰撞的粒子數(shù)目，加劇電子的轉(zhuǎn)移，使熒光物質(zhì)的猝滅常數(shù)隨著溫度的升高而增大；若是靜態(tài)猝滅，溫度升高將降低復(fù)合物的穩(wěn)定性，使結(jié)合常數(shù)減小。此外，還可以通過觀察熒光分子的吸收光譜的變化情況來區(qū)別二者。動(dòng)態(tài)猝滅主要影響熒光分子的激發(fā)態(tài)，一般不改變熒光分子的吸收光譜；而靜態(tài)猝滅是基態(tài)猝滅劑與熒光分子形成配合物的結(jié)果，通常熒光分子或猝滅劑吸收光譜會(huì)有所變化［2］。由表1可以看出，隨著溫度的升高，猝滅常數(shù)減小，表明ZnPc(Lys)5與對BSA的熒光猝滅可能主要是靜態(tài)猝滅。另外，假設(shè)ZnPc(Lys)5與BSA猝滅方式為動(dòng)態(tài)猝滅，根據(jù)式（1-1）計(jì)算得不同溫度下的猝滅速率常數(shù)Kq數(shù)量級在1012～1013 L·mol-1·s-1，這些數(shù)值都遠(yuǎn)大于生物分子的最大碰撞擴(kuò)散猝滅速率常數(shù)2.0×1010 L· mol-1·s-1［7］，也表明ZnPc(Lys)5對BSA的熒光猝滅可能是靜態(tài)猝滅。為進(jìn)一步區(qū)分兩種猝滅機(jī)制，圖3的ZnPc(Lys)5的紫外可見光譜的變化情況在沒有BSA存在下ZnPc(Lys)5在633 nm有聚集態(tài)的吸收峰，幾乎沒有673 nm的單體吸收峰［8］。在體系中逐漸加入BSA 后，峰形發(fā)生變化，在673 nm出現(xiàn)單體的吸收峰并伴隨著BSA濃度的增大而增強(qiáng)，在633 nm的聚集態(tài)特征吸收峰卻隨著BSA濃度的增大反而減弱，表明ZnPc(Lys)5與BSA之間存在相互作用形成基態(tài)配合物［9］，從而導(dǎo)致ZnPc(Lys)5解聚，進(jìn)一步驗(yàn)證了ZnPc(Lys)5引起B(yǎng)SA的熒光猝滅的機(jī)制主要是靜態(tài)猝滅，而不是動(dòng)態(tài)猝滅。

從測定BSA熒光強(qiáng)度角度，當(dāng)ZnPc(Lys)5與BSA以形成基態(tài)配合物方式相互作用時(shí)，可以通過雙導(dǎo)數(shù)方法計(jì)算二者結(jié)合常數(shù)。由圖4看出，每一溫度下雙導(dǎo)數(shù)圖同樣都得到線性關(guān)系良好的回歸曲線（R>0.99）。由表1看出，通過雙導(dǎo)數(shù)和SternVolmer兩種方程得到的結(jié)合常數(shù)比較接近，均在同一數(shù)量級，各溫度平均結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n為1.1，表明ZnPc(Lys)5與BSA有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。從測定ZnPc(Lys)5熒光強(qiáng)度角度，采用Scatchard方程計(jì)算的298 K下ZnPc(Lys)5與BSA相互作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)與同溫度下雙導(dǎo)數(shù)和SternVolmer兩種方程得到的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)基本一致。采用Scatchard方程計(jì)算結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)需要測定藥物的游離濃度，由于藥物的游離濃度通常較難測定，所以國內(nèi)文獻(xiàn)大多采用雙導(dǎo)數(shù)和SternVolmer兩種方程計(jì)算結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。國外文獻(xiàn)中有采用Scatchard方程計(jì)算結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的報(bào)道，但文中對于藥物游離濃度的測定方法沒有明確指出，丹麥學(xué)者van de Weert最近專門發(fā)文指出這個(gè)缺陷［10］。本文明確闡述了測定BSA中ZnPc(Lys)5游離濃度的方法。

到底ZnPc(Lys)5作用在BSA的哪一位點(diǎn)上，可以通過建立分子模型來預(yù)測，進(jìn)一步用競爭絡(luò)合法確認(rèn)［3］。

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篇3

目的 研究葉酸偶聯(lián)牛血清白蛋白的合成工藝，制備包裹砒霜的白蛋白納米粒并檢驗(yàn)其對靶細(xì)胞的殺傷作用。方法葉酸在縮合劑的作用下與牛血清白蛋白偶聯(lián)，通過正交設(shè)計(jì)選擇最佳配方；用去溶劑法制備包裹砒霜的納米粒，并觀察其對靶細(xì)胞特異性殺傷作用。結(jié)果采用最佳條件合成的葉酸偶聯(lián)牛血清白蛋白的偶聯(lián)率為30.31 μg/mg，納米粒的砒霜包封率為10.3%，對靶細(xì)胞殺傷率為97%，對非靶細(xì)胞的殺傷力僅為23%。結(jié)論 包裹有砒霜的葉酸偶聯(lián)牛血清白蛋白納米粒（簡稱F-BSANP）對靶細(xì)胞有特異性殺傷作用。

【關(guān)鍵詞】 砒霜；納米粒；葉酸；牛血清白蛋白

Abstract：ObjectiveTo study the synthetic procedure of folate-conjugated bovine serum albumin (F-BSA) and preparation of albumin nanoparticles entrapping arsenic trioxide，and to examine the peculiar toxicity of nanoparticles on targeting cells.MethodsFolic acid was conjugated to bovine serum albumin via condensing agent，we studied the best synthetic formula of F-BSA by the orthogonal test design．The nanoparticles were prepared by desolvation method，and the peculiar toxicity of F-BSANP on A549 was studied．ResultsThe average conjugating rate of folate in F-BSA made in the best formula was 30.31μg/mg．The entrapping rate of arsenic trioxide was 8.34%．We examined the peculiar toxicity of F-BSANP on targeting cells and control group cells，respectively，and the death rate of targeting cells was 97 percent ，whereas that of control group was only 23 percent．ConclusionF-BSANP is peculiar to their targeting-cells．

Key words：Arsenic trioxide； Nanoparticles； Folate； Bovine serum albumin

腫瘤是嚴(yán)重危害人類生命和健康的常見病和多發(fā)病，是導(dǎo)致殘疾和早死的主要疾病之一。目前，臨床使用的抗腫瘤化療藥物均有較大的毒副作用，有些嚴(yán)重的毒副反應(yīng)是限制藥物劑量或使用的直接原因。研究發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤細(xì)胞(如卵巢癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等)膜表面上的葉酸受體活性和數(shù)量顯著高于一般正常細(xì)胞，這為葉酸受體介導(dǎo)藥物靶向于腫瘤細(xì)胞的研究奠定了基礎(chǔ)［1］ 。

中藥砒霜（三氧化二砷）是中藥中的傳統(tǒng)毒藥，近年來有關(guān)其抗腫瘤作用，尤其是在我國率先開展的三氧化二砷治療急性早幼粒細(xì)胞性白血病(APL)的研究引起了人們的廣泛興趣；研究已發(fā)現(xiàn)砒霜能顯著抑制人肺癌的細(xì)胞生長并誘導(dǎo)其凋亡［2］ 。但是，在治療過程中的嚴(yán)重毒副作用是影響其抗癌療效的主要原因。

本實(shí)驗(yàn)以傳統(tǒng)中藥砒霜為治療藥物，將其包裹在用葉酸偶聯(lián)白蛋白制成的納米粒中，并進(jìn)行其對靶細(xì)胞殺傷作用的研究。為以后制備其它抗癌藥靶向制劑作鋪墊。

1 材料

人肺癌細(xì)胞株A549（購于武漢大學(xué)生命科學(xué)院中國典型培養(yǎng)物保藏中心）；人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；分離自正常人骨髓血（骨髓血樣由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院一附院血液科提供）；牛血清白蛋白（上海新量化工試劑有限公司）；葉酸（上海新量化工試劑有限公司）；1-乙基-3-（3-二甲氨丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（簡稱EDC·HCl）（上海三杰生物技術(shù)有限公司）；Sephadex G-25 （Pharmacia）；三氧化二砷（購自上?；瘜W(xué)試劑采購供應(yīng)站，CP）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；RPMI 1640 培養(yǎng)基（Gibco）；胰蛋白酶 1∶250（Amresco）。

2 方法和結(jié)果

2.1 葉酸偶聯(lián)白蛋白的合成

2.1.1 葉酸偶聯(lián)白蛋白的合成與分離

將葉酸溶于pH7.4的磷酸緩沖液(PBS)中，加入EDC·HCl后攪拌活化5 min，再加入50 mg/ml牛血清白蛋白的PBS溶液，攪拌下反應(yīng)數(shù)小時(shí)即得［3］。將反應(yīng)液過Sephadex G-25柱，收集前段淡黃色有乳光部分［4］。

2.1.2 因素和水平的確定

經(jīng)過查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料和大量的預(yù)實(shí)驗(yàn)最終確定葉酸用量、EDC·HCl與葉酸摩爾比、反應(yīng)時(shí)間3因素各取3水平優(yōu)化工藝。見表1。表1 因素水平（略）

2.1.3 評價(jià)指標(biāo)的選取與測定

葉酸與牛血清白蛋白偶聯(lián)越多，納米粒對腫瘤的靶向性就越高。因此選擇葉酸與牛血清白蛋白偶聯(lián)率作為評價(jià)指標(biāo)。

偶聯(lián)率的測定，將葉酸偶聯(lián)白蛋白溶于pH7.4的PBS中，用2.5%的胰蛋白酶消化2 h后離心取上清液于358 nm處測紫外吸收。標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，計(jì)算偶聯(lián)率。

偶聯(lián)率=被偶聯(lián)的葉酸量/μg被偶聯(lián)的牛血清白蛋白量/mg

2.1.4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按正交設(shè)計(jì)表L9(34)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算偶聯(lián)率（見表2），方差分析結(jié)果見表3。表2 正交設(shè)計(jì)（略）表3 方差分析表（略）

X1，X2和X3分別是各因素水平1、水平2、水平3偶聯(lián)率之和；X是各因素內(nèi)部水平1、水平2、水平3偶聯(lián)率之和的最大差距

由表3～4可見，在考察的3個(gè)因素中， EDC/folate影響最大(P0.05)，葉酸偶聯(lián)白蛋白合成工藝最佳水平組合為A3B3C1，以該工藝制備的葉酸偶聯(lián)白蛋白的葉酸偶聯(lián)率為30.31μg/mg。

2.2 納米粒的制備

2.2.1 砷標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

按新銀鹽法［5］測定并計(jì)算砷標(biāo)準(zhǔn)曲線，C=9.106A+0.908 3，r=0.993 9，RSD為2.41%。在1～6μg濃度范圍內(nèi)，線性良好。

2.2.2 載藥納米粒的制備［6］

As2O3溶于牛血清白蛋白溶液中，調(diào)節(jié)pH值微堿性，室溫下緩緩加入無水乙醇，攪拌30 min后再緩緩加入戊二醛溶液［7］ ，固化12 h即得。制得包封率為10.3%的納米粒。

2.2.3 包封率的測定

取載藥納米粒用pH7.4的PBS分散，加入2.5%的胰蛋白酶消化2 h，離心后取上清液新銀鹽法測定其吸光度A值，計(jì)算出砷含量。

包封率（%）=納米粒中所包裹的As2O3量投入As2O3的量×100%

2.2.3 空白回收率和加樣回收率的測定

經(jīng)測定，空白回收率為100.8%，加樣回收率為97.9%。

2.2.4 納米粒的形態(tài)觀察和粒徑

納米粒分散于蒸餾水中，用HITACHI H-600透射電子顯微鏡觀察粒子形態(tài)，并拍攝照片。納米粒形態(tài)圓整，分布均勻，粒徑大約200 nm左右。見圖1～2。

2.3 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)［8］

將A549細(xì)胞培養(yǎng)于10%小牛血清的1640培養(yǎng)基中。設(shè)立空白對照組（加生理鹽水）、載藥葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒3個(gè)劑量組（10，1，0.1 μg/ml）、阻斷組(載藥1 μg/ml的葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒+葉酸)、載藥白蛋白納米粒(BSANP)組（1μg/ml）、砒霜組（1μg/ml）。培養(yǎng)24 h后，MTT法測定各孔及本底A490，計(jì)算細(xì)胞抑制率。

取正常人骨髓血3 ml，培養(yǎng)數(shù)天后分離貼壁細(xì)胞即得人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞［9］。同法操作計(jì)算細(xì)胞抑制率。結(jié)果見表4。表4 靶細(xì)胞與非靶細(xì)胞的抑制率(略)

用t檢驗(yàn)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果顯示包裹砒霜的F-BSANP對靶細(xì)胞的抑制作用較非靶細(xì)胞明顯；較BSANP組，葉酸阻斷組與砒霜組也顯示出非常高的抑制作用，差異具有顯著性。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中選擇人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為對照用的非靶細(xì)胞，主要是因?yàn)槿斯撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞具有很強(qiáng)的增殖分化能力，與腫瘤細(xì)胞有相似之處。

包裹有砒霜的F-BSANP組對靶細(xì)胞的殺傷作用較非靶細(xì)胞、BSANP組和砒霜組明顯，證明F-BSANP對靶細(xì)胞具有特異性殺傷作用；而包裹有砒霜的F-BSANP組對靶細(xì)胞的殺傷作用較葉酸阻斷組明顯也從側(cè)面證明納米粒的靶向性是通過葉酸介導(dǎo)入細(xì)胞而發(fā)揮作用；葉酸阻斷組和BSANP組也存在顯著差異，這可能是因?yàn)槿~酸和葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒與葉酸受體是競爭性結(jié)合，在這個(gè)過程中也有部分葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒與葉酸受體結(jié)合而把藥物介導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。

本實(shí)驗(yàn)中，在溫和的條件下成功合成葉酸偶聯(lián)牛血清白蛋白；在保證生理活性的前提下制備的偶聯(lián)物可以做為靶向制劑的一種高分子材料，對傳統(tǒng)中藥砒霜進(jìn)行包裹制成的納米粒具有明顯的主動(dòng)靶向性，并且安全性高；在體內(nèi)的過程及體內(nèi)的藥效有待于進(jìn)一步的研究。另外，以葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒做為載體將市場上的抗腫瘤藥物進(jìn)行二次開發(fā)，應(yīng)用前景廣闊。

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［4］張良珂，侯世祥，毛聲俊，等．葉酸偶聯(lián)自蛋白納米粒腫瘤細(xì)胞靶向性研究［J］.四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2004，35(2)：165.

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［6］Mao SJ，Hou SX， Zhang LK， et al. Preparation of bovine serum albumin nanoparticles surface-modified with glycyrrhizin ［J］.Acta Pharm Sin，2003，38(10)：787.

篇4

【關(guān)鍵詞】綜合實(shí)驗(yàn)；中空纖維膜；聚偏氟乙烯

在環(huán)境與化工相關(guān)學(xué)科中開展綜合實(shí)驗(yàn)是目前化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革的一個(gè)重要趨勢。通過綜合實(shí)驗(yàn)的開展，不僅可以培養(yǎng)學(xué)生發(fā)現(xiàn)問題、分析問題、解決問題的能力，而且還能培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新能力。我校在中空纖維膜的研究方面已有三十多年的歷史，在全市乃至全國都有重要的影響力，其所屬環(huán)境科學(xué)與工程是天津市重點(diǎn)學(xué)科，簽于此我院于2012年在環(huán)境工程、應(yīng)用化學(xué)和化學(xué)工程與工藝三個(gè)本科專業(yè)中開設(shè)了“膜材料與膜過程”課程，拓展了學(xué)生的知識(shí)面，取得了非常好的效果。為了鞏固課堂教學(xué)成果，強(qiáng)化學(xué)生對膜技術(shù)的認(rèn)識(shí)，特開設(shè)了“中空纖維膜的制備及性能研究”綜合實(shí)驗(yàn)。本文以此綜合實(shí)驗(yàn)為例，以應(yīng)用實(shí)踐型人才培養(yǎng)模式為目標(biāo)，設(shè)計(jì)新的綜合實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，培養(yǎng)學(xué)生應(yīng)用膜技術(shù)解決環(huán)境、化工領(lǐng)域中相關(guān)問題的能力，為今后從事相關(guān)領(lǐng)域的工作奠定了基礎(chǔ)。

1. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c原理

1.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

通過紡絲液的制備、脫泡、中空纖維的成型、后處理以及性能檢測等一系列實(shí)驗(yàn)過程，使學(xué)生充分了解相轉(zhuǎn)化法制備中空纖維膜的工藝過程，掌握制備中空纖維膜的基本原理及實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)，熟練實(shí)驗(yàn)室用中空纖維膜組件的制作方法以及水通量的測試方法。

該實(shí)驗(yàn)涉及材料學(xué)、化工分離、機(jī)械工程、環(huán)境工程等多個(gè)學(xué)科，重點(diǎn)掌握中空纖維膜制備過程中相平衡、相分離、相轉(zhuǎn)化引發(fā)膜孔形成的過程，最終可完成對學(xué)生綜合化學(xué)實(shí)踐應(yīng)用技能的訓(xùn)練和培養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)原理

中空纖維膜的制備方法有：濕法、干-濕法、熔融法和熱致相法。本綜合實(shí)驗(yàn)采用干-濕法，過程如下：首先將過濾后的由聚合物、溶劑和致孔劑組成的鑄膜液用計(jì)量泵從釜中料液抽出，從環(huán)行噴絲頭（常用噴絲頭的斷面結(jié)構(gòu)如圖1所示）的縫隙中擠出，同時(shí)將芯液注入噴絲頭插入管中，經(jīng)過一段空氣浴后，鑄膜液浸入凝固浴中發(fā)生雙擴(kuò)散：鑄膜液中的溶劑向凝固浴擴(kuò)散以及凝固浴中的凝固劑（非溶劑）向鑄膜液中的細(xì)流擴(kuò)散。膜的內(nèi)側(cè)和外側(cè)同時(shí)發(fā)生凝膠化過程，首先形成皮層，隨著雙擴(kuò)散的進(jìn)一步進(jìn)行，鑄膜液內(nèi)部的組成不斷變化，當(dāng)達(dá)到臨界濃度時(shí)，膜完全固化從凝固浴中沉析出來，將膜中溶劑和成孔劑萃取出，最終得到中空纖維膜。

圖1 噴絲頭斷面結(jié)構(gòu)示意圖

（a）插入管式；（b）插入柱式；（c）異形噴絲板

2. 化學(xué)試劑與儀器

試劑：聚偏氟乙烯（PVDF）；聚乙二醇（相對分子質(zhì)量400和6000）；N-甲基吡咯烷酮；甘油（工業(yè)級）。

儀器：中空纖維膜紡絲機(jī)一臺(tái)（包括如下附件：計(jì)量泵為1.2ml/r，噴絲頭，氮?dú)怃撈康龋⒛ね繙y試裝置、紫外-可見分光光度計(jì)、電動(dòng)攪拌器、電加熱套、三口燒瓶、玻璃棒、燒杯、量筒。

3.實(shí)驗(yàn)步驟

3.1 聚偏氟乙烯中空纖維膜的制備

將適量的聚偏氟乙烯樹脂和大分子親水性添加劑于105℃下經(jīng)過真空干燥20h，然后移入三口燒瓶，加入溶劑NMP和致孔劑PEG，在70℃下充分?jǐn)嚢?4h，隨后靜置脫泡24h。將紡絲液移入紡絲設(shè)備?？刂萍徑z罐的壓力、芯液的流量、凝固浴的溫度、空氣間隙的距離，過濾器和噴絲板的溫度、卷繞速率等參數(shù)進(jìn)行紡絲。實(shí)驗(yàn)完成后，將聚醚砜膜絲妥善保存，供后續(xù)分析和檢測。

3.2 膜組件的封裝

（1）剪取 4-5cm 的塑料管兩根，用哥倆好膠將其一端粘在紙上，兩根塑料 管的距離 10-15cm，晾干備用。

（2）取長度約 30cm 中空纖維膜 5-10 根，剪齊，在膜兩端涂覆705硅橡膠進(jìn)行封端，晾干后（約 6小時(shí)）在膜兩端套上尼龍管（4-5cm）。

（3）組件澆鑄：將膜組件專用樹脂（兩組份）在一次性紙杯中按一定比例混勻，倒入（1）中的塑料管中（充滿塑料管體積的 2/3） ，然后將（2）中的尼龍管插入到塑料管中（注意：尼龍管不能插到底，膜要插到底；在操作的過程中盡量防止氣泡的產(chǎn)生），等樹脂完全固化后（約12 小時(shí)），進(jìn)行修整（撥去塑料管，將膜長出尼龍管的部分割去），得到實(shí)驗(yàn)室用簡易的膜組件，并檢驗(yàn)?zāi)そM件是否漏。

3.3 水通量的測試

圖2中空纖維膜測試裝置

將PVDF中空纖維膜組件按照圖2所示進(jìn)行連接，進(jìn)口壓力恒定為 0.10MPa，經(jīng)過膜分離，用量筒接取滲透液，記錄一定時(shí)間內(nèi)滲透過膜的水量，多余的水則回流到水槽中。測試三次，取其平均值，計(jì)算得到水通量。

3.4 截留率的測試

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：牛血清白蛋白在105℃下真空干燥至恒重。精確稱取牛血清白蛋白1.000g溶于1000mL容量瓶中，分別吸取牛血清白蛋白溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于10mL容量瓶中加蒸餾水稀釋至刻度，配制成溶度為20、40、60、80、100mg/L的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：蛋白質(zhì)對280nm的紫外線有最大吸收，蛋白質(zhì)溶液280nm吸收值與其溶度成正比。將牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液于波長280nm下，用1cm比色皿，在紫外分光光度計(jì)上測定光密度，蒸餾水為空白。以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，光密度為縱坐標(biāo)作圖，制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

牛血清白蛋白截留率的測定：將分子量為67000道爾頓的BSA用蒸餾水配置成1000mg/L的溶液，將待測PVDF中空纖維膜樣品在0.1MPa下預(yù)壓30min后，過濾1000mg/L的牛血清白蛋白溶液，然后用UV-2450型紫外分光光度計(jì)在280nm處測定透過液和原液的光密度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的濃度，按如下公式計(jì)算截留率Ru：

其中：Ru-截留率；c1-原液中的BSA濃度（mg/L）；c2-透過液中的BSA濃度（mg/L）。

4. 實(shí)驗(yàn)的組織實(shí)施

在實(shí)驗(yàn)的過程中引入學(xué)生自主實(shí)驗(yàn)的教學(xué)方法：①將學(xué)生按學(xué)號分組；②教師在實(shí)驗(yàn)的前一周講解綜合實(shí)驗(yàn)的整體要求、實(shí)驗(yàn)達(dá)到的目標(biāo)效果以及學(xué)生需要準(zhǔn)備的工作；③各組通過查閱資料和文獻(xiàn)，參考實(shí)驗(yàn)講義，制定自己的實(shí)驗(yàn)方案；④實(shí)驗(yàn)前1～2天，教師對學(xué)生實(shí)驗(yàn)方案加以評閱，引導(dǎo)學(xué)生改進(jìn)方案，指導(dǎo)學(xué)生拿出切實(shí)可行的方案后，即可進(jìn)行實(shí)際操作；⑤鼓勵(lì)學(xué)生采用不同的實(shí)驗(yàn)方案開展實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)完成后，組織學(xué)生討論不同方案對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，并綜合不同方案的實(shí)驗(yàn)結(jié)果撰寫綜合實(shí)驗(yàn)報(bào)告；⑥評閱實(shí)驗(yàn)報(bào)告，找出學(xué)生犯錯(cuò)之處并反饋給學(xué)生。

篇5

【關(guān)鍵詞】 腦缺血

關(guān)鍵詞: 腦缺血;DNA損傷;Klenow片段

1 材料和方法

1.1 材料 雄性4mo齡左右SD大鼠36只，體質(zhì)量250～350g，本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;DNA聚合酶-I Klenow大片段、biotin-dATP，dGTP，dCTP，dTTP購自美國Gibco公司.

1.2 腦缺血模型 按文獻(xiàn)［1］方法建立前腦缺血模型.

篇6

【關(guān)鍵詞】黃精蝸牛膠囊；考馬斯亮藍(lán)法；分光光度法

蛋白質(zhì)是一切生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，是機(jī)體細(xì)胞的重要組成部分。蝸牛是陸地上最常見的軟體動(dòng)物之一，含有大量的蛋白質(zhì)，具有很高的食用和藥用價(jià)值。本公司研制的黃精蝸牛膠囊以蝸牛為主料，佐以黃精、黨參等藥材，產(chǎn)品可以調(diào)節(jié)機(jī)體代謝，增加人體免疫功能。

本文使用考馬斯亮藍(lán)法測定黃精蝸牛膠囊中蛋白質(zhì)含量，以確定產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，控制產(chǎn)品質(zhì)量。

實(shí)驗(yàn)方法：

1、儀器與試藥

1.1儀器：紫外分光光度計(jì)，島津UX-2450；

分析天平，F(xiàn)A2004，上海方瑞儀器有限公司

1.2試藥：牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，中國藥品生物制品檢定所；

考馬斯亮藍(lán)G-250，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

黃精蝸牛膠囊由上海新亞藥業(yè)邗江有限公司提供。

2、試液配制

2.1蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

將牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶于蒸餾水，配成濃度為100μg/ml的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，精密量取濃度為100μg/ml的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液10ml、20ml、30ml、40ml加蒸餾水定容于50ml容量瓶，濃度分別為20、40、60、80μg/ml。

2.2考馬斯亮藍(lán)G-250溶液的制備

精確稱取考馬斯亮藍(lán)G-250 100mg，溶于50ml90%的乙醇，加入85%（W/V）磷酸100ml，用蒸餾水定容于1000ml容量瓶，濃度為100μg/ml。

2.3供試品溶液的制備

精確稱取2g供試品，充分溶于蒸餾水，濾過，用蒸餾水沖洗濾紙，合并濾液定容于100ml容量瓶；精密吸取2ml，定容于1000ml容量瓶，配成濃度為40μg/ml的供試品溶液。

3、蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程

精密量取濃度為20、40、60、80、100μg/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5ml分別于5支10ml具塞試管，再加入2.5ml考馬斯亮藍(lán)G-250溶液，搖勻后，放置5～10min，待其充分反應(yīng)后，用紫外分光光度計(jì)于595nm處測定吸光度，對牛血清白蛋白溶液濃度和吸光度進(jìn)行線性回歸，建立回歸方程。

用紫外分光光度計(jì)，在595nm處測定不同濃度蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度。以蛋白溶液的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為：C=2.756+318.374*A，相關(guān)系數(shù)R=0.9983，表明蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液在20～100μg/ml范圍內(nèi)濃度與吸光度具有良好的正相關(guān)性。結(jié)果見表1。

4、供試品中蛋白含量的測定

精密量取供試品溶液0.5ml于10ml具塞試管，再加入2.5ml考馬斯亮藍(lán)G-250溶液，搖勻后，放置5～10min充分反應(yīng)，用紫外分光光度計(jì)于595nm處測定吸光度，代入回歸方程計(jì)算濃度。結(jié)果如表2所示。

5、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取供試品溶液，按實(shí)驗(yàn)方法4中的方法，在60min內(nèi)的，每隔10min測定一次供試品的吸光度值，觀測其穩(wěn)定性，在20min內(nèi)，RSD=2.44%，在60min內(nèi)，RSD=4.83%，皆

6、加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

精密量取濃度為40μg/ml的供試品溶液0.25ml加入10ml具塞試管，分為三組，每組6個(gè)重復(fù)，再加入與供試品溶液相同體積的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別濃度為16μg/ml、20μg/ml、24μg/ml。按實(shí)驗(yàn)方法4中方法，測定吸光度，代入回歸方程，計(jì)算加樣回收率。三組不同濃度的供試品加樣回收率在100%～110%之間，平均值為106.57%，RSD=3.26%，表明用考馬斯亮藍(lán)法測定黃精蝸牛膠囊的蛋白含量結(jié)果較準(zhǔn)確，方法可行，結(jié)果見表4。

7、討論

考馬斯亮藍(lán)G-250（Coomassie G-250）是一種甲基取代的三苯基甲烷，能與蛋白質(zhì)通過范德華力相互作用形成蛋白質(zhì)―考馬斯亮藍(lán)復(fù)合物藍(lán)色溶液，在595nm處有最大吸收，可大大地提高蛋白質(zhì)的測定靈敏度。蛋白質(zhì)―考馬斯亮藍(lán)復(fù)合物溶液顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比。用此法測定蛋白質(zhì)含量靈敏度高，測定快速、簡便，干擾物質(zhì)少。

本實(shí)驗(yàn)顯示在加考馬斯亮藍(lán)溶液后10min～20min內(nèi)完成測定樣品的吸光度，數(shù)據(jù)穩(wěn)定；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明用考馬斯亮藍(lán)法測定黃精蝸牛膠囊的蛋白質(zhì)含量結(jié)果較準(zhǔn)確，方法可行，可以有效控制產(chǎn)品質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)

[1]孫士清.考馬斯亮藍(lán)法快速測定乳品中蛋白質(zhì)含量[J].山東科學(xué)，2011，24，[6]：53―55

[2]王孝平.考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白含量的研究[J].天津化工，2009，23，[3]：40―41

篇7

【關(guān)鍵詞】 IgA腎病;模型;血尿;免疫熒光;小鼠

Abstract: Objective To establish mouse model of IgA nephropathy in order to provide experiment basis for the clinical research of IgA nephropathy. Methods 30 Kunming mice were randomly assigned into the control group (n=10) and the model group (n=20). Mouse model of IgA nephropathy was established by the method of oral intake of bovine serum albumin (BSA) together with injection of staphylococcus enterotoxin B (SEB) via the caudal vein. At the end of the 12 weeks， fresh urine was gathered for the quantitative test of hematuria; blood was taken through orbital sinus after eyeball extirpation to determine the serum creatinine (Scr) and blood urea nitrogen (BUN); the changes of mesangial cells and matrix in the kidneys were observed by light microscopy; electron microscopy was employed to detect electron-dense deposits in the mesangial area; the expression of IgA deposition was measured by immunofluorescence staining in the mesangial area. Results By the end of 12 weeks， there were different degrees of hematuria in model group mice. BUN and Scr levels in model group were significantly higher than in the normal control group (P

Key words: IgA nephropathy; model; hematuria; immunofluoresence staining; mice

IgA腎病世界范圍內(nèi)廣發(fā)的一種系膜增生型腎小球腎炎，占原發(fā)性腎小球疾病的10%～20%，中國、日本、新加坡等發(fā)病率較高，其中有20%～30%的患者進(jìn)展到腎衰[1]。建立與人類臨床病理生理相似的IgA腎病動(dòng)物模型，對研究IgA腎病的發(fā)病機(jī)理、臨床治療等具有重要的作用。本實(shí)驗(yàn)采用口服牛血清白蛋白聯(lián)合尾靜脈注射葡萄球菌腸毒素的方法制作IgA腎病小鼠模型，為進(jìn)一步探索IgA腎病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小鼠30只，鼠齡(10-12)周，體重20～26 g，雄性，動(dòng)物編號SCXK(蘇)2005-0005，由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑和設(shè)備 牛血清白蛋白(BSA，上海明睿生物有限公司，產(chǎn)品批號RF101-010);葡萄球菌腸毒素B(SEB，北京博邁世紀(jì)生物技術(shù)有限公司);兔抗小鼠IgA抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，抗體貨號bs-0774R); 異硫氰酸熒光素(FITC)-標(biāo)記的羊抗兔IgG(Millipore corporation); MicromHM340石蠟切片機(jī);光學(xué)顯微鏡(日本Carton);日本Sysmex CA-1500自動(dòng)生化分析儀;電鏡(H-600)，切片機(jī)(LKBV型)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酸化水的制備 新鮮的雙蒸水中加入鹽酸，濃度為8.5 mmol/L。即1 000 ml雙蒸水中加入10%鹽酸3.2 ml。1%BSA酸化水的制備，1 g BSA加入100 ml酸化水。

1.2.2 造模方法 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，取新鮮尿液進(jìn)行顯微鏡下尿紅細(xì)胞檢測，均為陰性，將30只小鼠隨機(jī)分為正常對照組(10只)、模型組(20只)。正常對照組小鼠自由飲水與飲食;模型組小鼠除自由飲水和飲食外，前5周隔日予BSA(200 mg/kg)灌胃;第6周起予BSA(20 mg/kg，500 mg BSA溶于500 ml無菌生理鹽水中)尾靜脈注射，每天1次，連續(xù)3天;第8周起予SEB(0.5 mg/kg， 1 mg SEB溶于25 ml無菌生理鹽水中)尾靜脈注射，每周1次，連續(xù)3周，觀察至第12周末。

1.2.3 IgA腎病小鼠模型的鑒定

1.2.3.1 血、尿液檢測 第12周末留取小鼠新鮮尿液，行尿紅細(xì)胞定性檢測;經(jīng)摘眼球取血(待測Scr，BUN)后，處死小鼠，留取右側(cè)腎臟分別固定于10%甲醛及戊二醛中，行病理(光鏡和電鏡)及免疫熒光檢查。

1.2.3.2 光鏡檢查 小鼠腎組織經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，5 μm切片，蘇木精-伊紅染色(H-E)，光鏡下觀察系膜區(qū)系膜細(xì)胞及基質(zhì)有無增生。

1.2.3.3 電鏡檢查 取材，前固定，漂洗，后固定，漂洗，脫水，置換及浸透，包埋及聚合，修塊及切片，染色，電鏡觀察。

1.2.3.4 免疫熒光 小鼠腎組織經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，5 μm切片依次經(jīng)二甲苯Ⅰ 20 min，二甲苯Ⅱ 20 min，95%乙醇5 min，95%乙醇Ⅱ 5 min，雙蒸水5 min×3次，3%H2O2 10 min，PBS 5 min×3次，抗原修復(fù)(微波爐中高火5 min，低火15 min)，自然冷卻，PBS 5 min×3次，5%羊血清1 h，兔抗小鼠IgA(1∶100)，4℃過夜，PBS 5 min×3，F(xiàn)ITC標(biāo)記羊抗兔IgG(1∶100) 4℃過夜，PBS 5 min×3，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察攝像。

免疫熒光半定量標(biāo)準(zhǔn):

半定量標(biāo)準(zhǔn)參照目前國內(nèi)通用的5級法(±～++++)分級:±：低倍鏡下不能顯示;+：低倍鏡下似乎可見，高倍鏡下可見;++:低倍鏡下可見，高倍鏡下清晰可見;+++：低倍鏡下清晰可見，高倍鏡下耀眼;++++: 高倍鏡下刺眼。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 全部數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料用±s差表示，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);等級資料用兩獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)。P

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 造模過程中，正常對照組小鼠無死亡，模型組小鼠先后死亡3只，分析原因可能是灌胃器誤插入氣管，或插入過深導(dǎo)致小鼠食管及胃黏膜損傷。尾靜脈注射SEB后，小鼠出現(xiàn)倦怠、少吃﹑少動(dòng)等現(xiàn)象，2 h后恢復(fù)正常。

2.2 血、尿指標(biāo)檢測 12周末，采集新鮮尿液光鏡下尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示模型組小鼠明顯高于正常對照組(P

2.3 鏡下結(jié)構(gòu)改變

2.3.1 光鏡 模型組小鼠腎組織主要表現(xiàn)為腎小球毛細(xì)血管襻擴(kuò)張，系膜細(xì)胞及基質(zhì)明顯增生，毛細(xì)血管腔部分閉鎖，部分小管擴(kuò)張;光鏡下正常對照組小鼠腎小球，腎小管，及間質(zhì)組織形態(tài)結(jié)構(gòu)未見異常，系膜細(xì)胞及細(xì)胞基質(zhì)未見增多(圖1)。圖1 12周末，各組小鼠光鏡下腎組織病理變化的比較(H-E染色，×400)

A.模型組，腎小球系膜細(xì)胞及基質(zhì)增生，毛細(xì)血管腔部分閉鎖，部分小管擴(kuò)張;B.正常對照組，腎小球系膜細(xì)胞及基質(zhì)未見增生，毛細(xì)血管開放良好

2.3.2 電鏡 模型組小鼠腎小球系膜區(qū)有大量電子致密物沉積，而正常組小鼠腎小球系膜區(qū)無或有少量的電子致密物沉積(圖2)。圖2 12周末，各組小鼠電鏡下腎組織病理變化的比較(×10 000)

A.模型組，系膜區(qū)大量的電子致密物沉積;B.正常對照組，系膜區(qū)無電子致密物沉積

2.4 免疫熒光檢測 12周末，免疫熒光可以看到，系膜區(qū)IgA熒光強(qiáng)度大多為+++～++++，而正常組系膜區(qū)IgA熒光強(qiáng)度為±～+，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3、圖3)。表3 2組小鼠腎臟系膜區(qū)IgA熒光半定量比較

3 討 論

自Rifai等于1979年首次用BALB/c小鼠成功制作IgA腎病模型以來，許多學(xué)者基于IgA腎病已知的發(fā)病機(jī)制成功復(fù)制了許多IgA腎病模型[2-6]。主要包括:免疫誘導(dǎo)型、繼發(fā)病變型、自發(fā)病變型。但由于存在種種問題，與人的IgA腎病病理變化差距很大，模型建立的滯后導(dǎo)致對IgA腎病的研究較少，對IgA腎病的治療未獲得新的手段。

國內(nèi)常用的IgA腎病為異種蛋白所誘導(dǎo)的免疫誘導(dǎo)型，即口服牛血清白蛋白(BSA)聯(lián)合尾靜脈注射葡萄球菌腸毒素(SEB)。由于部分患者對某些上呼吸道病原體、腸道菌群、食物抗原有較高的血清抗體滴度， 認(rèn)為黏膜免疫在發(fā)病中起到一定作用[7]。故口服免疫原如BSA及靜脈注射葡萄球菌、大腸桿菌、呼吸道病毒等病原微生物成分或免疫復(fù)合物常用于誘導(dǎo)主動(dòng)性IgA 腎病模型。BSA口服免疫可使機(jī)體IgA抗體的產(chǎn)生，SEB的具體機(jī)制目前還不十分明確，大多數(shù)認(rèn)為SEB還可破環(huán)肝臟網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，引起IgA清除不完全，進(jìn)而引起免疫復(fù)合物在系膜區(qū)的沉積。17只模型小鼠熒光證實(shí)全部有IgA沉積;光鏡下腎小球系膜細(xì)胞和系膜基質(zhì)增生;電鏡下腎小球系膜區(qū)可見大量的高電子密度的致密物沉積;臨床的尿、血檢測隨著腎臟病理變化的加重而逐漸加重，且與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明造模成功。此方法操作簡單，重復(fù)性好，成功率高，應(yīng)該是目前理想的、有研究價(jià)值的動(dòng)物模型，能為進(jìn)一步研究IgA腎病的發(fā)病機(jī)制及治療提供基礎(chǔ)平臺(tái)。

參考文獻(xiàn)

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篇8

關(guān)鍵詞：紫蘇（Perilla frutescens）；堿溶酸沉法；蛋白質(zhì)提取工藝

中圖分類號：TQ936.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號：0439-8114（2013）16-3951-03

紫蘇（Perilla frutescens）是一種獨(dú)特的油料保健作物，含油率一般為30%～51%，粗蛋白含量約為20%～23%，主要用于榨取紫蘇油[1]。隨著紫蘇的大面積種植和紫蘇產(chǎn)品的開發(fā)利用，人們對紫蘇的研究范圍越來越廣泛。目前對紫蘇成分的研究主要集中在紫蘇氨基酸組成、藥理作用、產(chǎn)品的開發(fā)利用等方面，而對于紫蘇蛋白質(zhì)分離提取的研究卻少有報(bào)道，紫蘇中含有大量的蛋白質(zhì)卻未被好好地加以利用。紫蘇中的氨基酸組成比較全面，種類達(dá)18種，除含硫氨基酸（蛋氨酸、胱氨酸）偏低外，其他氨基酸組成與其他植物沒有差別[2，3]。紫蘇作為一種新興的植物蛋白質(zhì)資源，研究其提取工藝是有效開發(fā)利用紫蘇蛋白質(zhì)的前提條件。試驗(yàn)以用石油醚脫脂后的紫蘇葉以及莖為原料，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)研究紫蘇蛋白質(zhì)提取的最佳提取工藝條件，充分利用了紫蘇中的蛋白質(zhì)，為進(jìn)一步開發(fā)利用紫蘇資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑 紫蘇由中華大藥房提供，蛋白質(zhì)含量為27.8%。牛血清白蛋白（BSA），95%的乙醇，85%的磷酸，考馬斯亮藍(lán)溶液，石油醚（分析純）、氫氧化鈉（分析純）、濃鹽酸等（分析純）。

1.1.2 儀器與設(shè)備 PHS-3C型數(shù)顯酸度計(jì)、TDL-40B臺(tái)式離心機(jī)、22型可見光分光光度計(jì)、SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)式真空泵、TDA溫度控制儀（恒溫水浴鍋）、電熱恒溫干燥箱、FA2104S電子分析天平、容量瓶等。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以牛血清白蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[4]。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：稱取0.25 g牛血清白蛋白溶于25 mL去離子水中，即為10 mg/mL的原液?？捡R斯亮藍(lán)G-250試劑：稱取100 mg考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，溶于50 mL 95%的乙醇中，加入85%的磷酸100 mL，最后用去離子水定容到1 000 mL。取7支試管，使蛋白質(zhì)濃度分別為0、1、2、4、6、8、10 mg/mL，向每支試管中加入5 mL考馬斯亮藍(lán)溶液，靜置2 min后測定各組蛋白質(zhì)溶液的吸光度，并記錄數(shù)據(jù)。

1.2.2 紫蘇葉分離蛋白的制取工藝 干紫蘇葉低溫冷凍研磨加石油醚脫脂濾渣自然風(fēng)干加堿浸提過濾、離心蛋白質(zhì)提取液酸沉水洗中和沉淀干燥粗蛋白[5]。

1.2.3 蛋白質(zhì)提取率的計(jì)算 蛋白質(zhì)提取率=分離的蛋白質(zhì)的質(zhì)量/原料的質(zhì)量×100%。

1.2.4 超聲波對紫蘇蛋白質(zhì)提取率的影響 在最佳工藝條件下，將裝有溶液的小燒杯放在100 W、50 ℃下超聲波清洗器中振蕩提取30 min，確定超聲波對紫蘇蛋白質(zhì)提取率的影響。

1.2.5 單因素試驗(yàn) ①堿提pH對紫蘇蛋白質(zhì)提取率的影響。準(zhǔn)確稱取1 g脫脂紫蘇葉，按1∶15（m/V，g∶mL）的料液比分別加入pH 7.0、8.0、9.0、10.0的氫氧化鈉溶液，在50 ℃條件下攪拌浸提30 min，后將溶液進(jìn)行抽濾得濾液，將濾液用1 mol/L的HCl溶液沉淀靜置30 min，再離心得粗蛋白，烘干后再稱量，考察最佳堿提pH對蛋白質(zhì)提取率的影響。②料液比對紫蘇蛋白質(zhì)提取率的影響。準(zhǔn)確稱取1 g脫脂紫蘇葉，分別按1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（m/V，g∶mL，下同）的料液比加入pH 9.0的氫氧化鈉溶液，在50 ℃條件下制備粗蛋白，獲得料液比對蛋白質(zhì)提取率的影響。③堿提溫度對紫蘇蛋白質(zhì)提取率的影響。準(zhǔn)確稱取1 g脫脂紫蘇葉，按1∶15的料液比加入pH 9.0的氫氧化鈉溶液，分別在堿提溫度為30、40、50、60 ℃的條件下制備粗蛋白，研究堿提溫度對蛋白質(zhì)提取率的影響。④酸沉pH對紫蘇蛋白質(zhì)提取率的影響。準(zhǔn)確稱取1 g脫脂紫蘇葉，按1∶15的料液比加入pH 9.0的氫氧化鈉溶液，在50 ℃條件下攪拌浸提30 min，在pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0的條件下制備粗蛋白，研究酸沉pH對蛋白質(zhì)提取率的影響。

1.2.6 正交試驗(yàn) 在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，以溶液中蛋白質(zhì)提取率作為衡量指標(biāo)，研究采用堿溶酸沉法提取紫蘇蛋白質(zhì)的最佳工藝條件，因素與水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

試驗(yàn)過程中在波長為595 nm下測得蛋白質(zhì)濃度與吸光度的關(guān)系見表2。依此繪制牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），得到標(biāo)準(zhǔn)方程為■=0.051 4x+0.055 9，r=0.990 4。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 堿提pH對紫蘇蛋白質(zhì)提取率的影響 由圖2可知，隨著pH的增加，蛋白質(zhì)提取率先增加。當(dāng)溶液的pH為9.0時(shí)，紫蘇葉分離蛋白質(zhì)的提取率為16.23%，達(dá)到最大。此后再增加提取液的pH，蛋白質(zhì)提取率降低。因此用堿溶酸沉法提取紫蘇蛋白質(zhì)的最佳堿提pH為9.0。

2.2.2 料液比對紫蘇蛋白質(zhì)提取率的影響 由圖3可知，隨著料液比的減小，蛋白質(zhì)提取率先增加后降低。合適的料液比可降低體系的黏度、增大濃度梯度、加快傳質(zhì)過程，因而提取率高；但料液比過低，紫蘇葉分離蛋白質(zhì)的提取率并沒有明顯增加，反而會(huì)增加后處理的負(fù)擔(dān)。因此用堿溶酸沉法提取紫蘇蛋白質(zhì)的最佳料液比為1∶15。

2.2.3 堿提溫度對紫蘇蛋白質(zhì)提取率的影響 由圖4可知，在一定的堿提溫度范圍內(nèi)，隨著堿提溫度升高，紫蘇蛋白質(zhì)的提取率也隨之升高，50 ℃時(shí)提取率最高，為16.22%，但是當(dāng)堿提溫度超過50 ℃，蛋白質(zhì)的提取率反而下降。因?yàn)閴A提溫度越高，越有利于蛋白質(zhì)的溶出，當(dāng)堿提溫度超過50 ℃，由于淀粉糊化作用反而會(huì)降低蛋白質(zhì)的提取率；另外，堿提溫度過高容易使蛋白質(zhì)發(fā)生變性，影響最終產(chǎn)品的特性。因此用堿溶酸沉法提取紫蘇蛋白質(zhì)的最佳堿提溫度為50 ℃。

2.2.4 酸沉pH對紫蘇蛋白質(zhì)提取率的影響 由圖5可知，酸沉階段紫蘇蛋白質(zhì)的提取率隨pH的增加呈先增大后減小的趨勢，在pH 5.0時(shí)提取率達(dá)到最大。蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在某一種pH的溶液中，它所帶的正電荷數(shù)與負(fù)電荷數(shù)恰好相等，即凈電荷數(shù)為零，此時(shí)蛋白質(zhì)間靜電荷排斥作用最低，蛋白質(zhì)聚集、沉淀，溶解度最低，從溶液中析出。因此用堿溶酸沉法提取紫蘇蛋白質(zhì)的最佳酸沉pH為5.0。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3可知，各因素對紫蘇蛋白質(zhì)提取率的影響主次為料液比>酸沉pH>堿提溫度>堿提pH，即在堿提過程中料液比影響最大，其次為酸沉pH和堿提溫度，堿提pH對提取率的影響最小。從試驗(yàn)結(jié)果來看，最優(yōu)組合為A1B1C1D1。綜合各因素的作用，得出適于本工藝的最佳浸提條件是堿提pH 8.0、堿提溫度40 ℃、料液比1∶10、酸沉pH 4.0。在上述條件下蛋白質(zhì)提取率可達(dá)到20.51%。

2.4 超聲波對蛋白質(zhì)提取率的影響

采用紫蘇葉分離蛋白質(zhì)的最佳提取工藝條件為堿提pH 8.0、堿提溫度40 ℃、料液比1∶10、酸沉pH 4.0，在浸提過程中增加100 W的超聲波振蕩提取，做兩組平行試驗(yàn)，紫蘇葉分離蛋白質(zhì)的提取率最高可達(dá)22.41%。超聲波的“空化效應(yīng)”增加了紫蘇蛋白質(zhì)的提取率；超聲波引起溶劑的機(jī)械振動(dòng)，可以加快熱傳遞，使溶劑受熱均勻，使溶質(zhì)整體受熱均勻，同時(shí)加快了溶質(zhì)分散，也加快了溶解。

3 結(jié)論

影響紫蘇中蛋白質(zhì)提取率的因素的影響程度由大到小依次是料液比、酸沉pH、堿提溫度、堿提pH。其中堿提溫度、料液比和酸沉pH對蛋白質(zhì)提取率影響顯著，堿提pH對紫蘇葉中蛋白質(zhì)的提取率影響不顯著。紫蘇葉蛋白質(zhì)的最佳提取條件是堿提pH 8.0、堿提溫度40 ℃、料液比1∶10、酸沉pH 4.0，在此條件下蛋白質(zhì)提取率可達(dá)到20.51%。在提取過程中添加100 W的超聲波處理會(huì)明顯增加蛋白質(zhì)的提取率，此條件下紫蘇蛋白質(zhì)的提取率可達(dá)到22.41%。

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篇9

[關(guān)鍵詞]脫氧土大黃苷；人血清白蛋白；光譜實(shí)驗(yàn)；分子模擬

血清白蛋白具有貯運(yùn)內(nèi)源代謝產(chǎn)物和外源藥物分子等重要生理功能[1]。血清白蛋白相對分子質(zhì)量較小，溶解性較大、穩(wěn)定性較好、與配體具有較好的親和性，易于分離、提純且其三級結(jié)構(gòu)已知，是理想的模型蛋白質(zhì)分子。人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）[2]為585個(gè)氨基酸殘基組成的單肽鏈蛋白質(zhì)，其氨基酸全序列含有35個(gè)半胱氨酸殘基，形成17對二硫鍵和一個(gè)自由的半胱氨酸殘基，二硫鍵中有8對組成交叉二硫鍵，只有接近N端的是單個(gè)二硫鍵。HSA含有18個(gè)酪氨酸殘基，在214位上含有一個(gè)色氨酸殘基，N端為天冬氨酸殘基，C端為亮氨酸殘基。分析生理?xiàng)l件下藥物與HSA的相互作用可以獲得藥物的藥效學(xué)信息，深入闡明藥物輸送機(jī)制，也有助于為藥物分析提供理論參考，此是具有意義的工作。

脫氧土大黃苷（desoxyrhaponticin，DES），分子式為C21H24O8，是天山大黃的有效成分之一，具有降血脂、降血糖、抗腫瘤、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)、抗血栓和抗氧化等作用[3]。當(dāng)前，脫氧土大黃苷與人血清白蛋白的相互作用研究未見文獻(xiàn)報(bào)道。本文基于光譜法結(jié)合分子模擬技術(shù)研究了DES結(jié)合HSA的相互作用，獲得了結(jié)合反應(yīng)常數(shù)、熱力學(xué)函數(shù)等并考察了藥物對蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響，從分子水平上闡釋DES與HSA的相互作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 人血清白蛋白（HSA， ≥98%）、脫氧土大黃苷（DES， ≥98%）、三羥甲基氨基甲烷 （Tris， GR）均購于上海華美生物工程公司；其他試劑均為分析純試劑，實(shí)驗(yàn)用水為亞沸蒸餾去離子水。配制濃度為0.1 mol?L-1，pH 7.4的Tris-HCl緩沖溶液（內(nèi)含0.10 mol?L-1NaCl維持離子強(qiáng)度），用此緩沖溶液配制1.0×10-5 mol?L-1的HSA，乙醇溶液配制1.0×10-3 mol?L-1 DES溶液。

F-4500型熒光光度計(jì)（日本Hitachi公司）；UV-2450型紫外-可見分光光度計(jì)（日本Shimadzu公司）；ZD-2型精密酸度計(jì)（上海雷磁儀器廠）；SGI O2計(jì)算機(jī)圖形工作站，DOCK軟件（4.02版本）。

1.2 分子模擬 利用SGI O2工作站上的DOCK 4.02程序包建立藥物與蛋白質(zhì)相互作用模型，進(jìn)行分子模擬計(jì)算。HSA晶體結(jié)構(gòu)的PDB代碼：1h9z。ChemDraw工具構(gòu)建DES分子結(jié)構(gòu)，然后基于分子力學(xué)MM2力場優(yōu)化后生成實(shí)驗(yàn)分子模型，分子對接預(yù)處理時(shí)使用AutoDock Toolkit（ADT）進(jìn)行受體與配體的優(yōu)化處理。分子對接技術(shù)確認(rèn)HSA活性部位，選擇配體為中心的10范圍為對接的活性中心。確定活性部位步驟：①確定DES結(jié)合活性位點(diǎn)；②在配體結(jié)合位點(diǎn)填充球簇以映射受體結(jié)合腔穴的性質(zhì)；③嘗試匹配不同小球中心的距離和配體中不同原子的距離，進(jìn)行配體在受體活性位點(diǎn)處的構(gòu)象搜索；④以經(jīng)驗(yàn)勢能函數(shù)作為評價(jià)函數(shù)，找到配體與受體的最佳結(jié)合方式[4]。程序的打分函數(shù)選擇程序默認(rèn)的輸入和退火參數(shù)。針對建立的HSA-DES分子對接體系進(jìn)行re-dock驗(yàn)證，去除DES后重新對接生成新的HSA-RWF（R-warfine）分子對接體系并比對PDB庫數(shù)據(jù)中原對接體系以確證可靠性。

1.3 方法 HSA與DES溶液的熒光光譜及DES溶液的吸收光譜測定：移取2.5 mL HSA溶液于1 cm石英比色皿中，微量進(jìn)樣器逐次加入1.0×10-3 mol?L-1DES溶液進(jìn)行熒光滴定（滴定劑累加體積≤100 μL），緩沖溶液做熒光空白校正，熒光發(fā)射與激發(fā)狹縫寬度均為2.5 nm，波長掃速1 200 nm?min-1，固定激發(fā)波長282 nm，室溫下繪制250～900 nm的發(fā)射譜；熒光光譜儀掃描激發(fā)波長和發(fā)射波長之間的波長差分別為Δλ 15 nm和Δλ 60 nm上述溶液體系的同步熒光光譜。發(fā)射與激發(fā)狹縫寬度同上，掃速240 nm?min-1，Tris-HCl緩沖溶液做熒光空白校正。移取2.5 mL Tris-HCl緩沖溶液于1 cm石英比色皿中，微量進(jìn)樣器加入1.0×10-3 mol?L-1 DES溶液，使其濃度為1.0×10-5 mol?L-1，測定500～190 nm紫外吸收光譜，中速掃描，狹縫寬度2.5 nm，緩沖溶液定基線。

1.4 理論基礎(chǔ) 蛋白質(zhì)-藥物相互作用的熒光猝滅機(jī)制：蛋白質(zhì)-藥物相互作用的動(dòng)態(tài)熒光猝滅過程遵循Stern-Volmer方程[5]。

F0/F=1+Kqτ0[D]=1+KSV[D]（1）

式中：Kq為雙分子猝滅過程速率常數(shù)，τ0為猝滅劑不存在時(shí)生物大分子的平均壽命，[D]為猝滅劑（DES）的濃度，Ksv為Stern-Volmer猝滅常數(shù)。

蛋白質(zhì)-藥物相互作用的理論方程：藥物-蛋白質(zhì)相互作用采用方程（2）獲得相應(yīng)的結(jié)合參數(shù)[6]。

lg[（F0-F）/F]=lgK+nlg[Df]（2）

F0與F分別為猝滅劑加入前后熒光分子的相對強(qiáng)度，K是結(jié)合常數(shù)，n是結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，[Df]為猝滅劑的游離濃度。

Fōrster非輻射能量轉(zhuǎn)移理論：Fōrster非輻射能量轉(zhuǎn)移理論[7]求算藥物-蛋白質(zhì)能量轉(zhuǎn)移效率E，結(jié)合距離r及臨界能量轉(zhuǎn)移距離R0方程如下。

E=R06/（R06+r6）（3）

E為能量轉(zhuǎn)移效率；R0為能量轉(zhuǎn)移效率E為50%時(shí)的臨界能量距離。

R06=8.8×10-25K2N-4ΦJ（4）

式中：K2為偶極空間取向因子；N為介質(zhì)的折射指數(shù)；Φ為蛋白質(zhì)分子的光量子效率；J為蛋白質(zhì)分子熒光發(fā)射光譜與藥物吸收光譜間的光譜重疊積分。

2 結(jié)果與討論

2.1 分子模擬結(jié)果 分子對接模擬計(jì)算時(shí)，考慮HSA的Sudlow′s sites I，sites II[9]，6個(gè)脂肪酸結(jié)合位點(diǎn)及warfarin結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行DES分子對接的模擬計(jì)算，分子對接通過參數(shù)的對比來尋找藥物分子的最優(yōu)結(jié)合位點(diǎn)與模式。分子對接DES與HSA的結(jié)合模型見圖1 （顯示配體周圍10.0范圍內(nèi)的氨基酸殘基）。DES分子結(jié)合在HSA的表面活性口袋處，整個(gè)分子處于被包圍狀態(tài)。DES分子距HSA色氨酸殘基（Trp214）及苯丙氨酸殘基（Phe206，Phe211，Phe330）很近，這很好解釋了DES能夠猝滅HSA內(nèi)源熒光的現(xiàn)象。同時(shí)，DES分子與HSA結(jié)合過程中，DES分子中苯環(huán)上羥基的氧原子與Leu481發(fā)生氫鍵相互作用，且DES環(huán)氧環(huán)上23號位和25號位羥基的氧原子分別與Lys199，Ser202發(fā)生氫鍵相互作用；另一方面，DES非共價(jià)結(jié)合在HSA活性位點(diǎn)域，其結(jié)合口袋周圍主要由Leu198，Leu203，Leu327，Leu331，Leu347，Leu349，Leu481，Ala201，Ala210，Ala213，Ala215，Phe206，Phe211，Phe330，Trp214，Val343，Val344，Val482氨基酸殘基形成一個(gè)疏水區(qū)域，可以清楚觀察到DES結(jié)合位點(diǎn)處的疏水相互作用，即疏水作用在DES-HSA復(fù)合物形成中起重要作用，疏水作用是藥物和蛋白質(zhì)分子結(jié)合的主要驅(qū)動(dòng)力。分子模擬結(jié)果進(jìn)行re-dock驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)AutoDock對此體系可靠。

由分子模擬結(jié)果可知DES與HSA的主要作用力為疏水作用力，兼有氫鍵的存在，為驗(yàn)證DES與HSA的鍵合機(jī)制和鍵合方式，通過光譜實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)分子模擬的合理性。

2.2 HSA與DES相互作用的熒光光譜及結(jié)合反應(yīng)機(jī)制 HAS，DES及二者以等物質(zhì)的量混合體系的熒光光譜見圖2。在282 nm激發(fā)波長下，DES的最大發(fā)射波長為 393 nm左右，HSA最大發(fā)射波長為339 nm，而由DES-HSA體系的熒光光譜可以看出，藥物的加入使HSA的熒光強(qiáng)度降低，表明藥物與HSA之間存在著相互作用，發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移。

DES-HSA的紫外吸收差譜見圖3，可以發(fā)現(xiàn)HSA的紫外吸收曲線及DES-HSA等摩爾混合物與DES的差譜幾乎完全重合，表明DES的加入并未使HSA的紫外吸收發(fā)生變化，可以初步確定DES與HSA分子的熒光猝滅機(jī)制為動(dòng)態(tài)猝滅。同時(shí)由圖3可見，DES在282 nm激發(fā)波長及339 nm發(fā)射波長下沒有吸收，因此，可不考慮內(nèi)濾光效應(yīng)。

分析圖4可知，a峰為HSA的一級熒光峰，可以看出隨著藥物的加入，a峰逐漸降低；b峰為DES的一級熒光發(fā)射峰；c峰為激發(fā)峰的二級倍頻熒光峰；d峰為HSA的二級倍頻熒光峰。固定HSA濃度，隨著藥物濃度增大，HSA的熒光強(qiáng)度呈規(guī)律性的降低，這表明藥物對血清白蛋白有猝滅作用。熒光最大發(fā)射峰位置出現(xiàn)20 nm的紅移（A，B兩圖均如此），說明DES和HSA確實(shí)存在相互作用，造成HSA分子中與DES相互作用的氨基酸殘基的微區(qū)環(huán)境發(fā)生一定變化。

為確定藥物對蛋白質(zhì)熒光的猝滅機(jī)制，由實(shí)驗(yàn)測得DES與HSA相互作用的熒光光譜數(shù)據(jù)，按方程（1）處理可得圖5。

由于無猝滅劑時(shí)生物大分子的平均熒光壽命τ0=1×10-8 s[10]，則由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以通過Stern-Volmer方程計(jì)算不同溫度下DES-HSA相互作用的猝滅常數(shù)Ksv，Kq，計(jì)算結(jié)果見表1。

目前生物大分子與活性小分子相互作用研究中，常用2種方法判定熒光猝滅機(jī)制，一種方法是比較雙分子猝滅過程速率常數(shù)與猝滅劑對生物大分子最大擴(kuò)散碰撞猝滅速率常數(shù)來間接判斷[11]；另一種方法是通過變溫實(shí)驗(yàn)直接推斷[12]。本實(shí)驗(yàn)為確定DES對HSA的猝滅機(jī)制，在不同溫度下作DES對HSA熒光猝滅的Stern-Volmer圖見圖5。從圖5可見，在選定的濃度范圍內(nèi)，隨著溫度升高，猝滅常數(shù)呈增大趨勢，初步表明DES對HSA的猝滅機(jī)制為動(dòng)態(tài)猝滅。另外，判斷靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅的另一個(gè)方法是考察熒光物質(zhì)的吸收光譜。靜態(tài)猝滅中，基態(tài)配合物的形成會(huì)引起熒光物質(zhì)的吸收光譜不斷變化，而動(dòng)態(tài)猝滅僅僅影響熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)，不影響熒光物質(zhì)的吸收光譜，據(jù)此可判斷該體系是否屬于動(dòng)態(tài)猝滅[13]?？疾霥ES-HSA體系的吸收光譜（圖3），發(fā)現(xiàn)HSA的紫外吸收譜和DES-HSA混合物的紫外吸收譜與DES紫外吸收差譜幾乎完全重合，表明藥物的加入并未使HSA的紫外吸收發(fā)生變化，由此2個(gè)結(jié)果可以確定DES與HSA的熒光猝滅機(jī)制為動(dòng)態(tài)猝滅。

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Molecular action mechanism of desoxyrhaponticin and serum albumin

characterized by spectroscopy combined with molecular modelling

GUO Ming*， FAN Wen-xiang， HU Run-huai

（School of Science， Zhejiang Agriculture & Forestry University， Lin′an 311300， China）

[Abstract] Objective： To study the molecular action mechanism of active constituents desoxyrhaponticin （DES） and human serum albumin （HSA）. Method： Under the simulated physiological condition， computer analog technology， fluorescent spectrometry and ultraviolet spectrum were combined to study the binding mechanism between drug and protein. Result： Molecular modeling was adopted to establish the binding model between DES and HSA， suggesting that the interaction force maintaining drug and protein is mainly the hydrophobic interaction with a hydrogen-bond interaction. The results from spectroscopy indicated that the interaction between DES and HSA is a dynamic binding process with a high intensity. The value of the binding distance （r） between DES and HSA was low， which demonstrate the occurrence of energy transfer. DES made an impact on HSA′ structural domain microcell conformation， which resulted in hydrophobic changes in binding areas. According to the fluorescent phase diagram technical analysis， the changes in the DES-HSA reaction conformational pattern showed a "two-state" model. According to the obtained thermodynamic parameters for the DES-HSA interaction， the interactional force between DES and HSA was mainly a hydrophobic interaction. The fluorescence polarization proved that a non-covalent compound was generated during the interaction between DES and HSA. Conclusion： The spectrum experiment showed consistent results with the computer analog technology， which could provided certain reference for studies on the interaction between DES and HSA.

篇10

【關(guān)鍵詞】 小牛血清去蛋白注射液； 神經(jīng)節(jié)苷脂； 新生兒缺氧缺血性腦病

Clinical Therapeutic Effect of Deproteinised Calf Blood Injection and Ganglioside in Treatment of Neonatal Hypoxic Ischemicencephalopathy/CAI Li-jun.//Medical Innovation of China，2013，10（14）：003-005

【Abstract】 Objective：To compare the therapeutic effect of deproteinised calf blood injection and ganglioside in the treatment of neonatal hypoxic ischemic encephalopathy （NHIE）.Method：90 cases of NHIE newborns were divided randomly into three groups：the C group was treated routinely with only support， sedation and lowering intracranial pressure.The A group was treaded additionally with ganglioside and support sedation and lowering intracranial pressure.The B group was treated additionally with deproteinised calf blood injection and support sedation and lowering intracranial pressure. Objective NBNA and statistics treat.Result：The effect of the A and B group was significantly better than that of the C group （P0.05） between A group and B group.Conclusion：Both of deproteinised calf blood injection and ganglioside had good therapeutic effect on NHIE； and The therapeutic effect of deproteinised calf blood injection and ganglioside are equal.

【Key words】 Deproteinised calf blood injection； Ganglioside； Hypoxic ischemic encephalopathy

First-author’s address： Shizhongqu People’s Hospital， Zaozhuang 277100， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2013.14.002

新生兒缺氧缺血性腦病是由于產(chǎn)前、產(chǎn)時(shí)或產(chǎn)后的各種缺氧缺血原因?qū)е碌哪X損傷，部分留有一定的后遺癥，是新生兒致殘的主要原因之一[1]。經(jīng)過多年來的實(shí)踐發(fā)現(xiàn)神經(jīng)節(jié)苷脂對HIE的療效肯定，廣大同仁已達(dá)成共識(shí)，但其價(jià)格昂貴，廣大農(nóng)民經(jīng)濟(jì)承受能力有限，因此尋找療效好、價(jià)格低廉的腦細(xì)胞營養(yǎng)藥物實(shí)有必要。本科2008年10月-2012年10月應(yīng)用小牛血清去蛋白注射液（錦州奧鴻藥業(yè)有限責(zé)任公司）或單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂（黑龍江哈爾濱醫(yī)大藥業(yè)有限公司）治療新生兒缺氧缺血性腦病，對比其療效，發(fā)現(xiàn)兩種藥物療效相當(dāng)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 病例選擇標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)中華兒科學(xué)會(huì)新生兒學(xué)組1996年10月制訂的《新生兒缺氧缺血性腦病診斷依據(jù)和臨床分度》[2]，選擇本科及協(xié)作科室2008年10月-2012年10月收治的新生兒缺氧缺血腦病患兒90例，其中男51例，女39例，年齡30 min～7 d，其中小于胎齡兒7例，2.5～4.0 kg

之間的43例，巨大兒17例；均有宮內(nèi)窘迫及產(chǎn)時(shí)窒息史，生后均有不同程度的腦損害癥狀，出現(xiàn)異常神經(jīng)精神癥狀，包括意識(shí)障礙、抽搐、肌張力改變及原始反射異常，呼吸不規(guī)則或暫停，不吃、不哭、不動(dòng)、噴射性嘔吐等。90例均行頭顱CT或頭顱MRI掃描檢查：輕度HIE 66例， 中-重度24例。其中合并顱內(nèi)出血13例（蛛網(wǎng)膜下腔出血9例， 腦室出血4例）。早產(chǎn)兒除外。均排除先天畸形和產(chǎn)傷引起的顱內(nèi)出血。把上述90例患兒按簡單隨機(jī)抽樣法分為神經(jīng)節(jié)苷脂組（A組）、小牛血清去蛋白注射液組（B組）、對照組（C組）。其中A、B、C三組輕度HIE病例 均為22例，中-重度病例均為8例；其病情及一般情況比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

表1 三組病情比較 例

組別 抽搐 意識(shí)障礙 呼吸節(jié)律改變 肌張力改變

A組（n=30） 6 7 5 30

B組（n=30） 7 6 6 30

C組（n=30） 6 7 6 30

1.2 治療方法 三組均采用新生兒缺氧缺血腦病的綜合治療方案，主要包括：（1）控制腦水腫，入院后3 d內(nèi)嚴(yán)格限制液體的入量50～60 ml/（kg?d），同時(shí)給呋塞米0.5～1 mg/kg，地塞米松0.2～0.5 mg/kg，甘露醇0.25～0.5 g/（kg?次），每6小時(shí)一次或每8小時(shí)一次，合并顱內(nèi)出血者給予白蛋白1 g/kg。（2）控制驚厥：苯巴比妥鈉靜注或水合氯醛保留灌腸。（3）維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，包括血?dú)夂蚿H穩(wěn)定，維持重要組織器官的血液灌注，維持電解質(zhì)及血糖在正常范圍內(nèi)，及時(shí)糾正酸中毒。于生后48 h后A組給予神經(jīng)節(jié)苷脂20 mg/d加入5%葡萄糖注射液20 ml靜脈點(diǎn)滴，1次/d；B組予小牛血清去蛋白注射液5 ml加入5%葡萄糖注射液20ml靜脈點(diǎn)滴，1次/d；C組僅給予常規(guī)綜合治療。10～14 d為1個(gè)療程。

1.3 療效判斷 所有患兒均采用新生兒神經(jīng)行為測定評分，分別于用藥前、3 d、7 d按照20項(xiàng)新生兒行為評分法（NBNA評分）進(jìn)行檢查（從睡眠開始，10 min結(jié)束）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料比較采用u檢驗(yàn)，P

2 結(jié)果

各組治療前、3 d、7 d的神經(jīng)行為測定評分見表2。

結(jié)果顯示：（1）治療前C組與B組NBNA評分比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；治療3 d、7 d，兩組輕度病例NBNA評分比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；（2）治療前C組與A組NBNA評分比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；治療3 d、7 d，兩組輕度病例NBNA評分比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），說明兩者對新生兒缺氧缺血性腦病治療均有效。

3 討論

新生兒缺氧缺血性腦?。℉IE）系因臍帶異常、妊娠期高血壓疾病、胎盤異常、生后窒息等產(chǎn)前、產(chǎn)時(shí)原因，導(dǎo)致腦組織損傷而出現(xiàn)的綜合征，常表現(xiàn)為興奮激惹，如尖叫、嘔吐、抽搐等，轉(zhuǎn)為抑制甚至昏迷；有的表現(xiàn)為吸吮、吞咽和舌運(yùn)動(dòng)障礙；或不自主嘴嚼、呵欠等不典型癥狀[3]。其機(jī)理主要由缺氧缺血損害與再灌注損傷等共同引起：缺血缺氧期，腦組織含氧量減少；再灌注恢復(fù)腦組織氧供應(yīng)，使氧自由基在短時(shí)間內(nèi)爆發(fā)性增多，氧自由基與各種細(xì)胞成分發(fā)生反應(yīng)，造成腦細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷和功能代謝障礙。

小牛血清去蛋白注射液具有保護(hù)大腦神經(jīng)、減輕腦缺氧再灌注損傷、改善腦供氧和能量供應(yīng)、清除自由基、促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)等作用[4]。其作用機(jī)制有以下幾點(diǎn)：（1）小牛血清去蛋白注射液能夠提高缺氧誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞活力，小牛血清去蛋白注射液主要成分為磷酸肌醇寡糖（IPOS）和小分子激活肽。藥理研究表明：小分子激活肽是神經(jīng)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的主要成分，通過激活細(xì)胞代謝S6激活酶的活性，促進(jìn)缺氧狀態(tài)下神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)和再生[5]。（2）另外一個(gè)成分磷酸肌醇寡糖能夠激活葡萄糖載體，從而促進(jìn)葡萄糖向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，并且通過特殊的IPOS載體使得IPOS也可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，糾正能量代謝障礙；可以增加線粒體的呼吸能力和高能磷酸的合成，從而促進(jìn)細(xì)胞對氧的利用，促進(jìn)能量物質(zhì)ATP的生成[5]。保護(hù)神經(jīng)元正常的生理功能。同時(shí)它能使神經(jīng)細(xì)胞由無氧代謝糖酵解的代謝途徑轉(zhuǎn)變?yōu)樘怯醒跹趸耐緩?，糾正缺血神經(jīng)細(xì)胞的酸中毒，增強(qiáng)腦代謝的儲(chǔ)備能力，延長細(xì)胞的生存時(shí)間。（3）小牛血清去蛋白還可以減輕腦缺血后再灌注損傷。其機(jī)制為通過抑制一氧化氮合成酶的活性，從而降低NO的過多形成，進(jìn)而延遲腦缺血后的細(xì)胞毒性水腫，延緩腦缺血損傷的進(jìn)程[6]。有試驗(yàn)表明：小牛血清去蛋白能夠顯著減少大腦皮層含水量，使氧自由基破壞反應(yīng)的產(chǎn)物丙二醛顯著減少[7]，說明小牛血清去蛋白注射液不僅能夠使缺氧狀態(tài)下神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)和再生，糾正缺血神經(jīng)細(xì)胞的酸中毒，增強(qiáng)腦代謝的儲(chǔ)備能力，延長細(xì)胞的生存時(shí)間；而且能夠減少氧自由基的生成，延緩腦缺血損傷的進(jìn)程，對缺氧缺血性腦病有確切的治療作用。

而神經(jīng)節(jié)苷脂作為神經(jīng)損傷修復(fù)藥，機(jī)理為：可以保護(hù)細(xì)胞膜完整性，穩(wěn)定各種酶的活性；防止細(xì)胞凋亡，維持細(xì)胞內(nèi)外離子平衡、防止細(xì)胞內(nèi)鈣積聚，增強(qiáng)抗氧化酶的活性，降低脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，消除自由基對細(xì)胞膜的損害等[8]?？纱龠M(jìn)由于各種原因引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后神經(jīng)功能的再生及修復(fù)，從而達(dá)到治療目的。其對缺氧缺血性腦病的治療作用已被廣大同仁認(rèn)可。

總之，本研究表明，小牛血清去蛋白注射液與神經(jīng)節(jié)苷脂對輕度缺氧缺血性腦病均有治療作用，與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道相符；而兩者對中-重度HIE療效均較差，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而價(jià)格低廉小牛血清去蛋白注射液對應(yīng)用神經(jīng)節(jié)苷脂過敏、或在廣大基層更有優(yōu)勢，具有更高的性價(jià)比，易為廣大家長接受。經(jīng)1～3年的隨訪，4例死亡、6例失訪，輕度HIE患兒中未發(fā)現(xiàn)有明顯后遺癥；中度HIE患兒中僅2例遺留有腦癱，存活重度HIE小兒中4例留有不同程度的后遺癥如癲癇、腦癱、多動(dòng)癥等。因而繼續(xù)尋找更有效藥物，提高患兒的生活質(zhì)量、降低致殘率仍是廣大同仁的共同目標(biāo)。

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